Ultrasone peptidesynthese met behulp van de TAGGING-techniek

Peptidesynthese vormt een hoeksteen van farmaceutisch onderzoek en ontwikkeling, maar conventionele methoden – peptidesynthese in vaste fase (SPPS) en klassieke koppeling in oplossing – blijven arbeidsintensief, verspillen veel reagentia en zijn moeilijk op te schalen. Er is een efficiënter alternatief ontstaan door de combinatie van twee orthogonale strategieën: de TAGGING-techniek (temporary anchoring group) voor de assemblage van peptiden in de oplossingsfase en ultrasone (sonochemische) verwerking om de koppelings-, deprotectie- en opwerkingsstappen te versnellen. Samen maken deze strategieën de productie van therapeutische peptiden op gram- tot bulkschaal mogelijk. – zoals het antibioticum/kankerbestrijdende lipopeptide lipobactine – met een hoge zuiverheidsgraad, minder zuiveringswerk en aanzienlijk minder handmatige handelingen.

Welke voordelen biedt ultrasone peptidesynthese?

• Economie van de oplossingsfase: Bij reacties in oplossing is het aminozuurverbruik aanzienlijk lager dan bij peptide-synthese in vaste fase
• Zuivering door middel van filtratie: Het aan TAG gebonden peptide slaat neer in polaire oplosmiddelen, waardoor tussenproducten door eenvoudige filtratie kunnen worden geïsoleerd – Er is geen kolomchromatografie of karakterisering per stap nodig.
• Enorme besparingen op arbeidskosten: Door tussentijdse zuiveringen en spectroscopische controles over te slaan, worden tijdens een volledige synthesecampagne aanzienlijk veel manuren bespaard.
• Sonochemische versnelling: Ultrasoonbehandeling verkort elke cruciale stap – Fmoc-ontbescherming, koppeling van zijketens, cyclisatie en globale ontbescherming – zonder dat dit ten koste gaat van de selectiviteit.
• Hoge opbrengsten, hoge zuiverheid: Zowel de koppeling van de afzonderlijke fragmenten als de uiteindelijke assemblage van lipobactine verlopen met een hoge opbrengst; na de algemene deprotectie wordt het doelproduct verkregen met een opbrengst van circa 83 %.
• Paraatheid op grote schaal: De TAGGING-techniek wordt expliciet beschreven als een methode waarmee peptiden op grote schaal met de hoogst mogelijke zuiverheid kunnen worden bereid, waardoor het een praktische manier is om therapeutisch belangrijke lipopeptiden in hoeveelheden van grammen en kilogrammen te produceren.
• Volledige compatibiliteit van methoden: Deze aanpak is volledig compatibel met conventionele SPPS- en oplossingsfase-chemie, zodat bestaande strategieën voor beschermgroepen (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) en koppelingsmiddelen (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) ongewijzigd kunnen worden toegepast.

Wat is de TAGGING-techniek?

Bij de TAG-methode wordt een peptidefragment covalent verankerd aan een verwijderbare, harsachtige ankergroep (TAG) die in oplossing blijft. Hierdoor kan de groeiende keten worden behandeld als een peptide in vaste fase, maar dan in de vloeibare fase:

• Na elke koppeling of ontbescherming wordt het aan TAG gebonden peptide in vaste vorm teruggewonnen door middel van eenvoudige filtratie of neerslag in polaire/antisolventmedia, terwijl oplosbare onzuiverheden en bijproducten worden weggewassen.
• Omdat het peptide aan de linker blijft zitten, zijn kolomchromatografie en een volledige karakterisering van elk tussenproduct grotendeels overbodig, wat een aanzienlijke besparing oplevert in tijd en mankracht.
• De reacties kunnen in de oplossingsfase worden uitgevoerd, waarbij veel minder aminozuren nodig zijn dan bij SPPS, en het eindproduct komt vrij door afsplitsing van de TAG-groep tegen het einde van de synthese.

 
Voor lipobactine werden bij de retrosynthese drie fragmenten gebruikt – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH en het lipidefragment C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – in combinatie met een strategie voor fragmentcondensatie om het lange peptide met zeer hoge opbrengsten te verkrijgen. (zie Ramya et al., 2025)

De TAG-ondersteunde volledige synthese van het peptide lipobactine wordt versneld door ultrasone behandeling.
(Onderzoek: Ramya e.a., 2025)

Hoe ultrasone behandeling de synthese van peptiden in oplossing verbetert

Ultrasone behandeling wordt gebruikt om de belangrijkste stappen in de oplossingsfase te intensiveren en te verkorten. Bij de synthese van lipobactine, zoals beschreven door Ramya et al. (2025), wordt ultrasone behandeling toegepast om:

Aangezien de TAG-chemie de tussenproducten al in de vorm van filtreerbare vaste stoffen oplevert, vullen ultrasone behandeling en TAGGING elkaar aan: ultrasone trillingen versnellen de massaoverdracht, het mengen en de reactiekinetiek, terwijl het anker ervoor zorgt dat het peptide als terugwinbare vaste stof blijft bestaan, wat een schone, chromatografisch lichte werkstroom oplevert.

Eenvoudige opschaling van zeer zuivere peptiden met behulp van ultrasone trillingen

Een veelvoorkomende uitdaging bij het opschalen van peptide- en peptide-geneesmiddelprocessen van het laboratorium naar de productie is het behoud van het sonochemische effect bij grotere volumes en een continue doorstroming. Hielscher biedt hiervoor een oplossing met een compleet assortiment ultrasone verwerkers, van laboratorium- tot volledige industriële schaal, die gevalideerd, reproduceerbaar vermogen en gedocumenteerde procescontrole bieden.
 

Industriële ultrasone apparatuur UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) voor ultrasoon-ondersteunde peptidesynthese

Literatuur / Referenties