Genetische transformatie van plantencellen met ultrasoon geluid

Door sonicatie ondersteunde, door Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT) is een efficiënte methode om plantencellen met vreemde genen te infecteren, waarbij Agrobacterium als transporteur wordt gebruikt. Ultrasone cavitatie veroorzaakt sonoporatie, die kan worden beschreven als het gericht aanbrengen van microwonden in plantenweefsel. Via deze ultrasoon gecreëerde microwonden kunnen DNA en DNA-vectoren efficiënt naar de celmatrix worden getransporteerd.

Sonoporatie – ultrasoon versterkte celtransformatie

Wanneer laagfrequent ultrasoon geluid (ca. 20kHz) op celsuspensies wordt toegepast, veroorzaken de effecten van akoestische cavitatie een tijdelijke permeabilisatie van de membranen in celweefsels. Dit ultrasone effect staat bekend als sonoporatie en wordt gebruikt voor genoverdracht in cellen of weefsels.
De voordelen van ultrasone behandeling zijn gebaseerd op het niet-thermische, mechanische werkingsprincipe, waardoor sonicatie vaak veelzijdiger en minder afhankelijk van celtypen is. De veelzijdige toepassing van sonoporatie maakt het gebruik van transgene planten mogelijk, die een aanzienlijk potentieel hebben voor de bioproductie van complexe humane therapeutische eiwitten. Dergelijke plantaardige bioreactoren kunnen eenvoudig genetisch worden gemanipuleerd, voorkomen mogelijke besmetting met humane ziekteverwekkers, beschadigen de bacteriën die de transformatie mediëren (bijv. Agrobacterium) niet en vormen een goedkope, doeltreffende methode voor biosynthese.

Ultrasoon ondersteunde celtransformatie

Sonicatie is een techniek waarbij laagfrequente ultrasone golven worden toegepast om deeltjes in een oplossing in beweging te brengen en oplossingen te mengen, waardoor de snelheid van massaoverdracht en oplossing toeneemt. Tegelijkertijd kan sonicatie opgeloste gassen uit vloeistoffen verwijderen. Bij plantentransformatie veroorzaakt sonicatie microwonden in plantenweefsel en verbetert zij de overdracht van naakt DNA naar de plantenprotoplast.

Voor genetische transformatie is door sonicatie ondersteunde, door Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT) de voorkeursmethode. Deze heeft een aanzienlijk hogere efficiëntie dan sonicatie die wordt gebruikt om naakt DNA en DNA-vectoren rechtstreeks naar de protoplast over te brengen. Talrijke studies hebben aangetoond dat door sonicatie ondersteunde, door Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT) kan worden gebruikt om mechanische ontwrichting en wondvorming bij plantencellen te veroorzaken door ultrasone golven en de daaruit voortkomende akoestische cavitatie. Een korte ultrasone behandeling creëert microwonden op het oppervlak van explantaten. De verwonde cellen laten Agrobacterium doordringen in de dieper gelegen delen van plantenweefsels, waardoor de kans op infectie van plantencellen toeneemt. Bovendien versterken de uitgescheiden fenolische verbindingen de transformatie. De ultrasoon gegenereerde microwonden vergemakkelijken ook het binnendringen van bacteriën in explantaten. SAAT is met succes gebruikt voor genetische transformatie van plantensoorten die in het bijzonder als resistent tegen Agrobacterium worden beschouwd.
De belangrijkste voordelen van SAAT zijn dat het een zeer eenvoudige en goedkope methode is en dat het de door Agrobacterium gemedieerde genoverdracht aanzienlijk verbetert. Naast de succesvolle toepassing van SAAT bij de transformatie van Chenopodium rubrum L. en Beta vulgaris L. is deze aanpak ook toegepast bij de productie van recombinant hittelabiel holotoxine van wildtype Escherichia coli en vaccinadjuvantia op basis van mutant LT van Escherichia coli in Nicotiana tabacum, waarbij de hoogste systemische LT-B-specifieke IgG-titers bij vogels werden aangetoond.
(vgl. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka en R. Baranski, 2014)

Algemene procedure voor genoverdracht via sonoporatie in plantencellen

1. Voorbereiding van genetisch materiaal: Begin met het voorbereiden van het genetische materiaal dat u in de plantencellen wilt inbrengen. Dit kan plasmide-DNA, RNA of andere nucleïnezuren zijn.
2. Isolatie van plantencellen: Isoleer de plantencellen waarop u zich wilt richten. Afhankelijk van uw experiment kunnen deze cellen uit plantenweefsels of culturen worden geïsoleerd.
3. Celsuspensie: Suspendeer de plantencellen in een geschikt medium of een geschikte buffer. Dit is essentieel om ervoor te zorgen dat de cellen gezond zijn en zich in een toestand bevinden die genopname bevordert.
4. Uw sonicator instellen: Bereid uw sonicator met sonde voor door sonicatieparameters zoals amplitude, tijd, energie en temperatuur vooraf in te stellen. Dompel de ultrasone sonde onder in de celsuspensie.
5. Sonicatie: Start de sonicatieprocedure. De snelle oscillatie van de sondetip genereert cavitatiebellen in de vloeistof. Deze bellen zetten uit en imploderen door de ultrasone golven, waardoor mechanische krachten en microstromingen in de suspensie ontstaan.
6. Sonoporatie: De door cavitatie gegenereerde mechanische krachten en microstromingen creëren tijdelijke poriën en gaten in de membranen van de plantencellen. Het genetische materiaal in de suspensie kan via deze poriën de plantencellen binnendringen.
7. Incubatie: Incubeer de plantencellen na de sonoporatiebehandeling om ze te laten herstellen en hun membranen te laten stabiliseren. Dit is een cruciale stap om de overleving van de cellen en een succesvolle genoverdracht te waarborgen.

Genoverdracht via Agrobacterium of liposomen

Er zijn twee gangbare manieren om plantencellen te transfecteren. Daarbij wordt Agrobacterium, een geslacht van gramnegatieve bacteriën, of worden liposomen als drager van het genetische materiaal gebruikt.

• Door Agrobacterium gemedieerde sonoporatie: Agrobacterium tumefaciens is een bacterie die vaak wordt gebruikt bij genetische manipulatie van planten. Bij deze methode wordt plasmide-DNA met het gewenste gen in Agrobacterium ingebracht, dat vervolgens met plantencellen wordt gemengd. De celsuspensie wordt met een sonicator met sonde aan sonoporatie onderworpen. De ultrasone energie verbetert de overdracht van het genetische materiaal van Agrobacterium naar de plantencellen. Deze methode wordt veel gebruikt voor de genetische modificatie van planten.
• Door liposomen gemedieerde sonoporatie: Liposomen zijn op lipiden gebaseerde blaasjes die genetisch materiaal kunnen vervoeren. Bij deze methode worden liposomen die met plasmide-DNA of andere nucleïnezuren zijn beladen, met plantencellen gemengd. Sonoporatie met een sonicator met sonde wordt toegepast om de opname van liposomen door plantencellen te vergemakkelijken. Het ultrasone geluid verstoort de lipidendubbellagen van de liposomen, waardoor het genetische materiaal in de plantencellen vrijkomt. Deze aanpak is nuttig voor studies naar tijdelijke genexpressie in plantencellen.

Wetenschappelijk bewezen voordelen van door sonicatie ondersteunde, door Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT)

Door sonicatie ondersteunde, door Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT) is bij talrijke plantensoorten toegepast. Een korte en relatief milde ultrasone behandeling van plantencelculturen veroorzaakt sonoporatie, waardoor Agrobacterium vervolgens als gentransporteur diep kan doordringen. Hieronder kunt u voorbeelden van studies lezen die de gunstige effecten van SAAT aantonen.

Ultrasoon ondersteunde transformatie van ashwagandha

Om de transformatie-efficiëntie bij W. somnifera (bekend als ashwagandha of winterkers) te verbeteren, onderzochten Dehdashti en collega’s (2016) het gebruik van acetosyringon (AS) en sonicatie.
Acetosyringon (AS) werd in drie fasen toegevoegd: aan de vloeibare Agrobacterium-cultuur, tijdens de infectie met Agrobacterium en tijdens de co-cultuur van explantaten met Agrobacterium. De toevoeging van 75 μM AS aan de vloeibare Agrobacterium-cultuur bleek optimaal voor de inductie van vir-genen.
De aanvullende toepassing van sonicatie (SAAT) resulteerde in de hoogste genexpressie. De expressie van het gusA-gen in haarwortels bleek het beste wanneer de bladeren en scheuttoppen gedurende respectievelijk 10 en 20s werden gesoniceerd. De transformatie-efficiëntie van het verbeterde protocol bedroeg respectievelijk 66,5 en 59,5% bij bladexplantaten en explantaten van scheuttoppen. Vergeleken met andere protocollen bleek de transformatie-efficiëntie van dit verbeterde protocol 2,5 maal hoger voor bladeren en 3,7 maal hoger voor scheuttoppen. Southernblotanalyses bevestigden 1–2 kopieën van het gusA-transgen in de lijnen W1-W4, terwijl 1–4 kopieën van het transgen werden aangetoond in lijn W5, die met het verbeterde protocol was gegenereerd.

Effect van de duur van door sonicatie ondersteunde, door Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT) op de transformatiefrequentie van bladexplantaten (a) en explantaten van scheuttoppen (b) van W. somnifera
(studie en afbeelding: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrasoon ondersteunde transformatie van katoen

Hussain et al. (2007) tonen de gunstige effecten van door sonicatie ondersteunde transformatie van katoen aan. Akoestische cavitatie door laagfrequent ultrasoon geluid creëert microwonden op en onder het oppervlak van plantenweefsel (sonoporatie) en stelt Agrobacterium in staat dieper en volledig door het plantenweefsel heen te dringen. Deze wijze van verwonding vergroot de kans op infectie van plantencellen die dieper in het weefsel liggen. Om de transformatie-efficiëntie van SAAT te beoordelen, werd de expressie van het GUS-gen gemeten. Het GUS-reportersysteem is een reportergensysteem dat bijzonder nuttig is in de moleculaire plantenbiologie en microbiologie. Door verschillende SAAT-parameters aan te passen, werd de tijdelijke GUS-expressie in katoen, met rijpe embryo’s als explantaat, aanzienlijk versterkt. GUS werd voor het eerst 24h na incubatie van de explantaten aangetoond en na 48h was de GUS-expressie zeer sterk. Dit diende als een nuttige indicator voor succesvolle transformatie van het katoenexplantaat na door sonicatie ondersteunde, door Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT). Bij de vergelijking van verschillende transformatietechnieken (namelijk biolistische transformatie, Agro, BAAT en SAAT) liet door sonicatie ondersteunde, door Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT) verreweg de beste transformatieresultaten zien.

Keuze van de transformatieprocedure op basis van de tijdelijke expressie van GUS. Door sonicatie ondersteunde, door Agrobacterium gemedieerde transformatie (SAAT) laat een aanzienlijk hogere tijdelijke expressie zien.
(studie en afbeelding: © Hussain et al., 2007)

Ultrasone oplossingen met hoge prestaties voor sonoporatie en SAAT

Hielscher Ultrasonics heeft jarenlange ervaring met de ontwikkeling en productie van ultrasone sonicatoren met hoge prestaties voor laboratoria, onderzoeksfaciliteiten en industriële productie met zeer hoge verwerkingscapaciteiten. Voor microbiologie en biowetenschappen biedt Hielscher verschillende oplossingen om te voldoen aan uiteenlopende eisen voor specifieke weefsels en hun behandelingen. Voor de gelijktijdige ultrasone behandeling van talrijke monsters biedt Hielscher de UIP400MTP voor multiwellplaten, de VialTweeter voor de sonicatie van maximaal 10 monsterflesjes (bijv. Eppendorf-buisjes) of de ultrasone CupHorn. Ultrasone sonicatoren met sonde hebben vermogens van 50 tot 400 watt voor laboratoriumhomogenisatoren en van 500 watt tot 16 kW voor industriële systemen.
Neem contact met ons op en vertel ons over uw toepassing en proceseisen. Onze ervaren medewerkers adviseren u graag over de meest geschikte ultrasone sonicator voor uw biologische proces.
De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasone sonicatoren: