Opschaling van peptidesynthese: ultrasone strategieën voor batch- en continue productie
Bij peptide-synthese met behulp van ultrasone trillingen wordt de beproefde peptidechemie gecombineerd met mechanische energie op hoge frequentie om reactie- en transportprocessen te versnellen. Akoestische cavitatie – de vorming en het uiteenvallen van microscopische bellen – zorgt voor intense lokale vermenging, microstralen en schuifkrachten. Bij de peptidesynthese zorgen deze effecten voor een verbetering van het transport van reagentia, de bevochtiging van de hars, de oplossing en het uiteenvallen van aggregaten. Laagfrequente ultrasone trillingen fungeren daarom in de eerste plaats als een middel om het proces te intensiveren: ze vervangen de koppelingschemie niet, maar kunnen het koppelen, het verwijderen van beschermgroepen, het wassen, het splitsen en de nabewerking aanzienlijk sneller en efficiënter maken.
De uitdaging van het opschalen van de peptideproductie
Het opschalen van de peptideproductie van het laboratorium naar de industriële productie vormt een uitdaging, omdat kleine inefficiënties zich tijdens de vele koppelings- en deprotectiecycli opstapelen, waardoor de opbrengst daalt en het gehalte aan moeilijk te verwijderen onzuiverheden toeneemt. Grotere reactoren brengen bovendien beperkingen met zich mee op het gebied van menging, warmteoverdracht, het zwellen van de hars en het transport van reagentia, terwijl het verbruik van oplosmiddelen, de zuiveringsvereisten en de productiekosten sterk stijgen. Een succesvolle opschaling moet daarom de uniformiteit van de reactie en de productkwaliteit waarborgen en tegelijkertijd zorgen voor een reproduceerbare doorvoer, efficiënt gebruik van hulpbronnen en nauwkeurige regeling van alle kritieke procesparameters.
Farmaceutische batch met sonicator UIP2000hdT voor een verbeterde peptidesynthese
Strategieën voor peptidesynthese met behulp van ultrasone behandeling
Ultrasone peptide-synthese in vaste fase
Fmoc-peptidesynthese in vaste fase (SPPS) is de meest uitgebreid bestudeerde ultrasone strategie. Ultrasone behandeling bevordert de penetratie van deprotectie- en koppelingsreagentia in gezwollen polymeerkorrels en vermindert tegelijkertijd stilstaande grenslagen rond de hars. Het kan ook aggregatie op de hars verstoren, een belangrijke oorzaak van onvolledige omzetting in hydrofobe en andere “moeilijk” reeksen.
Experimentele studies hebben aangetoond dat met behulp van ultrasone trillingen biologisch actieve peptiden met maar liefst 44 residuen kunnen worden gesynthetiseerd, met een lager materiaalverbruik en kortere reactietijden, zonder dat onder de gerapporteerde omstandigheden een toename van de belangrijkste nevenreacties werd waargenomen. (zie Merlino et al., 2019)
Een ander onderzoek meldde een vier- tot veertienvoudige verkorting van de assemblagetijd voor bepaalde peptiden; een 25-mer met een hoog gehalte aan hydrofobe residuen werd in 347 minuten geassembleerd. (zie Silva et al., 2021)
Echografie kan worden toegepast tijdens:
- Zetting van hars en uitwisseling van reagentia
- Fmoc- of Boc-deprotectie
- Activering en koppeling van aminozuren
- Tussentijdse wasbeurt
- Cyclisatie op hars
- Afscheiding van het voltooide peptide van de drager
Synthese in vloeibare fase en met behulp van tags
Echografie kan ook de conventionele peptide-synthese in vloeibare fase versterken door het oplossen, de verspreiding van reagentia en de massaoverdracht in heterogene of viskeuze mengsels te versnellen. Het voordeel hiervan is over het algemeen het grootst wanneer het proces wordt beperkt door menging of transport; bij een volledig homogene reactie die uitsluitend wordt bepaald door de intrinsieke chemische kinetica, kan de verbetering kleiner uitvallen.
Bij tag-geassisteerde peptidesynthese wordt het groeiende peptide gekoppeld aan een oplosbaar of neerslagbaar organisch anker. De reacties vinden plaats in oplossing, waarna het gemerkte tussenproduct wordt teruggewonnen door neerslag of filtratie. Ultrasone behandeling kan de koppeling, ontbescherming, cyclisatie en afsplitsing van de tag versnellen, terwijl slecht oplosbare tussenproducten in een gedispergeerde toestand worden gehouden.
