Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) is een efficiënte methode om plantencellen te infecteren met vreemde genen, waarbij Agrobacterium als transporteur wordt gebruikt. Ultrasone cavitatie veroorzaakt sonoporatie, die kan worden omschreven als gerichte micro-wondvorming van plantenweefsel. Via deze ultrasoon gecreëerde micro-wonden kunnen DNA en DNA-vectoren efficiënt in de celmatrix worden getransporteerd.

Sonoporatie – Ultrasonisch versterkte celtransformatie

Wanneer laagfrequent ultrageluid (ca. 20 kHz) wordt toegepast op celsuspensies, veroorzaken de effecten van akoestische cavitatie een voorbijgaande membraanpermeabilisatie in celweefsels. Dit ultrasone effect staat bekend als sonoporatie en wordt gebruikt voor genoverdracht in cellen of weefsels.
De voordelen van ultrasoonbehandeling zijn gebaseerd op het niet-thermische mechanische werkingsprincipe, waardoor sonicatie vaak veelzijdiger is en minder afhankelijk van celtypes. De veelzijdige toepassing van sonoporatie opent de mogelijkheid tot het gebruik van transgene planten, die een aanzienlijk potentieel hebben bij de bioproductie van complexe therapeutische menselijke eiwitten. Dergelijke op planten gebaseerde bioreactoren kunnen gemakkelijk genetisch gemanipuleerd worden, voorkomen de potentiële besmetting met menselijke pathogenen, brengen geen schade toe aan transformatie bemiddelende bacteriën (b.v. Agrobacterium), en zijn een goedkope, doeltreffende methode van biosynthese.

Ultrasoon ondersteunde cel transformatie

Sonificatie is een techniek waarbij ultrasone golven met een lage frequentie worden toegepast om deeltjes in oplossing te agiteren, oplossingen te mengen en zo de snelheid van de massaoverdracht en het oplossingsproces te verhogen. Tegelijkertijd kan sonicatie opgeloste gassen uit vloeistoffen verwijderen. Bij plant-transformatie zal sonicatie de vorming van microwonden op plantenweefsel veroorzaken en de afgifte van naakt DNA in de plant protoplast verbeteren.

Voor genetische transformatie wordt de voorkeur gegeven aan Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT), een methode die aanzienlijk efficiënter is dan sonicatie die wordt gebruikt om naakt DNA en DNA-vectoren rechtstreeks in de protoplast over te brengen. Talrijke studies hebben aangetoond dat de met sonicatie geassisteerde Agrobacterium-gemedieerde transformatie (SAAT) kan worden gebruikt om mechanische ontwrichting en de vorming van wonden op plantencellen te induceren door ultrasone golven en de daaruit voortvloeiende akoestische cavitatie. Een korte ultrasone behandeling creëert micro-wonden op het oppervlak van explantaten. Door de gewonde cellen kan Agrobacterium doordringen tot in het diepere deel van het plantenweefsel, waardoor de kans op infectie van de plantencellen toeneemt. Bovendien bevorderen de afgescheiden fenolverbindingen de transformatie. De ultrasonisch opgewekte micro-wonden maken explantpenetratie door bacteriën ook haalbaarder. SAAT werd met succes gebruikt voor genetische transformatie in plantensoorten die in het bijzonder als resistent tegen Agrobacterium worden beschouwd.
Het feit dat het een zeer eenvoudige en goedkope methode is, alsmede de aanzienlijke verbetering van Agrobacterium-gemedieerde genoverdracht zijn de belangrijkste voordelen van SAAT. Naast de succesvolle toepassing van SAAT bij de transformatie van Chenopodium rubrum L. en Beta vulgaris L., is deze aanpak ook toegepast bij de productie van recombinant Escherichia coli wild-type heat-labile holotoxine en Escherichia coli mutant LT-vaccin-adjuvans in Nicotiana tabacum, waarbij bij vogels de hoogste systemische LT-B-specifieke IgG-titers werden opgespoord.
(vgl. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka en R. Baranski, 2014)

Wetenschappelijk bewezen voordelen van "Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation" (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) is toegepast op talrijke plantensoorten. Een korte en relatief milde ultrasone behandeling van plantencelculturen veroorzaakt sonoporatie, die vervolgens een diepe penetratie van Agrobacterium als gentransporter mogelijk maakt. Hieronder kunt u voorbeeldstudies lezen die de gunstige effecten van SAAT aantonen.

