Genetische transformatie in plantencellen met behulp van ultrasone trillingen

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) is een efficiënte methode om plantencellen te infecteren met vreemde genen met Agrobacterium als transporteur. Ultrasone cavitatie veroorzaakt sonoporatie, wat kan worden omschreven als het gericht verwonden van plantenweefsel. Via deze ultrasoon gecreëerde microwondjes kunnen DNA en DNA-vectoren efficiënt in de celmatrix worden getransporteerd.

sonoporatie – Ultrasonisch verbeterde celtransformatie

Wanneer laagfrequent ultrageluid (ongeveer 20 kHz) wordt toegepast op celsuspensies, veroorzaken de effecten van akoestische cavitatie een voorbijgaande membraanpermeabilisatie op celweefsels. Dit ultrasone effect staat bekend als sonoporatie en wordt gebruikt voor genoverdracht naar cellen of weefsels.
De voordelen van ultrasoonbehandeling zijn gebaseerd op het niet-thermische mechanische werkingsprincipe, waardoor ultrasoonbehandeling vaak veelzijdiger is en minder afhankelijk van celtypes. De veelzijdige toepassing van sonoporatie opent de mogelijkheid voor het gebruik van transgene planten, die een aanzienlijk potentieel hebben in de bioproductie van complexe menselijke therapeutische eiwitten. Dergelijke plantgebaseerde bioreactoren kunnen gemakkelijk genetisch gemanipuleerd worden, voorkomen mogelijke besmetting met menselijke pathogenen, beschadigen geen transformatie bemiddelende bacteriën (bijv. Agrobacterium) en zijn een goedkope, efficiënte methode voor biosynthese.

Ultrasoon-ondersteunde celtransformatie

Sonificatie is een techniek waarbij ultrasone geluidsgolven met een lage frequentie worden toegepast om deeltjes in een oplossing te bewegen, oplossingen te mengen en zo de snelheid van massaoverdracht en oplossen te verhogen. Tegelijkertijd kan sonificatie opgeloste gassen uit vloeistoffen verwijderen. Bij planttransformatie zal sonicatie de vorming van microwonden op plantenweefsel veroorzaken en de afgifte van naakt DNA in de protoplast van de plant verbeteren.

Voor genetische transformatie is de Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) de voorkeursmethode en deze methode heeft een aanzienlijk hogere efficiëntie dan sonicatie die wordt gebruikt om naakt DNA en DNA-vectoren direct in de protoplast over te brengen. Talrijke studies hebben aangetoond dat de sonicatie geassisteerde Agrobacterium-gemedieerde transformatie (SAAT) gebruikt kan worden om mechanische verstoring en vorming van wonden op plantencellen te induceren door middel van ultrasone geluidsgolven en de resulterende akoestische cavitatie. Een korte ultrasone behandeling creëert microwondjes op het oppervlak van explantaten. De gewonde cellen zorgen ervoor dat Agrobacterium in het diepere deel van het plantenweefsel kan binnendringen, waardoor de kans toeneemt dat plantencellen worden geïnfecteerd. Bovendien bevorderen de afgescheiden fenolverbindingen de transformatie. De ultrasonisch gegenereerde microwonden maken penetratie van explantaten door bacteriën ook beter mogelijk. SAAT werd met succes gebruikt voor genetische transformatie in plantensoorten die bijzonder resistent zijn tegen Agrobacterium.
De grote voordelen van SAAT zijn dat het een zeer eenvoudige en goedkope methode is en dat de genoverdracht via Agrobacterium aanzienlijk wordt verbeterd. Naast de succesvolle toepassing van SAAT in de transformatie van Chenopodium rubrum L. en Beta vulgaris L., is deze aanpak ook toegepast in de productie van recombinant Escherichia coli wild-type hitte-labiel holotoxine en Escherichia coli mutant LT vaccinadditieven in Nicotiana tabacum, waarbij de hoogste systemische LT-B-specifieke IgG-titers werden gedetecteerd bij vogels.
(vgl. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka en R. Baranski, 2014)

