Prouwevirbereedung mat héijem Duerchsaz fir d’mitochondrial Diagnostik
D’mitochondrial Diagnostik an der Fuerschung an a Klinicke gëtt mat verschiddenen Technike wéi Sequenzéierung, PCR a biochemeschen Assayen duerchgefouert. Dës Methode gi benotzt, fir DNA-Mutatiounen z’identifizéieren an d’mitochondrial Funktioun ze moossen. D’Sequenzéierung hëlleft, genetesch Mutatiounen z’erkennen, wärend d’PCR spezifesch DNA-Sequenze quantifizéiere kann. Biochemesch Assaye bewäerten d’Funktionalitéit vu mitochondriale Proteinnen an Enzymen.
D’Diagnostik vu mitochondriale Krankheeten ass besonnesch schwéier wéinst der ausgepräägter klinescher Variabilitéit vun dëse Krankheeten an och wéinst dem komplexen Zesummespill tëscht zwee ënnerschiddlech verierfte Genomer: der mitochondrialer DNA (mtDNA) an dem nukleare Genom.
DNA-Extraktioun a Fragmentéierung duerch Sonikatioun
D’DNA-Extraktioun aus Muskelgeweebe ass besonnesch nëtzlech, wa geweebespezifesch Verännerunge vun der mtDNA vermutt ginn. Dës Verännerunge kéinten Deletioune vun der mtDNA bei chronesch progressiver externer Ophthalmopleegie (CPEO), Punktmutatioune vun der mtDNA bei mitochondriale Myopathien oder eng Depletioun vun der mtDNA beim Alpers-Syndrom ëmfaassen. D’DNA, déi aus Muskelgeweebe extrahéiert gëtt, kann duerno fir verschidde genetesch Tester benotzt ginn, wéi Southern-Blot a Laangstrecke-PCR fir Deletiounen, Echtzäit-PCR fir Depletioun oder Sequenzéierung fir Punktmutatiounen.
D’Sonikatioun, bei där intensiv Ultraschallwelle benotzt ginn, gëtt fir verschidden Uwendungen an der mitochondrialer Diagnostik agesat. Si gëtt benotzt, fir Zellen ze lyséieren an esou intrazellulär Bestanddeeler wéi Mitochondrien an DNA ze extrahéieren, fir DNA wéi mtDNA an nDNA duerch Schéierkräfte fir d’Sequenzéierung ze fragmentéieren a fir Prouwen ze homogeniséieren.
UIP400MTP Plackesonikator fir d’Prouwevirbereedung mat héijem Duerchsaz behandelt Prouwen a Multiwell- an 96-Well-Placke gläichméisseg mat Ultraschall
Wéi Mitochondrien aus Zellen a Geweeben isoléiert ginn
D’Isolatioun vu Mitochondrien ëmfaasst zwee wesentlech Schrëtt: d’Opbrieche vun Zellen, fir hiren Inhalt fräizesetzen, an den Asaz vun differenzieller Zentrifugatioun, fir mitochondrial Fraktiounen ze trennen an ze gewannen.
Sonikatioun
Hielscher Sonikatore si mat Standard-Lysepufferen a Kits kompatibel, soudatt si fir d’Isolatioun vu Mitochondrie gëeegent sinn. D’Sonikatioun erfëllt zwee Haaptzwecker:
- Zelllys: D’Ultraschallwelle briechen d’Zellmembranen op a setzen dobäi intrazellulär Bestanddeeler fräi.
- Opbrieche vu Mitochondrien: D’Sonikatioun an engem uschléissende Schrëtt kann d’Mitochondrien opbriechen, fir mitochondrial Proteinnen oder mitochondrial DNA fräizesetzen.
- mtDNA-Fragmentéierung: D’Sonikatioun ass eng zouverlässeg Technik, fir mitochondrial DNA duerch Schéierkräfte fir d’Sequenzéierung ze fragmentéieren.
De Multiwell-Plackesonikator UIP400MTP erméiglecht d’Virbereedung vu mitochondriale Prouwe mat héijem Prouwenduerchsaz. A Verbindung mat differenzieller Zentrifugatioun verbessert d’Sonikatioun d’Effizienz vun der Mitochondrienisolatioun a garantéiert héich Ausbezuele vun intakte Mitochondrien, déi fir verschidden uschléissend Uwendunge gëeegent sinn.
Hielscher UIP400MTP Multiwell-Plackesonikator funktionéiert mat all Standardplack
De Multiwell-Plackesonikator UIP400MTP bitt vill Virdeeler fir d’Prouwevirbereedung mat héijem Duerchsaz, z. B. an der mitochondrialer Diagnostik.
UIP400MTP Multiwell-Plackesonikator fir d’Prouwevirbereedung mat héijem Duerchsaz an der Biomarkerdiagnostik.
Beispilluweisunge fir d’mtDNA-Fragmentéierung mat Ultraschall
Virbereedung an Extraktioun:
- C57BL/6-Mais goufen duerch zervikal Dislokatioun doutgemaach.
- D’Liewere goufe séier entnommen an an äiskalem sterilem PBS gewäsch.
Isolatioun vu Mitochondrien:
- D’Mitochondrie goufe mat engem 2-mL-Dounce-Geweebehomogenisator an engem Kit fir d’Isolatioun vu Mitochondrien aus Geweebe isoléiert.
- Ufankszentrifugatioun bei 700× g an 3.000× g.
- Féiert zwee zousätzlech Wäschschrëtt mam Puffer C duerch.
DNA-Isolatioun:
- De Pellet aus der éischter Zentrifugatioun bei 700× g gouf benotzt, fir nuklear DNA (nDNA) ze isoléieren.
- D’DNA gouf mat Zentrifugatiounskolonnen isoléiert.
- Mitochondrial DNA (mtDNA) gouf aus isoléierte Mitochondrien extrahéiert.
- Nuklear DNA (nDNA) gouf aus réie Kärtextrakter extrahéiert, béid aus Maisliewergeweebe.
DNA-Fragmentéierung:
- D’DNA gouf op Äis mat engem 30-kHz/50-W-Ultraschallsonikator UP50H mat enger 0,5-mm-Mikrospëtzesonotrod bei 14 μm fir 2 × 30 Sekonne fragmentéiert.
Visualiséierung a Quantifizéierung vun der Fragmentéierung:
- D’Fragmentéierung no der Ultraschallbehandlung gouf op engem 1% Agarosegel mam DNA-Faarfstoff SYBR safe visualiséiert.
- Déi relativ Heefegkeet vu mtDNA an nDNA gouf mat qPCR bestëmmt.
(vgl. Mariero et al., 2019)
Fir d’Prouwevirbereedung mat héijem Duerchsaz erliichtert d’Ultraschallgerät fir Multiwell-Placken UIP400MTP d’Virbereedung vu grousse Proufzuelen a Standardplacke mat 96 Vertéiwungen, Multiwell-Placken a Mikrotiterplacken.
Liest méi iwwer d’Virdeeler vun der Prouwevirbereedung mat héijem Duerchsaz mam UIP400MTP!
Tippe fir eng optimal Isolatioun vu Mitochondrie mat Ultraschall:
- Temperaturkontroll: Féiert all Schrëtt an engem Temperaturberäich vun 0°C bis 4°C duerch. Dëst ass entscheedend, fir d’Integritéit an d’Funktionalitéit vun de Mitochondrien ze erhalen.
- Effizienz a Vitess: Schafft séier a rengegt d’Mitochondrien nëmme sou wäit, wéi et fir Är spezifesch Uwendung néideg ass. Iwwerméisseg Manipulatioun kann zu däitleche Verloschter u mitochondrialem Inhalt féieren.
- Verdënnung vu Suspensiounen: Halt d’Konzentratioune vun den Zell- an Organellesuspensioune wärend dem ganzen Isolatiounsprozess niddereg. Dëst hëlleft, d’Risike vum Aschléissen a vun der Agglutinatioun ze minimiséieren, wouduerch d’Rengheet vun den isoléierte Mitochondrie verbessert gëtt.
- Proufvolumen: Wielt e puer kleng Preparatiounen amplaz vun enger eenzeger grousser. Dës Approche féiert typescherweis zu besseren Ausbezuelen, well eng Vergréisserung vum Moossstaf d’Quantitéit u gewënnbare Mitochondrien net proportional erhéicht. D’Ultraschallgerät fir Multiwell-Placken UIP400MTP erliichtert déi séier an zouverlässeg Zelllys fir d’Isolatioun vu Mitochondrien an och d’Extraktioun vu Proteinnen aus Mitochondrien.
Dës Richtlinne maachen den Isolatiounsprozess mat Ultraschalllys an Zentrifugatioun méi effizient a liwwere qualitativ héichwäerteg Mitochondriepreparatiounen, déi fir uschléissend Uwendunge gëeegent sinn.
Hielscher Ultraschallgeräter – Qualitéit aus Däitschland
Hielscher Ultraschallgeräter si fir hir héchst Qualitéits- an Designstandarde bekannt. Robustheet an einfach Bedéngung erlaben eng reiwungslos Integratioun vun eisen Ultraschallgeräter an industriell Anlagen. Hielscher Ultraschallgeräter komme mat haarde Konditiounen an usprochsvollen Ëmfelder ouni Schwieregkeeten eens.
Hielscher Ultrasonics ass eng ISO-zertifizéiert Entreprise a leet besonnesche Wäert op leeschtungsstaark Ultraschallgeräter mat modernster Technologie a Benotzerfrëndlechkeet. Selbstverständlech sinn Hielscher Ultraschallgeräter CE-konform an erfëllen d’Ufuerderunge vun UL, CSA a RoHs.
Ultraschallgerät fir Placke mat 96 Vertéiwungen UIP400MTP fir d’Ultraschallbehandlung vu Mikrotiter- a Multiwell-Placken
Literatur / Referenzen
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Heefeg gestallte Froen iwwer Mitochondrien a mitochondrial Diagnostik
Wat si Mitochondrien?
Mitochondrie si membrangebonnen Organellen, déi an den Zelle vun de meeschten eukaryoteschen Organisme virkommen. Si sinn als Kraaftwierker vun der Zell bekannt, well si duerch de Prozess vun der Zellootmung Energie a Form vun Adenosintriphosphat (ATP) produzéieren. Ausserdeem hu Mitochondrien hir eegen DNA a spillen eng Schlësselroll an aneren zelluläre Prozesser, dorënner d’Regulatioun vum Zellzyklus a vum Zelldoud.
Wat ënnerscheet mtDNA vu genomescher DNA?
Mitochondrial DNA (mtDNA) ënnerscheet sech a verschiddene wesentleche Punkte vu genomescher DNA (gDNA). MtDNA befënnt sech an de Mitochondrien, ass kreesfërmeg a gëtt iwwer d’Mamm verierft, wärend gDNA sech am Zellkär befënnt, linear ass a vu béiden Elterendeeler verierft gëtt. MtDNA ass vill méi kleng a kodéiert nëmme fir 37 Genen, wärend gDNA ongeféier 20.000–25.000 Genen enthält. MtDNA ass a méi Kopië pro Zell present, huet eng méi héich Mutatiounsquot a kodéiert haaptsächlech fir Proteinnen, déi un der mitochondrialer Funktioun bedeelegt sinn. Am Géigesaz dozou ass gDNA typescherweis diploid, huet eng méi niddereg Mutatiounsquot a kodéiert fir eng grouss Villfalt u Genen, déi fir d’Entwécklung an d’Funktioun vum Organismus néideg sinn. Ausserdeem fannen d’Transkriptioun an d’Translatioun vun der mtDNA bannent de Mitochondrie statt, wärend d’Transkriptioun vun der gDNA am Zellkär stattfënnt an d’Translatioun am Zytoplasma stattfënnt. Dës Ënnerscheeder spigelen hir ënnerschiddlech Rollen an hir evolutiv Originn erëm.
Wat ass en zellfräien Extrait?
En zellfräien Extrait ass eng Léisung, déi den Inhalt vu lyséierten Zellen enthält, dorënner Proteinnen, Nukleinsaieren an aner zellulär Komponenten, awer keng intakt Zellmembranen. Dësen Extrait gëtt an der biochemescher a molekularbiologescher Fuerschung benotzt, fir zellulär Prozesser in vitro z’ënnersichen, soudatt Fuerscher Reaktiounen a Mechanismen ausserhalb vu liewegen Zellen analyséiere kënnen.
Wéi eng Roll spille PCR-Tester an der mitochondrialer Diagnostik?
PCR-Tester spillen eng entscheedend Roll an der mitochondrialer Diagnostik, well si den Nowäis vu Mutatiounen, Deletiounen oder Variatioune vun der Kopienzuel an der mitochondrialer DNA (mtDNA) erméiglechen. Si erlaben d’Amplifikatioun vu spezifesche mtDNA-Regiounen, fir pathogen Varianten z’identifizéieren, déi mat mitochondriale Krankheeten a Verbindung stinn. PCR-baséiert Techniken, wéi quantitativ PCR (qPCR) a Laangstrecke-PCR, ginn och benotzt, fir d’Integritéit vun der mtDNA, d’Heteroplasmie-Niveauen an d’mtDNA-Depletioun ze beurteelen, a liwweren domat wesentlech Erkenntnisser iwwer mitochondrial Funktioun a Krankheeten.
Léiert, wéi den UIP400MTP Ultraschallapparat fir Mikroplacke PCR-Tester an Assayen erliichtert!
Wat ass differentiell Zentrifugatioun?
Differentiell Zentrifugatioun ass eng wäit verbreet Technik fir d’Zellfraktionéierung an d’Isolatioun vu Mitochondrien. Dës Method trennt zellulär Strukturen op Basis vun hirem Sedimentatiounskoeffizient, dee souwuel vun der Dicht wéi och vun der Form ofhänkt. Dobäi gi Prouwen a gepufferte Salzléisunge mat spezifeschen Dichte mat ënnerschiddlech staarken Zentrifugalkräfte behandelt. Strukture mat änleche Sedimentatiounskoeffiziente setze sech zur selwechter Zäit um Buedem vum Sammelréierchen of, soudatt si zeréckgewonne kënne ginn.
Wéi gëtt differentiell Zentrifugatioun fir d’Isolatioun vu Mitochondrien agesat?
Differentiell Zentrifugatioun erméiglecht et Fuerscher, mitochondrial Fraktiounen effektiv vun aneren zelluläre Komponenten ze trennen. D’Isolatioun vu Mitochondrien ëmfaasst verschidden Zentrifugatiounsschrëtt an d’uschléissend Zeréckgewënnung vum Isolat.
Éischt Zentrifugatioun: Went eng niddreg Zentrifugalkraaft un, fir grouss Zellreschter an Zellkären ze sedimentéieren.
Uschléissend Zentrifugatiounen: Erhéicht d’Zentrifugalkraaft schrëttweis, fir Fraktiounen, déi mat Mitochondrien ugeräichert sinn, als Pellet ofzesetzen. All Zentrifugatiounsschrëtt hëlt Strukture mat ëmmer méi héije Sedimentatiounskoeffizienten ewech.
Zeréckgewënnung vun de Fraktiounen: No all Zentrifugatioun gëtt de Pellet gesammelt, an den Iwwerstand gëtt méi héije g-Kräften ausgesat, fir déi nächst Fraktioun z’isoléieren. Dëst gëtt widderholl, bis déi gewënscht Rengheet vun de Mitochondrien erreecht ass.