Sonikasi Mikroplate dalam Proteomika Shotgun – Catatan Aplikasi

Proteomika Shotgun bergantung pada persiapan sampel yang efisien dan dapat direproduksi untuk mengubah bahan biologis yang kompleks menjadi peptida yang siap dianalisis dengan LC-MS/MS. Sonicator pelat mikro UIP400MTP mendukung proses ini dengan memungkinkan sonikasi terstandarisasi dan paralel pada sampel bervolume kecil, sehingga membantu laboratorium meningkatkan proses penghancuran, ekstraksi, dan resolubilisasi dalam alur kerja berbasis pelat mikro. Catatan aplikasi ini menjelaskan bagaimana UIP400MTP dapat diintegrasikan ke dalam persiapan sampel proteomik, dengan menggunakan alur kerja vesikel ekstraseluler yang telah dipublikasikan dari studi PLA2G12A/Th17 sebagai contoh yang telah diuji di laboratorium.

Sonikasi Mikroplate untuk Proteomika Shotgun yang Lebih Dapat Direproduksi

Bagi para peneliti proteomik, persiapan sampel yang dapat direproduksi sangat penting untuk memperoleh data LC-MS/MS berkualitas tinggi. Sonicator pelat mikro UIP400MTP mendukung proses sonikasi yang terstandarisasi dan paralel dalam alur kerja berbasis pelat serta alur kerja bervolume kecil/berkapasitas tinggi.

Hal ini sangat berguna bagi laboratorium yang menangani:

• Kumpulan sampel dalam jumlah besar yang memerlukan pemrosesan yang konsisten di banyak sumur
• Bahan dengan jumlah sampel terbatas, di mana kehilangan sampel dan variabilitas harus diminimalkan
• Sampel yang kaya akan lipid, seperti vesikel ekstraseluler
• Sediaan biologis kompleks yang memerlukan proses penghancuran, ekstraksi, atau resolubilisasi yang efisien
• Proteomika shotgun komparatif, di mana reproduktibilitas di berbagai kondisi dan replikasi sangat penting

Dengan mengintegrasikan sonikasi mikroplate sebelum proses pencernaan, para peneliti dapat meningkatkan kesiapan sampel untuk:

• Ekstraksi dan resolubilisasi protein
• Pencernaan dengan tripsin/Lys-C
• Pengambilan data Nano-LC/MS/MS
• Analisis proteomika hilir kuantitatif

 

Tingkatkan skala persiapan sampel proteomik Anda dengan percaya diri!
Pelajari bagaimana sonikasi mikroplate membantu mengurangi variabilitas akibat proses manual, meningkatkan pemecahan sampel, dan mempersiapkan sampel biologis yang kompleks untuk analisis LC-MS/MS yang andal.

Permintaan Informasi


Alamat email (wajib)


Produk atau Interes



Saya setuju dengan Kebijakan Privasi









Minta informasi

Penggunaan sonikasi pada mikroplate dapat memberikan manfaat sebagai berikut:

• Fasilitas inti proteomik
• Laboratorium penelitian kendaraan listrik
• Laboratorium imunologi dan biologi sel
• Kelompok penelitian terapan
• Tim di bidang ilmu hayati yang mengembangkan alur kerja mulai dari persiapan sampel tunggal hingga alur kerja dengan kapasitas pemrosesan yang lebih tinggi

Persiapan Sampel Berkapasitas Tinggi untuk Analisis Proteom Vesikel Ekstraseluler

Apa itu Proteomika Shotgun?

Proteomika shotgun telah menjadi strategi analitis utama untuk mengkarakterisasi sampel biologis yang kompleks, mulai dari lisat sel utuh dan ekstrak jaringan hingga organel yang dimurnikan, vesikel ekstraseluler, dan spesimen klinis dengan jumlah sampel yang sedikit. Kekuatan utamanya terletak pada integrasi antara pencernaan protein, kromatografi cair resolusi tinggi-spektrometri massa tandem, dan inferensi peptida-ke-protein secara komputasional. Namun, kualitas dataset proteom akhir sudah ditentukan jauh sebelum sampel mencapai spektrometer massa. Penghancuran sampel yang efisien, solubilisasi protein, penghilangan zat pengganggu, pencernaan enzimatik yang dapat direproduksi, dan pemulihan peptida yang andal semuanya sangat menentukan kedalaman cakupan dan keandalan kuantitatif.
Bagi para peneliti proteomik dan laboratorium ilmu hayati yang bekerja dengan sampel yang terbatas atau langka, persiapan sampel sering kali menjadi kendala utama.

Tantangan Vesikel Ekstraseluler dalam Proteomika

Vesikel ekstraseluler (EV), misalnya, merupakan jenis sampel yang sangat menantang. Vesikel ini berupa partikel berskala nano yang dilapisi membran dan kaya akan lipid, dengan hasil protein yang relatif rendah serta potensi tinggi terjadinya kontaminasi silang oleh lipid, garam, deterjen, protein serum, dan komponen matriks lainnya. Ciri-ciri ini dapat mengganggu efisiensi pencernaan, kinerja kromatografi, stabilitas elektrospray, dan identifikasi peptida. Oleh karena itu, alur kerja persiapan untuk proteomik EV harus cukup kuat untuk menghancurkan struktur vesikel dan melarutkan muatan protein, sekaligus tetap kompatibel dengan pencernaan enzimatik hilir dan analisis LC-MS/MS.
Dalam konteks ini, ultrasonikasi yang kompatibel dengan pelat mikro menawarkan pendekatan praktis untuk pemrosesan sampel yang dapat direproduksi dan dilakukan secara paralel. Model sonikator pelat mikro Hielscher UIP400MTP (400 W) dan UIP550MTP (550 W) dirancang untuk sonikasi sampel dalam pelat multi-sumur dan wadah berukuran kecil, sehingga mendukung alur kerja dengan throughput yang lebih tinggi dibandingkan sonikator probe tunggal konvensional. Bagi laboratorium proteomik, format ini menarik karena dapat mengurangi variabilitas akibat intervensi manual, meningkatkan pemrosesan paralel terhadap banyak sampel, dan terintegrasi secara lebih alami ke dalam alur kerja persiapan sampel berbasis pelat.

Alur Kerja yang Menjadi Teladan

Alur kerja proteomik vesikel ekstraseluler terbaru dalam biologi sel Th17 yang dipicu oleh PLA2G12A memberikan contoh yang berguna dan telah teruji di laboratorium mengenai bagaimana sonikator pelat mikro UIP400MTP dapat diintegrasikan ke dalam persiapan sampel proteomik shotgun. Dalam rangkaian studi tersebut, sampel vesikel ekstraseluler (EV) diproses untuk analisis proteomik menggunakan perlakuan metanol, sonikasi dengan UIP400MTP, sentrifugasi, pengeringan, pencernaan dengan tripsin/Lys-C, serta kromatografi cair aliran nano (nano-flow LC) yang dipadukan dengan spektrometri massa tandem resolusi tinggi. Penelitian biologis yang sama pertama kali dilaporkan sebagai preprint bioRxiv dan kemudian diterbitkan di *Cell Reports*, di mana analisis proteomik tersebut membantu mengkarakterisasi bagaimana PLA2G12A mengubah protein muatan EV dalam konteks respons sel T patogenik.

Sonicator pelat multi-sumur UIP400MTP

Mengapa menggunakan sonikasi mikroplate?
UIP400MTP memungkinkan sonikasi paralel yang terstandarisasi pada sampel bervolume kecil. Hal ini berguna ketika reproduibilitas, penggunaan sampel dalam jumlah sedikit, dan kapasitas pemrosesan multi-sampel menjadi hal yang penting.

Daftar Periksa Pengendalian Mutu

• Pastikan jumlah protein EV yang setara pada semua sampel sama.
• Gunakan tata letak pemrosesan sampel yang diacak atau seimbang.
• Pastikan volume metanol, waktu sonikasi, waktu pengeringan, dan volume pencernaan tetap konsisten.
• Pantau hasil peptida dan identifikasi protein total.
• Periksa tingkat pemotongan yang terlewat dan distribusi panjang peptida.
• Periksa bentuk puncak kromatografi dan reproduibilitas waktu retensi.
• Sertakan kolom kosong untuk memantau sisa.
• Gunakan sampel QC gabungan untuk penelitian berskala lebih besar.
• Evaluasi koefisien variasi replikasi.
• Gunakan PCA atau metode terkait untuk mengidentifikasi efek batch atau sampel yang menyimpang.

Rekomendasi Penyusunan Notulen

Saat mempublikasikan atau mendokumentasikan alur kerja ini, cantumkan jumlah masukan EV, format pelat, volume metanol, amplitudo dan waktu sonikasi UIP400MTP, kondisi sentrifugasi, metode pengeringan, larutan pencernaan, konsentrasi enzim, waktu pencernaan, kondisi pengasaman, platform LC-MS/MS, mode akuisisi, versi perangkat lunak, basis data, ambang batas FDR, metode normalisasi, serta alur kerja statistik.
Semua alat sonikasi mikroplate Hielscher secara otomatis mencatat parameter proses penting seperti amplitudo, durasi sonikasi, dan suhu—bersama dengan cap tanggal dan waktu—dalam bentuk berkas CSV di kartu SD terintegrasi. Pencatatan data untuk reproduibilitas dan pengendalian mutu kini lebih mudah dari sebelumnya!

Studi Secara Mendalam: Proteomika EV Shotgun dalam Studi PLA2G12A

Studi PLA2G12A memberikan contoh konkret penggunaan UIP400MTP dalam alur kerja proteomika shotgun. Pertanyaan biologis yang diangkat adalah bagaimana fosfolipase yang disekresikan, PLA2G12A, memodifikasi vesikel ekstraseluler yang berasal dari sel Th17 dan dengan demikian memengaruhi diferensiasi sel T patogenik. Para penulis menunjukkan bahwa PLA2G12A bekerja pada membran vesikel ekstraseluler (EV) untuk menghasilkan lisofosfolipid, termasuk 1-oleoil-lisofosfatidiletanolamin, dan bahwa sinyal asam lisofosfatidat hilir melalui LPA2 berkontribusi pada diferensiasi sel Th17. Selain sinyal lipid, penelitian ini juga meneliti muatan vesikel ekstraseluler (EV), termasuk kandungan RNA dan protein, sehingga proteomika shotgun menjadi komponen penting dalam strategi karakterisasi.
Dalam alur kerja persiapan EV, sel Th17 dikultur dalam medium yang mengandung serum janin sapi yang telah dihilangkan eksosomnya. Supernatant kultur terlebih dahulu disentrifugasi untuk menghilangkan sel, disaring melalui filter 0,22 µm, dipekatkan melalui ultrafiltrasi/ultracentrifugasi, dicuci, disuspensi ulang dalam PBS, dan diukur kuantitasnya menggunakan uji protein BCA. Persiapan EV hulu ini memastikan bahwa jumlah bahan EV yang setara dengan protein tertentu dapat dimasukkan ke dalam alur kerja proteomik.
Untuk analisis proteomik shotgun, para penulis menggunakan sampel EV yang setara dengan 5 µg protein. Sampel-sampel ini dikeringkan dalam tabung PCR, lalu ditambahkan 25 µL metanol. Sampel-sampel tersebut kemudian disonikasi selama 3 menit menggunakan sonikator mikroplate UIP400MTP. Setelah sonikasi, sampel disentrifugasi pada 4°C selama 20 menit pada 19.000 × g. Setelah 20 µL supernatan dibuang, sampel disentrifugasi hingga kering. Protein kemudian dilarutkan melalui sonikasi dalam 4 µL larutan tripsin/Lys-C dengan konsentrasi 100 ng/µL dalam larutan amonium bikarbonat 50 mM. Proses pencernaan dilakukan selama 2 jam pada 37°C dengan pengocokan pada 300 rpm. Hasil pencernaan diasamkan dengan 1 µL asam trifluoroasetat 1,25% dan dianalisis menggunakan kromatografi cair aliran nano (nano-flow LC) dengan spektrometri massa tandem resolusi tinggi.
Alur kerja ini menyoroti beberapa prinsip berguna untuk proteomika EV dengan input rendah. Pertama, input dinormalisasi berdasarkan setara protein, yang penting saat membandingkan EV dari genotipe atau perlakuan yang berbeda. Kedua, metanol digunakan sebelum sonikasi, yang mendukung proses pemecahan dan ekstraksi sekaligus menghindari penggunaan sistem deterjen yang dapat mempersulit analisis LC-MS/MS. Ketiga, langkah sonikasi dilakukan secara singkat dan terstandarisasi, sehingga sesuai untuk pemrosesan sampel secara paralel. Keempat, pencernaan dengan tripsin/Lys-C dilakukan dalam volume yang sangat kecil, sehingga mengurangi pengenceran dan mendukung pemulihan peptida dengan input rendah. Terakhir, transisi langsung dari pencernaan ke pengasaman dan LC-MS/MS meminimalkan langkah-langkah penanganan yang tidak perlu.
Metode LC-MS/MS hilir yang digunakan memanfaatkan pemisahan fase terbalik dengan aliran nano yang dipadukan dengan spektrometer massa Q-Exactive HF Orbitrap. Sampel ditangkap pada kolom pra-analisis C18, kemudian dipisahkan pada kolom analitik berdiameter dalam 50 µm dengan laju aliran 200 nL/menit dan suhu 40°C. Gradien berjalan dari pelarut organik rendah hingga 35% pelarut B selama 60 menit, diikuti dengan pencucian organik tinggi dan re-ekuilibrasi. Akuisisi MS dilakukan dalam mode ion positif menggunakan akuisisi independen data dengan disosiasi tumbukan berenergi tinggi. File mentah DIA dianalisis menggunakan DIA-NN 1.8 dengan perpustakaan spektrum yang diprediksi secara in silico.