Algemene procedure voor genoverdracht via Sonoporatie in plantencellen

1. Voorbereiding van genetisch materiaal: Begin met het voorbereiden van het genetisch materiaal dat je in de plantencellen wilt introduceren. Dit kan plasmide DNA, RNA of andere nucleïnezuren zijn.
2. Isolatie van plantencellen: Isoleer de plantencellen waarop je je wilt richten. Afhankelijk van je experiment kunnen deze cellen geïsoleerd worden uit plantenweefsels of -culturen.
3. Celophanging: Suspendeer de plantencellen in een geschikt medium of buffer. Dit is essentieel om ervoor te zorgen dat de cellen gezond zijn en in een staat die bevorderlijk is voor de opname van genen.
4. Stel je Sonicator in: Bereid de sonicator van het probe-type voor met sonicatie vooraf ingestelde parameters zoals amplitude, tijd, energie en temperatuur. Dompel de ultrasone sonde in de celsuspensie.
5. Sonificatie: Start de sonicatieprocedure. De snelle oscillatie van de sondepunt genereert cavitatiebelletjes in de vloeistof. Deze belletjes zetten uit en klappen in als gevolg van de ultrasone golven, waardoor mechanische krachten en microstromingen in de suspensie ontstaan.
6. Sonoporatie: De mechanische krachten en microstroming die door cavitatie worden gegenereerd, creëren tijdelijk poriën en gaten in de membranen van de plantencellen. Het genetisch materiaal in de suspensie kan via deze poriën de plantencellen binnendringen.
7. Incubatie: Na de sonoporatiebehandeling incubeer je de plantencellen om ze te laten herstellen en hun membranen te stabiliseren. Dit is een cruciale stap om de celoverleving en succesvolle genoverdracht te garanderen.

Genoverdracht via Agrobacterium of Liposomen

Er zijn twee gangbare vormen om plantencellen te transfecteren. Ze gebruiken ofwel agrobacterium, een geslacht van Gram-negatieve bacteriën, of liposomen als drager van het genetisch materiaal.

• Agrobacterium-gemedieerde sonoporatie: Agrobacterium tumefaciens is een bacterie die vaak wordt gebruikt voor genetische manipulatie van planten. Bij deze methode wordt plasmide DNA met het gewenste gen in Agrobacterium gebracht, dat vervolgens met plantencellen wordt gemengd. De celsuspensie wordt onderworpen aan sonoporatie met behulp van een sonicator van het sonde-type. De ultrasone energie versterkt de overdracht van het genetisch materiaal van Agrobacterium naar de plantencellen. Deze methode wordt veel gebruikt voor de genetische modificatie van planten.
• Liposoom-gemedieerde sonoporatie: Liposomen zijn op lipiden gebaseerde blaasjes die genetisch materiaal kunnen vervoeren. In deze methode worden liposomen geladen met plasmide DNA of andere nucleïnezuren gemengd met plantencellen. Sonoporatie met behulp van een sonicator van het sonde-type wordt gebruikt om de opname van liposomen door plantencellen te vergemakkelijken. Het ultrageluid verstoort de lipide bilagen van de liposomen, waardoor het genetisch materiaal vrijkomt in de plantencellen. Deze aanpak is nuttig voor studies naar voorbijgaande genexpressie in plantencellen.

Wetenschappelijk bewezen voordelen van Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) is toegepast op talloze plantensoorten. Een korte en relatief milde ultrasone behandeling van plantencelculturen veroorzaakt sonoporatie, wat vervolgens een diepe penetratie van Agrobacterium als gentransporteur mogelijk maakt. Hieronder kunt u voorbeeldstudies lezen die de gunstige effecten van SAAT aantonen.

Ultrasonisch-ondersteunde transformatie van Ashwagandha

Om de transformatie-efficiëntie in W. somnifera (bekend als ashwagandha of winterkers) te verbeteren, onderzochten Dehdashti en collega's (2016) het gebruik van acetosyringon (AS) en sonicatie.
Acetosyringon (AS) werd in drie fasen toegevoegd: Agrobacterium vloeibare cultuur, Agrobacterium infectie en co-cultuur van explantaten met Agrobacterium. De toevoeging van 75 μM AS aan de vloeibare cultuur van Agrobacterium bleek optimaal te zijn voor de inductie van virale genen.
De extra toepassing van sonicatie (SAAT) resulteerde in de hoogste genexpressie. De gusA-genexpressie in harige wortels bleek het best te zijn wanneer de bladeren en scheutuiteinden respectievelijk 10 en 20 seconden werden gesoniteerd. De transformatie-efficiëntie van het verbeterde protocol werd opgenomen 66,5 en 59,5% in het geval van bladeren en scheutpunt explanten, respectievelijk. In vergelijking met andere protocollen bleek de transformatie-efficiëntie van dit verbeterde protocol 2,5 maal hoger te zijn voor bladeren en 3,7 maal hoger voor scheuttoppen. Southern blot analyses bevestigden 1-2 kopieën van het gusA transgen in de lijnen W1-W4, terwijl 1-4 transgenkopieën werden gedetecteerd in de lijn W5 gegenereerd door het verbeterde protocol.

Effect van de duur van sonicatie-ondersteunde Agrobacterium-gemedieerde transformatie (SAAT) op de transformatiefrequentie van W. somnifera blad (a) en scheutpunt (b) explanten
(studie en grafiek: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrasone transformatie van katoen

Hussain et al. (2007) laten de gunstige effecten zien van sonicatie-geassisteerde katoentransformatie. Akoestische cavitatie veroorzaakt door laagfrequent ultrageluid creëert microwondjes op en onder het oppervlak van plantenweefsel (sonoporatie) en zorgt ervoor dat Agrobacterium zich dieper en volledig door het plantenweefsel kan verplaatsen. Deze manier van verwonden vergroot de kans op infectie van plantencellen die dieper in het weefsel liggen. Om de transformatie-efficiëntie van SAAT te evalueren, werd de expressie van het GUS-gen gemeten. Het GUS reporter systeem is een reporter gen systeem dat vooral nuttig is in de moleculaire plantenbiologie en microbiologie. Door verschillende SAAT-parameters aan te passen, werd de transiënte expressie van GUS in katoen met rijpe embryo's als explantant aanzienlijk verbeterd. GUS werd voor het eerst gedetecteerd 24 uur na incubatie van de explantaten en bij 48 uur was de GUS-expressie zeer intens, wat diende als een nuttige indicator voor succesvolle transformatie van de katoenexplant na sonicatieondersteunde Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT). Bij vergelijking van verschillende transformatietechnieken (namelijk biolistisch, Agro, BAAT, SAAT), toonde sonicatie-ondersteunde Agrobacterium-gemedieerde transformatie (SAAT) veruit de beste transformatieresultaten.

Keuze van transformatieprocedure op basis van voorbijgaande expressie van GUS. Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation (SAAT) laat een significant hogere transiënte expressie zien.
(studie en grafiek: © Hussain et al., 2007)

Ultrasone oplossingen met hoge prestaties voor Sonoporatie en SAAT

Hielscher Ultrasonics heeft jarenlange ervaring in de ontwikkeling en productie van hoogwaardige ultrasone apparaten voor laboratoria, onderzoeksfaciliteiten en industriële productie met een zeer hoge verwerkingscapaciteit. Voor microbiologie en biowetenschappen biedt Hielscher verschillende oplossingen om te voldoen aan de verschillende vereisten die nodig zijn voor specifieke weefsels en hun behandelingen. Voor de gelijktijdige ultrasoonbehandeling van talrijke monsters biedt Hielscher de UIP400MTP voor multiwellplaten, de VialTweeter voor de sonicatie van maximaal 10 vials (bijv. Eppendorf-buizen) of de ultrasone CupHorn. Ultrasone apparaten van het sonde-type zijn beschikbaar van 50 tot 400 watt als laboratoriumhomogenisatoren, terwijl industriële systemen het vermogensbereik bestrijken van 500 watt tot 16 kW.
Neem contact met ons op en laat ons weten wat uw toepassing en procesvereisten zijn. Onze ervaren medewerkers adviseren u graag over de meest geschikte ultrasoon voor uw biologische proces.
De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone machines: