High-Throughput Sample Virbereedung fir Mitochondrial Diagnostik
Mitochondrial Diagnostik a Fuerschung a Kliniken gi mat verschiddenen Techniken ausgefouert wéi Sequenzéierung, PCR a biochemesch Assays. Dës Methode gi benotzt fir DNA Mutatiounen z'identifizéieren an d'Mitochondrialfunktioun ze moossen. Sequencing hëlleft genetesch Mutatiounen z'entdecken, während PCR spezifesch DNA Sequenzen kann quantifizéieren. Biochemesch Assays evaluéieren d'Funktionalitéit vu mitochondriale Proteinen an Enzymen.
D'Diagnostik vu mitochondriale Krankheeten ass besonnesch schwéier wéinst der ausgeprägter klinescher Variabilitéit vun dëse Krankheeten wéi och wéinst der komplexer Interaktioun tëscht zwee ënnerschiddlech ierfleche Genomen: mitochondrial DNA (mtDNA) an dem Nukleargenom.
DNA Extraktioun a Fragmentatioun mat Sonication
DNA Extraktioun aus Muskelgewebe ass besonnesch nëtzlech wann Tissue-spezifesch Ännerungen am mtDNA verdächtegt ginn. Dës Ännerunge kënnen d'Läschunge vu mtDNA bei chronescher progressiver externer Ophthalmoplegie (CPEO), Punktmutatiounen vu mtDNA bei mitochondrialen Myopathien, oder Ausschöpfung vum mtDNA am Alpers Syndrom enthalen. D'DNA, déi aus Muskelgewebe extrahéiert gëtt, kann dann fir verschidde genetesch Tester benotzt ginn, sou wéi Southern Blot a Wäitschoss PCR fir Läschen, Echtzäit PCR fir Ausschnëtter oder Sequenzéierung fir Punktmutatiounen.
Sonication, mat intensiven Ultraschallwellen, gëtt fir verschidde Applikatiounen an der Mitochondrial Diagnostik applizéiert. Et gëtt benotzt fir Zellen ze lyséieren fir intrazellulär Inhalter wéi Mitochondrien an DNA ze extrahieren, fir DNA wéi mtDNA an nDNA ze schneiden fir Sequenzéierung, a Proben ze homogeniséieren.
UIP400MTP Plate Sonicator fir High-Throughput Probe Virbereedung eenheetlech sonicates Echantillon an Multi-Well an 96-Well Placke
Wéi Mitochondrien aus Zellen a Tissue isoléieren
Mitochondrial Isolatioun ëmfaasst zwee wesentlech Schrëtt: Zellen ze stéieren fir hiren Inhalt ze befreien, an Differential Zentrifugatioun ze benotzen fir Mitochondrial Fraktiounen ze trennen an ze recuperéieren.
sonication
Hielscher Sonicators si kompatibel mat Standard Lysis Puffer a Kits, sou datt se gëeegent sinn fir d'Isolatioun vu Mitochondrien. Sonication déngt zwee Haaptzwecker:
- Zell Lysis: D'Ultraschallwellen stéieren Zellmembranen, befreien intrazellulär Inhalter.
- Mitochondrial Stéierungen: Sonication an engem spéideren Schrëtt kann d'Mitochondrien opbriechen fir mitochondrial Proteinen oder Mitochondrial DNA ze befreien.
- mtDNA Fragmentatioun: Sonication ass eng zouverlässeg Technik fir mitochondrial DNA fir Sequenzéierung ze schneiden.
De Multi-Well Platte-Sonicator UIP400MTP erlaabt High-Throughput Probe Virbereedung vu Mitochondriale Proben. A Verbindung mat Differential Zentrifugéierung verbessert d'Sonicatioun d'Effizienz vun der mitochondrialer Isolatioun, fir héich Ausbezuelen vun intakte Mitochondrien ze garantéieren gëeegent fir verschidde Downstream Uwendungen.
Hielscher UIP400MTP Multiwell Platte Sonicator Wierker mat all Standard Plack
De Multi-Well Plate Sonicator UIP400MTP bitt vill Virdeeler fir High-Throughput Probe Virbereedung, zB an der Mitochondrial Diagnostik.
UIP400MTP Multiwell Plate Sonicator fir High-Throughput Probe Virbereedung an Biomarker Diagnostik.
Exemplaresch Instruktioune fir Ultraschall mtDNA Fragmentatioun
Virbereedung an Extraktioun:
- C57BL /6 Mais goufen duerch Gebärmutterhëllef ëmbruecht.
- Liewer goufen séier extrahéiert an an äiskal steril PBS gewäsch.
Mitochondrien Isolatioun:
- Mitochondrien goufen isoléiert mat engem 2-ml Dounce Tissue Grinder an engem Mitochondrien Isolatioun Kit fir Tissue.
- Éischt Zentrifugéierung bei 700 × g an 3.000 × g.
- Maacht zwee zousätzlech Wäschstufen mat Puffer C.
DNA Isolatioun:
- De Pellet vun der éischter Zentrifugéierung bei 700 × g gouf benotzt fir nuklear DNA (nDNA) ze isoléieren.
- DNA gouf isoléiert mat Spin Sailen.
- Mitochondrial DNA (mtDNA) gouf aus isoléierten Mitochondrien extrahéiert.
- Nuklear DNA (nDNA) gouf aus rauem nuklearen Extrakten extrahéiert, souwuel aus Mais Liewergewebe.
DNA Fragmentatioun:
- DNA gouf op Äis fragmentéiert mat engem 30-kHz / 50-W Ultraschall-Sonicator UP50H mat enger 0.5-mm Mikro-Tipp Sonotrode bei 14 μm fir 2 × 30 Sekonnen.
Fragmentatioun Visualiséierung a Quantifikatioun:
- Fragmentatioun no ultrasonification war op engem 1% agarose gelies mat SYBR sécher DNA Dye visualized.
- D'relativ Heefegkeet vun mtDNA an nDNA war vun qPCR ermëttelt.
(cf. Mariero et al., 2019)
Fir High-Throughput Probe Virbereedung erliichtert de Multi-Well Platte Sonicator UIP400MTP d'Virbereedung vu grousse Probezuelen an Standard 96-Well, Multi-Well a Mikrotiter Placken.
Liest méi iwwer d'Virdeeler vun der High-Throughput Probe Prep mat der UIP400MTP!
Tipps fir Optimal Mitochondrien Isolatioun Mat Sonication:
- Temperatur Kontroll: Fëllt all Schrëtt bei engem Temperaturbereich vun 0°C bis 4°C. Dëst ass kritesch fir d'Integritéit an d'Funktionalitéit vun de Mitochondrien z'erhalen.
- Effizienz a Geschwindegkeet: Schafft séier a purifizéiert d'Mitochondrien nëmmen am Ausmooss erfuerderlech fir Är spezifesch Uwendung. Exzessiv Manipulatioun kann zu bedeitende Verloschter vum mitochondrialen Inhalt féieren.
- Verdünnung vun Suspensionen: Erhalen niddereg Konzentratioune vun Zell an Organelle Suspensioune ganze Isolatioun Prozess. Dëst hëlleft fir d'Risike vu Fallen an Agglutinatioun ze minimiséieren, an doduerch d'Rengheet vun den isoléierten Mitochondrien ze verbesseren.
- Sample Volume: Wielt méi kleng Virbereedungen anstatt eng eenzeg grouss. Dës Approche resultéiert typesch zu besseren Ausbezuelen, well d'Skaléierung net proportional d'Quantitéit vun erhuelbare Mitochondrien erhéicht. De Multi-Well Platte Sonicator UIP400MTP erliichtert déi séier an zouverlässeg Lysis vun Zelle fir Mitochondrien Isolatioun souwéi d'Protein Extraktioun aus Mitochondrien.
Dës Richtlinnen wäerten den Isolatiounsprozess mat Ultraschalllysis an Zentrifugéierung méi effizient maachen, wat héichqualitativ mitochondrial Virbereedunge gëeegent fir Downstream Uwendungen erliewt.
Hielscher Sonicators – Qualitéit Made in Germany
Hielscher Ultraschaller si bekannt fir hir héchst Qualitéit an Designnormen. Robustheet an einfach Operatioun erlaben déi glat Integratioun vun eisen Ultraschaller an industriellen Ariichtungen. Rau Konditiounen an erfuerderlech Ëmfeld ginn einfach vun Hielscher Ultraschaller gehandhabt.
Hielscher Ultrasonics ass eng ISO zertifizéiert Firma a setzt spezielle Wäert op High-Performance Ultrasonicatoren mat modernste Technologie a Benotzerfrëndlechkeet. Natierlech sinn Hielscher Ultraschaller CE konform an entspriechen d'Ufuerderunge vun UL, CSA a RoHs.
96-Well Platen Sonicator UIP400MTP fir d'Sonicatioun vu Mikrotiter a Multiwell Placken
Literatur / Referenzen
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- UIP400MTP-Multi-well-Plate-Sonicator-Infographic
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Heefeg gestallte Froen iwwer Mitochondrien a Mitochondrial Diagnostik
Wat sinn Mitochondrien?
Mitochondrien si Membrangebonnen Organelle, déi an den Zellen vun de meescht eukaryoteschen Organismen fonnt ginn. Si sinn als Kraaftwierker vun der Zell bekannt well se Energie produzéieren a Form vun Adenosin Triphosphat (ATP) duerch de Prozess vun der cellulärer Atmung. Zousätzlech hunn d'Mitochondrien hir eege DNA a spillen Schlësselrollen an anere celluläre Prozesser, dorënner d'Reguléierung vum Zellzyklus an Zell Doud.
Wat ënnerscheet mtDNA vu Genomesch DNA?
Mitochondrial DNA (mtDNA) ënnerscheet sech vun genomesch DNA (gDNA) op verschidde Schlëssel Weeër. MtDNA ass an der Mitochondrien lokaliséiert, ass kreesfërmeg, an ass maternal ierflecher, wärend gDNA am Zellkär läit, linear ass, a gëtt vu béiden Elteren ierflecher. MtDNA ass vill méi kleng, kodéiert nëmme 37 Genen, wärend gDNA ongeféier 20,000-25,000 Genen enthält. MtDNA ass präsent a multiple Exemplare pro Zell, huet e méi héije Mutatiounsquote, a codéiert haaptsächlech fir Proteinen, déi an der Mitochondrialfunktioun involvéiert sinn. Am Géigesaz, gDNA ass typesch diploid, huet e méi nidderegen Mutatiounsquote, a codéiert eng grouss Gamme vu Genen déi néideg sinn fir d'Entwécklung an d'Funktioun vum Organismus. Zousätzlech geschitt mtDNA Transkriptioun an Iwwersetzung bannent der Mitochondrien, wärend gDNA Transkriptioun am Kär geschitt, an Iwwersetzung geschitt am Zytoplasma. Dës Differenzen reflektéieren hir ënnerschiddlech Rollen an evolutiver Hierkonft.
Wat ass Zell-gratis Extrakt?
En zellfräien Extrakt ass eng Léisung déi den Inhalt vu lyséierten Zellen enthält, dorënner Proteinen, Nukleinsäuren an aner cellulär Komponenten, awer ouni intakt Zellmembranen. Dësen Extrakt gëtt an der biochemescher a molekulare Biologiefuerschung benotzt fir cellulär Prozesser in vitro ze studéieren, wat d'Fuerscher et erméiglecht Reaktiounen a Mechanismen ausserhalb vu liewegen Zellen ze analyséieren.
Wéi eng Roll spillen PCR Tester an der Mitochondrial Diagnostik?
PCR Tester spillen eng kritesch Roll an der Mitochondrial Diagnostik andeems d'Detektioun vu Mutatiounen, Läschen oder Kopie Zuel Variatiounen an der Mitochondrial DNA (mtDNA) erméiglechen. Si erlaben d'Verstäerkung vu spezifesche mtDNA Regiounen fir pathogene Varianten ze identifizéieren, déi mat Mitochondriale Stéierunge verbonne sinn. PCR-baséiert Techniken, wéi quantitative PCR (qPCR) a laangfristeg PCR, ginn och benotzt fir mtDNA Integritéit, Heteroplasmyniveauen a mtDNA Ausschöpfung ze bewäerten, déi wesentlech Abléck an d'Mitochondrialfunktioun a Krankheet ubidden.
Léiert wéi den UIP400MTP Microplate Sonicator PCR Tester an Assays erliichtert!
Wat ass Differential Zentrifusioun?
Differential Zentrifugatioun ass eng wäit benotzt Technik fir Zellfraktionéierung a Mitochondrial Isolatioun. Dës Method trennt cellulär Strukturen op Basis vun hirem Sedimentatiounskoeffizient, wat souwuel vu Dicht a Form hänkt. De Prozess involvéiert d'Uwendung vu variéierten Zentrifugalkraaftniveauen op Proben a gebufferten Salzléisungen mat spezifesche Dicht. Strukture mat ähnlechen Sedimentatiounskoeffizienten wäerte sech gläichzäiteg um Enn vum Sammelröhre nidderloossen, wat hir Erhuelung erlaabt.
Wéi gëtt Differential Zentrifugatioun fir Mitochondrien Isolatioun benotzt?
Differential Zentrifugatioun erlaabt d'Fuerscher effektiv mitochondrial Fraktiounen vun aneren Zellkomponenten ze trennen. Isolatioun vu Mitochondrien beinhalt e puer Zentrifugéierungsschrëtt an déi spéider Erhuelung vum Isolat.
Ufanks Zentrifusioun: Fëllt eng geréng Zentrifugalkraaft un fir grouss cellulär Debris a Käre ze sedimentéieren.
Folgend Zentrifugerungen: Erhéije d'Zentrifugalkraaft stepwise fir Pelletfraktiounen beräichert mat Mitochondrien. All Zentrifugéierungsschrëtt läscht Strukture mat progressiv méi héije Sedimentatiounskoeffizienten.
Fraktioun Erhuelung: No all Zentrifugéierung gëtt de Pellet gesammelt, an de Supernatant gëtt u méi héije G-Kräfte ënnerworf fir déi nächst Fraktioun ze isoléieren. Dëst gëtt widderholl bis déi gewënscht Rengheet vu Mitochondrien erreecht gëtt.