| Techniek | Hoe ultrasone behandeling dit bevordert | Belang en beperkingen |
|---|---|---|
| Fmoc-peptidesynthese in vaste fase | Ultrasone behandeling versnelt de penetratie van piperidine en de verwijdering van Fmoc-producten; verbetert het transport van geactiveerde aminozuren naar de gezwollen hars; verstoort de aggregatie op de hars | Het sterkste bewijs en doorgaans het grootste voordeel |
| Boc-vastfasesynthese | Ultrasone behandeling verbetert de zuurpenetratie, de uitwisseling van reagentia, de koppeling en het wassen, net zoals bij Fmoc-chemie | Bij het opslaan en verwarmen van zuren is voorzichtigheid geboden |
| Synthese in oplossing/vloeibare fase | Ultrasone behandeling bevordert de oplosbaarheid van beschermde aminozuren, verspreidt neerslagen en vergroot het contactoppervlak bij bifasische reacties of reacties met een slurry | Het voordeel is kleiner wanneer de reactie al homogeen is en chemisch snelheidsbeperkt |
| Synthese op basis van een oplosbare tag of precipitatie | Door ultrasone behandeling blijven gemerkte tussenproducten tijdens de koppeling gedispergeerd en kan de oplosbaarheid vóór filtratie of neerslag worden verbeterd | Handig voor slecht oplosbare stoffen of bulkpreparaten; ultrasone trillingen vergemakkelijken vooral de verwerking en de massaoverdracht |
| Stroom- of continue synthese | Ultrasoonbehandeling helpt het contact tussen hars en vloeistof in stand te houden en plaatselijke stilstaande zones of aggregatie te voorkomen | Opschaling met een flowcelontwerp voor een gelijkmatige blootstelling aan ultrageluid |
| Fragmentligatie en cyclisatie | Door middel van ultrasone behandeling kunnen hydrofobe fragmenten oplosbaar worden gemaakt, aggregaten worden afgebroken en het intermoleculaire contact worden verbeterd | Dit versnelt niet per definitie elke natuurlijke chemische ligatie of macrocyclisatie; overmatige verdunning of intermoleculaire aggregatie kunnen de overhand blijven hebben |
| Enzymatische peptidesynthese | Bij de juiste intensiteit kan ultrasone behandeling de enzymdynamiek beïnvloeden en de substraatoverdracht verbeteren, met name bij geïmmobiliseerde enzymen of bifasische media | Zeer enzymafhankelijk; te veel energie leidt tot ontvouwing of inactivering |
| Ribosomale/recombinante synthese | Geen direct effect op de vertaling | Ultrasone behandeling wordt voornamelijk gebruikt voor het afbreken van cellen na expressie |
Opschaling met behulp van ultrasone technologie: batch-, recirculatie- en continu-verwerking
De sonicatoren van Hielscher kunnen naadloos worden geïntegreerd in uw specifieke productieopstelling voor peptidesynthese.
Er zijn drie reactorconfiguraties die relevant zijn voor opschaling:
- Batch-sonicatie is eenvoudig en flexibel, maar naarmate het volume van het vat toeneemt, wordt het moeilijker om een optimale, homogene sonicatie te regelen.
- Bij recirculatieverwerking wordt de inhoud van de reactor herhaaldelijk door een ultrasone doorstroomcel gepompt, wat zorgt voor een gelijkmatigere behandeling met behoud van de flexibiliteit van het batchproces.
- Bij een continue doorstroming wordt de reactiestroom door een of meer geregelde ultrasone zones geleid. De verblijftijd, het debiet en de energie-inbreng kunnen nauwkeurig worden ingesteld, waardoor dit het voorkeursontwerp is voor een reproduceerbare productie met hoge doorvoercapaciteit.
Bij processen op basis van hars moeten het stromingspad, de pomp en de kleppen geschikt zijn voor de korrelgrootte, zonder dat er slijtage of verstopping optreedt. Een alternatief is om de hars in een geroerde reactor te houden en alleen de vloeibare fase door de ultrasone cel te laten circuleren.
2 industriële ultrasone apparaten van het model UIP4000hdT aangesloten op een roestvrijstalen doorstroomcelreactor voor de productie van peptiden.
Veelgestelde vragen over het opschalen van ultrasone peptidesynthese
Wat is ultrasone peptidesynthese?
Bij ultrasone peptidesynthese worden geluidsgolven met hoge intensiteit gebruikt om de menging, de massaoverdracht en de reactiekinetiek tijdens de peptidevorming te verbeteren. Akoestische cavitatie zorgt ervoor dat reagentia in gezwollen hars kunnen doordringen, breekt aggregaten af en versnelt de stappen van koppeling, ontbescherming, wassen en splitsing.
Hoe draagt echografie bij aan de verbetering van de peptide-synthese in vaste fase?
Bij ultrasone vaste-fase-peptidesynthese (US-SPPS) zorgt ultrasone behandeling voor een beter contact tussen het aan hars gebonden peptide en de opgeloste reagentia. Dit kan de reactiecycli verkorten, een vollediger koppeling bevorderen en sequentieverliezen verminderen, met name bij de synthese van hydrofobe, tot aggregatie neigende of anderszins moeilijk te synthetiseren peptiden.
Kan ultrasone behandeling de opbrengst en zuiverheid van peptiden verhogen?
Ultrasone behandeling kan de omzetting, de ruwe opbrengst en de zuiverheid verbeteren door een gelijkmatige verdeling van de reagentia te bevorderen en onvolledige koppeling te verminderen. Het resultaat hangt af van de peptidesequentie, het hars, het oplosmiddel, de koppelingschemie en de ultrasone parameters; daarom moet elk proces worden geoptimaliseerd en analytisch worden gevalideerd.
Welke stappen in de peptidesynthese kunnen met ultrasone trillingen worden behandeld?
Echografie kan een ondersteunende rol spelen bij het opzwellen van hars, het verwijderen van Fmoc- of Boc-beschermingsgroepen, het koppelen van aminozuren, het wassen, de condensatie van fragmenten, cyclisatie en het losmaken van de vaste drager. Het kan tevens de oplosbaarheid en de massaoverdracht verbeteren bij peptide-synthese in vloeibare fase en bij tag-ondersteunde peptide-synthese.
Ontdek ultrasone peptidesynthese – voor peptide-synthese in vaste fase en – TAGGING-synthese in vloeibare fase!
Is ultrasone peptidesynthese geschikt voor moeilijke sequenties?
Ja. Ultrasoon is vooral nuttig voor hydrofobe en tot aggregatie neigende sequenties, omdat cavitatie en microstreaming helpen om aggregatie op de hars te doorbreken en de toegang van reagentia tot reactieve plaatsen te verbeteren. Bij moeilijke koppelingen kunnen nog steeds geoptimaliseerde reagentia, herhaalde koppeling of aangepaste reactieomstandigheden nodig zijn.
Kan de ultrasone peptidesynthese worden opgeschaald?
Ultrasone peptidesynthese kan worden overgezet van laboratoriumproeven naar batch-, recirculatie- of continu-stroomproductie. Opschaling wordt bereikt door kritische parameters zoals amplitude, specifieke energie, temperatuur en verblijftijd constant te houden, terwijl het ultrasone vermogen, het oppervlak van de sonotrode of het aantal verwerkingsmodules wordt verhoogd.
Wat houdt lineaire schaalbaarheid in bij ultrasone behandeling?
Lineaire schaalbaarheid houdt in dat de doorvoer ongeveer evenredig toeneemt met het geïnstalleerde ultrasone vermogen, wanneer de benodigde energie per volume en andere procesomstandigheden constant blijven. Zo kan een verdubbeling van het effectieve ultrasone vermogen bijvoorbeeld leiden tot een verdubbeling van het debiet, mits de geometrie van de reactor, de temperatuur en de streefwaarden voor de productkwaliteit behouden blijven.
Waarom zijn de ultrasone apparaten van Hielscher geschikt voor het opschalen van de peptideproductie?
De sonicatoren van Hielscher bestrijken het vermogensbereik van laboratorium-, proef- en industriële toepassingen met consistente, regelbare bedrijfsparameters. Dankzij de instelbare amplitude, automatische gegevensregistratie, temperatuur- en drukbewaking, compatibiliteit met doorstroomcellen en modulaire configuraties zorgen ze voor een reproduceerbare procesoverdracht en een betrouwbare productie.
Kunnen Hielscher-sonicatoren worden ingezet bij de continue productie van peptiden?
Ja. De industriële ultrasone apparaten van Hielscher kunnen worden geïntegreerd in recirculatielussen en continue inline-reactoren met doorstroomcellen. Deze opstellingen zorgen voor een gecontroleerde verblijftijd en energie-inbreng, terwijl variaties tussen verschillende batches worden beperkt. Industriële systemen zijn ontworpen voor continu gebruik, 24 uur per dag en 7 dagen per week, onder veeleisende productieomstandigheden.
Zijn ultrasone baden of sonde-sonicatoren beter geschikt voor de synthese van peptiden?
Ultrasoonbaden kunnen handig zijn voor een eerste screening en gelijktijdige behandeling van kleine, gesloten vaten. Ultrasone apparaten met een sonde brengen de ultrasone golven rechtstreeks in het medium, wat een hogere intensiteit, betere parameterregeling en grotere schaalbaarheid oplevert. Daarom wordt bij proef- en industriële productie doorgaans de voorkeur gegeven aan sondes en doorstroomcellen.
Hoe wordt de temperatuur geregeld tijdens de ultrasone peptidesynthese?
Aangezien ultrasone behandeling energie aan het reactiemengsel toevoegt, is effectieve koeling van essentieel belang. De ultrasone apparaten van Hielscher zijn verkrijgbaar met vaten met een mantel, externe warmtewisselaars, temperatuurgestuurde recirculatie en gepulseerde ultrasone behandeling, zodat oververhitting efficiënt wordt voorkomen. Dankzij insteekbare temperatuursensoren en programmeerbare temperatuurgrenzen is betrouwbare temperatuurbewaking en -registratie mogelijk tijdens de gehele ontwikkelings- en productieperiode.
Hoe kies ik een Hielscher-sonicator voor peptidesynthese?
De keuze hangt af van het batchvolume, het gewenste debiet, het oplosmiddel, de viscositeit, de concentratie aan vaste stoffen of hars, de benodigde specifieke energie en het productieschema. Aan de hand van laboratoriumtests wordt het effectieve procesbereik vastgesteld, waarna een Hielscher-sonicator, sonotrode en doorstroomcel kunnen worden afgestemd op de beoogde doorvoercapaciteit.
Literatuur / Referenties
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren van lab naar industrieel formaat.