Ultrasonisch ondersteunde transformatie van Ashwagandha

Om de transformatie-efficiëntie in W. somnifera (bekend als ashwagandha of winterkers) te verbeteren, onderzochten Dehdashti en collega's (2016) het gebruik van acetosyringon (AS) en sonicatie.
Acetosyringon (AS) werd in drie fasen toegevoegd: Agrobacterium vloeistofkweek, Agrobacterium infectie en co-cultuur van explantaten met Agrobacterium. De toevoeging van 75 μM AS aan de vloeibare cultuur van Agrobacterium bleek optimaal te zijn voor de inductie van vir-genen.
De extra toepassing van sonicatie (SAAT) resulteerde in de hoogste genexpressie. De gusA genexpressie in harige wortels bleek het best te zijn wanneer de bladeren en scheutuiteinden respectievelijk 10 en 20 seconden werden gesoniceerd. De transformatie-efficiëntie van het verbeterde protocol bedroeg 66,5 en 59,5% in het geval van respectievelijk blad- en scheutpuntexplantaten. In vergelijking met andere protocollen bleek de transformatie-efficiëntie van dit verbeterde protocol 2,5 maal hoger te zijn voor bladeren en 3,7 maal hoger voor scheutuiteinden. Southern blot analyses bevestigden 1-2 kopieën van het gusA transgen in de lijnen W1-W4, terwijl 1-4 transgen kopieën werden gedetecteerd in de lijn W5 gegenereerd door het verbeterde protocol.

Effect van de duur van de met sonicatie ondersteunde Agrobacterium-gemedieerde transformatie (SAAT) op de transformatiefrequentie van W. somnifera blad- (a) en scheutpunt- (b) explanten
(studie en grafiek: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrasonisch ondersteunde transformatie van katoen

Hussain et al. (2007) tonen de gunstige effecten aan van transformatie van katoen met behulp van sonicatie. Akoestische cavitatie veroorzaakt door laagfrequent ultrageluid creëert micro-wonden op en onder het oppervlak van het plantenweefsel (sonoporatie) en stelt Agrobacterium in staat zich dieper en volledig door het plantenweefsel te verplaatsen. Deze wijze van verwonden verhoogt de kans op infectie van dieper in het weefsel gelegen plantencellen. Om de transformatie-efficiëntie van SAAT te evalueren, werd de expressie van het GUS-gen gemeten. Het GUS-reporter-systeem is een reporter-gensysteem dat bijzonder nuttig is in de moleculaire biologie van planten en de microbiologie. Door verschillende SAAT-parameters aan te passen, werd de transiënte expressie van GUS in katoen aanzienlijk verbeterd, waarbij rijpe embryo's als explant werden gebruikt. GUS werd voor het eerst gedetecteerd 24 uur na incubatie van de explantaten en tegen 48 uur was de GUS-expressie zeer intens, wat diende als een nuttige indicator van succesvolle transformatie van de katoenexplant na sonicatie-geassisteerde Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT). Bij vergelijking van de verschillende transformatietechnieken (namelijk biolistisch, Agro, BAAT, SAAT), gaf de met sonicatie ondersteunde Agrobacterium-gemedieerde transformatie (SAAT) verreweg de beste resultaten te zien.

Keuze van de transformatieprocedure op basis van de transiënte expressie van GUS. Sonificatie-geassisteerde Agrobacterium-gemedieerde transformatie (SAAT) laat een significant hogere transiënte expressie zien.
(studie en grafiek: © Hussain et al., 2007)

Ultrasone oplossingen van hoge kwaliteit voor Sonoporatie en SAAT

Hielscher Ultrasonics heeft jarenlange ervaring in de ontwikkeling en fabricage van hoogwaardige ultrasoonapparatuur voor laboratoria, onderzoeksfaciliteiten en industriële productie met een zeer hoge verwerkingscapaciteit. Voor microbiologie en biowetenschappen biedt Hielscher diverse oplossingen om te voldoen aan de verschillende eisen die worden gesteld aan specifieke weefsels en de behandeling daarvan. Voor de gelijktijdige ultrasoonbehandeling van talrijke monsters biedt Hielscher de UIP400MTP voor multiwell-platen, de VialTweeter voor de ultrasoonbehandeling van maximaal 10 vials (bijv. Eppendorf-buisjes) of de ultrasone CupHorn. Ultrasone sondetoestellen zijn verkrijgbaar van 50 tot 400 watt als laboratoriumhomogenisatoren, terwijl industriële systemen het vermogensbereik bestrijken van 500 watt tot 16kW.
Neem contact met ons op en laat ons weten wat uw toepassing en procesvereisten zijn. Onze ervaren medewerkers zullen u graag de meest geschikte ultrasoonmachine voor uw biologisch proces aanbevelen.
Onderstaande tabel geeft een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasonicators: