Ultrasone bereiding van liposomen

Ultrasoon geproduceerde liposomen vertonen een zeer hoge insluitingsefficiëntie, een hoge beladingscapaciteit en een uniform kleine, bolvormige afmeting. Daardoor bieden ultrasoon geproduceerde liposomen een uitstekende biologische beschikbaarheid. Hielscher Ultrasonics biedt ultrasone apparaten voor de betrouwbare productie van liposomen van farmaceutische kwaliteit in batchbedrijf en continu bedrijf.

Voordelen van ultrasone liposoomproductie

Ultrasone liposomale inkapseling is een techniek waarmee geneesmiddelen of andere therapeutische stoffen met behulp van ultrasone energie in liposomen worden ingekapseld. Vergeleken met andere methoden voor liposomale inkapseling heeft ultrasone inkapseling verschillende voordelen die deze techniek tot de superieure productietechniek maken.

• Hoge belading, hoge insluitingsefficiëntie: Ultrasone liposoomproductie staat bekend om de productie van liposomen met een hoge belading met werkzame stoffen, zoals vitamine C, geneesmiddelmoleculen enz. Tegelijkertijd vertoont de sonicatiemethode een hoge insluitingsefficiëntie. Dit betekent dat een hoog percentage van de werkzame stof door ultrasone behandeling wordt ingekapseld. Hierdoor is ultrasone behandeling een zeer efficiënte methode voor liposoomproductie.
• Uniform kleine liposomen: Een voordeel van ultrasone liposomale inkapseling is het vermogen om zeer uniforme liposomen met een smalle grootteverdeling te produceren. Ultrasone energie kan worden gebruikt om grotere liposomen of lipideaggregaten op te breken tot kleinere, uniformere liposomen. Dit leidt tot een grotere consistentie in de grootte en vorm van de liposomen, wat belangrijk kan zijn voor toepassingen voor geneesmiddelafgifte waarbij de deeltjesgrootte hun farmacokinetiek en werkzaamheid kan beïnvloeden.
• Toepasbaar op alle moleculen: Een ander voordeel van ultrasone liposomale inkapseling is het vermogen om een breed scala aan geneesmiddelen en andere therapeutische stoffen in te kapselen. De techniek kan worden gebruikt om zowel hydrofiele als hydrofobe geneesmiddelen in te kapselen, wat met andere methoden moeilijk kan zijn. Bovendien kan ultrasone energie worden gebruikt om macromoleculen en nanodeeltjes in te kapselen, die mogelijk te groot zijn om met andere methoden te worden ingekapseld.
• Snel en betrouwbaar: Ultrasone liposomale inkapseling is ook een relatief eenvoudig en snel proces. Er zijn geen agressieve chemicaliën of hoge temperaturen voor nodig, die schadelijk kunnen zijn voor de therapeutische stoffen die worden ingekapseld.
• Opschaling: Bovendien kan de techniek eenvoudig worden opgeschaald voor grootschalige productie, waardoor deze een kosteneffectieve optie is voor toepassingen voor geneesmiddelafgifte.

Samengevat is ultrasone liposomale inkapseling een superieure techniek voor liposomale inkapseling dankzij het vermogen om uniforme liposomen met een smalle grootteverdeling te produceren en een breed scala aan therapeutische stoffen in te kapselen, en dankzij de eenvoud en schaalbaarheid ervan.

Na de vorming van een lipidefilm en de daaropvolgende rehydratatie wordt sonicatie gebruikt om de insluiting van werkzame stoffen in het liposoom te bevorderen. Bovendien wordt met sonicatie de gewenste liposoomgrootte bereikt.

Ultrasone bereiding van liposomen voor farmaceutica en cosmetica

Liposomen (vesikels op basis van lipiden), transferosomen (ultravervormbare liposomen), ethosomen (ultravervormbare vesikels met een hoog alcoholgehalte) en niosomen (synthetische vesikels) zijn microscopische vesikels die kunstmatig kunnen worden bereid als bolvormige dragers waarin werkzame moleculen kunnen worden ingekapseld. Deze vesikels met diameters tussen 25 en 5000 nm worden vaak gebruikt als geneesmiddeldragers in de farmaceutische en cosmetische industrie, bijvoorbeeld voor orale of topische geneesmiddelafgifte, gentherapie en immunisatie. Ultrasone behandeling is een wetenschappelijk bewezen methode voor zeer efficiënte liposoomproductie. Ultrasone apparaten van Hielscher produceren liposomen met een hoge belading met werkzame stoffen en een superieure biologische beschikbaarheid.

Liposomen en liposomale formulering

Liposomen zijn unilamellaire, oligolamellaire of multilamellaire vesiculaire systemen en bestaan uit hetzelfde materiaal als een celmembraan (lipidendubbellaag). Op basis van hun samenstelling en grootte worden liposomen als volgt onderscheiden:

• multilamellaire vesikels (MLV, 0,1–10μm)
• kleine unilamellaire vesikels (SUV, <100 nm)
• grote unilamellaire vesikels (LUV, 100–500 nm)
• reusachtige unilamellaire vesikels (GUV, ≥1 μm)

De hoofdstructuur van liposomen bestaat uit fosfolipiden. Fosfolipiden hebben een hydrofiele kopgroep en een hydrofobe staartgroep, die uit een lange koolwaterstofketen bestaat.
Het liposoommembraan heeft een samenstelling die sterk lijkt op die van de huidbarrière, zodat liposomen gemakkelijk in de menselijke huid kunnen worden geïntegreerd. Wanneer de liposomen met de huid versmelten, kunnen ze de ingesloten stoffen rechtstreeks op de bestemming afgeven, waar de werkzame stoffen hun functies kunnen vervullen. Zo verbeteren de liposomen de doordringbaarheid/permeabiliteit van de huid voor de ingesloten farmaceutische en cosmetische stoffen. Ook liposomen zonder ingekapselde stoffen, de lege vesikels, zijn krachtige werkzame stoffen voor de huid, omdat ‘phosphatidylcholin’ twee essentiële stoffen bevat die het menselijk organisme niet zelf kan produceren: linolzuur en choline.
Liposomen worden voor farmaceutische, cosmetische en biochemische doeleinden gebruikt als biocompatibele dragers van geneesmiddelen, peptiden, eiwitten, ‘plasmic DNA’, antisense-oligonucleotiden of ribozymen. De enorme veelzijdigheid in deeltjesgrootte en in de fysische parameters van de lipiden biedt aantrekkelijke mogelijkheden om op maat gemaakte dragers voor een breed scala aan toepassingen te ontwikkelen. (Ulrich 2002)

Ultrasone vorming van liposomen

Liposomen kunnen met behulp van ultrasone behandeling worden gevormd. Het basismateriaal voor de bereiding van liposomen bestaat uit ‘amphilic’-moleculen die zijn afgeleid van of gebaseerd op biologische membraanlipiden. Voor de vorming van kleine unilamellaire vesikels (SUV) wordt de lipidedispersie voorzichtig gesoniceerd – bijvoorbeeld met het ultrasone handapparaat UP50H (50W, 30kHz), de VialTweeter of de ultrasone reactor CupHorn – in een ijsbad. Een dergelijke ultrasone behandeling duurt ongeveer 5 – 15 minuten. Een andere methode om kleine unilamellaire vesikels te produceren is sonicatie van multilamellaire liposoomvesikels.
Dinu-Pirvu et al. (2010) beschrijven het verkrijgen van transferosomen door MLV’s bij kamertemperatuur te soniceren.
Hielscher Ultrasonics biedt verschillende ultrasone apparaten, sonotroden en accessoires en kan daardoor de meest geschikte ultrasone opstelling leveren voor zeer efficiënte liposomale inkapseling op elke schaal.

Ultrasone inkapseling van werkzame stoffen in liposomen

Liposomen fungeren als dragers voor werkzame stoffen zoals vitaminen, therapeutische moleculen, peptiden enz. Ultrasoon geluid is een effectief hulpmiddel voor het bereiden en vormen van liposomen voor de insluiting van werkzame stoffen. Tegelijkertijd ondersteunt sonicatie het inkapselings- en insluitingsproces, zodat liposomen met een hoge belading met werkzame stoffen worden geproduceerd. Vóór de inkapseling hebben liposomen de neiging clusters te vormen door de interactie tussen oppervlakteladingen van de polaire koppen van fosfolipiden (vgl. Míckova et al. 2008); bovendien moeten ze worden geopend. Zhu et al. (2003) beschrijven bijvoorbeeld de inkapseling van biotinepoeder in liposomen door ultrasone behandeling. Nadat het biotinepoeder aan de vesikelsuspensie was toegevoegd, werd de oplossing gesoniceerd. Na deze behandeling was de biotine in de liposomen ingesloten.
Lees meer over ultrasone inkapseling van GLP-1-‘peptrides’ (bijv. semaglutide) in liposomen!

Liposomale emulsies met ultrasone behandeling

Om het verzorgende effect van hydraterende crèmes of anti-agingcrèmes, lotions, gels en andere cosmeceutische formuleringen te versterken, worden emulgatoren aan de liposomale dispersies toegevoegd om grotere hoeveelheden lipiden te stabiliseren. Onderzoeken hebben echter aangetoond dat de capaciteit van liposomen doorgaans beperkt is. Met de toevoeging van emulgatoren zal dit effect eerder optreden en de extra emulgatoren verzwakken de affiniteit van fosfatidylcholine voor de huidbarrière. Nanodeeltjes – bestaande uit fosfatidylcholine en lipiden – bieden een antwoord op dit probleem. Deze nanodeeltjes bestaan uit een oliedruppel die bedekt is met een monolaag van fosfatidylcholine. Het gebruik van nanodeeltjes maakt formuleringen mogelijk die meer lipiden kunnen opnemen en stabiel blijven, zodat geen extra emulgatoren nodig zijn.
Ultrasone behandeling is een bewezen methode voor de productie van nano-emulsies en nanodispersies. Zeer intensief ultrasoon geluid levert het vermogen dat nodig is om een vloeibare fase (gedispergeerde fase) in kleine druppels in een tweede fase (continue fase) te dispergeren. In de dispergeerzone veroorzaken imploderende cavitatiebellen intense schokgolven in de omringende vloeistof en leiden ze tot de vorming van vloeistofstralen met een hoge vloeistofsnelheid. Om de nieuw gevormde druppels van de gedispergeerde fase tegen coalescentie te stabiliseren, worden emulgatoren (oppervlakteactieve stoffen, surfactanten) en stabilisatoren aan de emulsie toegevoegd. Omdat coalescentie van de druppels na het opbreken de uiteindelijke druppelgrootteverdeling beïnvloedt, worden efficiënt stabiliserende emulgatoren gebruikt om de uiteindelijke druppelgrootteverdeling gelijk te houden aan de verdeling onmiddellijk na het opbreken van de druppels in de ultrasone dispergeerzone.

Liposomale dispersies met ultrasone behandeling

Liposomale dispersies op basis van onverzadigd ‘phosphatidylchlorine’ zijn onvoldoende stabiel tegen oxidatie. De dispersie kan worden gestabiliseerd met antioxidanten, zoals een complex van vitamine C en E.
 

Vorming van liposomen via de omgekeerde-faseverdampingsmethode met sonicatie

 
Ortan et al. (2002) behaalden goede resultaten in hun onderzoek naar de ultrasone bereiding van etherische olie van Anethum graveolens in liposomen. Na sonicatie lagen de afmetingen van de liposomen tussen 70–150 nm en die van MLV tussen 230–475 nm; deze waarden waren ook na 2 maanden ongeveer constant, maar namen na 12 maanden toe, vooral in de SUV-dispersie (zie de histogrammen hieronder). De stabiliteitsmeting met betrekking tot het verlies van etherische olie en de grootteverdeling liet ook zien dat liposomale dispersies het gehalte aan vluchtige olie behielden. Dit suggereert dat de insluiting van de etherische olie in liposomen de stabiliteit van de olie verhoogde.

Ortan et al. (2009): Stabiliteit van MLV- en SUV-dispersies na 1 jaar. Liposomale formuleringen werden bewaard bij 4±1 ºC.

Ultrasone processors van Hielscher zijn de ideale apparaten voor toepassingen in de cosmetische en farmaceutische industrie. Systemen die bestaan uit meerdere ultrasone processors van elk tot 16.000 watt bieden de capaciteit die nodig is om deze laboratoriumtoepassing om te zetten in een efficiënte productiemethode voor fijn gedispergeerde emulsies in een continue stroom of in een batch – met resultaten die vergelijkbaar zijn met die van de beste momenteel beschikbare hogedrukhomogenisatoren, zoals homogenisatoren met orificekleppen. Naast deze hoge efficiëntie bij continue emulgering vereisen ultrasone apparaten van Hielscher zeer weinig onderhoud en zijn ze zeer eenvoudig te bedienen en te reinigen. Het ultrasone geluid ondersteunt daadwerkelijk het reinigen en spoelen. Het ultrasone vermogen is instelbaar en kan worden aangepast aan specifieke producten en emulgeringsvereisten. Er zijn ook speciale doorstroomcelreactoren beschikbaar die voldoen aan de geavanceerde CIP-vereisten (clean-in-place, reiniging ter plaatse) en SIP-vereisten (sterilize-in-place, sterilisatie ter plaatse).

Veelgestelde vragen over liposomen

Welke soorten liposomen worden onderscheiden?

Liposomen worden in verschillende soorten ingedeeld op basis van hun grootte en het aantal dubbellagen dat ze bevatten. Deze categorieën omvatten:

• Kleine unilamellaire vesikels (SUV): Dit zijn de kleinste liposomen met één lipidendubbellaag.
• Grote unilamellaire vesikels (LUV): Deze zijn groter dan SUV’s en hebben eveneens één dubbellaag.
• Multilamellaire vesikels (MLV): Deze bevatten meerdere concentrische dubbellagen.
• Multivesiculaire vesikels (MVV): Deze bestaan uit meerdere kleinere vesikels binnen een groter vesikel.

 
Andere gespecialiseerde soorten zijn:

• GePEGyleerde liposomen: Liposomen die met polyethyleenglycol (PEG) zijn gemodificeerd om de stabiliteit en circulatietijd te verbeteren.
• Nanoliposomen: Zeer kleine liposomen, die doorgaans worden gebruikt voor gerichte geneesmiddelafgifte.

Welke vesikelstructuren kunnen liposomen vertonen?

Liposomen worden op basis van hun vesikelstructuur verder ingedeeld in zeven hoofdtypen:

• Grote multilamellaire vesikels (MLV): Bevatten meerdere dubbellagen.
• Oligolamellaire vesikels (OLV): Hebben enkele dubbellagen.
• Kleine unilamellaire vesikels (SUV): De kleinste, met één dubbellaag.
• Middelgrote unilamellaire vesikels (MUV): Middelgroot, met één dubbellaag.
• Grote unilamellaire vesikels (LUV): Groter, met één dubbellaag.
• Reusachtige unilamellaire vesikels (GUV): Zeer groot, met één dubbellaag.
• Multivesiculaire vesikels (MVV): Meerdere vesikels binnen één groot vesikel.

Wat zijn de verschillen tussen liposomen en niosomen?

Liposomen en niosomen verschillen voornamelijk in hun samenstelling:
Liposomen: Gemaakt van fosfolipiden met twee ketens, die neutraal of geladen kunnen zijn.
Niosomen: Gemaakt van ongeladen oppervlakteactieve stoffen met één keten en cholesterol.
Beide structuren worden gevormd door sonicatie, die de assemblage van vesikels met dubbellagen bevordert.

Wat is de ideale grootte van een liposoom?

Voor therapeutische afgifte ligt de ideale diameter van een liposoom theoretisch tussen 50 en 200 nanometer. Dit groottebereik optimaliseert de stabiliteit en biologische beschikbaarheid. Sonicatie wordt vaak gebruikt om het vesikel tot de gewenste grootte te verkleinen.

Kunnen liposomen hydrofiele geneesmiddelen vervoeren?

Ja, liposomen kunnen hydrofiele geneesmiddelen vervoeren. Ze worden gewaardeerd in biomedische toepassingen vanwege hun vermogen om zowel hydrofobe als hydrofiele stoffen in te kapselen. Bovendien bieden ze een hoge biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid, waardoor ze effectieve afgiftesystemen zijn.

Hoe worden liposomen gemaakt?

De meest gebruikte technieken voor de bereiding van liposomen zijn de dunnefilmmethode en de omgekeerde-faseverdampingsmethode.
Dunnefilmhydratatiemethode:

1. Los lipiden op in een organisch oplosmiddel.
2. Verdamp het oplosmiddel om een dunne lipidefilm te vormen.
3. Hydrateer de film met een waterige oplossing met behulp van sonicatie om multilamellaire vesikels te vormen.

Omgekeerde-faseverdampingsmethode:

1. Los lipiden op in water en ethanol.
2. Soniceer de oplossing bij 60°C gedurende ongeveer 10 minuten om een lipidepasta te vormen.
3. Koel de lipidesuspensie af en voeg al roerend druppelsgewijs water of buffer toe.
4. Hydrateer de suspensie gedurende 1 uur om multilamellaire vesikels te vormen.
5. Verklein de liposomen door verdere sonicatie.

Wat zijn archaeosomen?

Archaeosomen zijn liposomen die zijn gemaakt van archaeale lipiden, die bekendstaan om hun stabiliteit en weerstand tegen extreme omstandigheden. Deze eigenschappen maken archaeosomen bijzonder nuttig voor geneesmiddelafgifte en vaccinontwikkeling onder uitdagende omstandigheden.

Hoe worden archaeosomen bereid?

Sonicatieprocedure volgens Pise (2022): Archaeosomen kunnen worden gemaakt van de polaire lipidenfractie “PLF” van Sulfolobussolfataricus door sonicatie bij 60°C, zonder dat externe aanvulling van lipiden nodig is. Bij 0°C werden polaire lipiden van Sulfolobusacidocaldarius effectief gesoniceerd om archaeosomen te vormen. Met BMD beladen archaeosomen en conventionele liposomen, evenals archaeale lipiden die uit Archaea H. salinarum waren geïsoleerd en met fosfatidylcholine waren verrijkt, werden met sonicatietechnieken gemaakt. Gesoniceerde vesikels werden voor topische afgifte gemaakt door MLV-dispersies gedurende 4 minuten bij 80 procent amplitude te soniceren met een Hielscher UP50H sonicator met sonde (zie de afbeelding links).

Literatuur/Referenties

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.