Sonikasi Mikroplat dalam Proteomik Shotgun – Catatan Aplikasi

Proteomik shotgun bergantung pada preparasi sampel yang efisien dan dapat direproduksi untuk mengubah bahan biologis kompleks menjadi peptida yang siap dianalisis dengan LC-MS/MS. Sonikator mikroplat UIP400MTP mendukung proses ini dengan memungkinkan sonikasi sampel bervolume kecil secara terstandar dan paralel, membantu laboratorium meningkatkan disrupsi, ekstraksi, dan pelarutan kembali dalam alur kerja berbasis mikroplat. Catatan aplikasi ini menjelaskan cara mengintegrasikan UIP400MTP ke dalam preparasi sampel proteomik, menggunakan alur kerja vesikel ekstraseluler yang telah dipublikasikan dari studi PLA2G12A/Th17 sebagai contoh yang telah diuji di laboratorium.

Sonikasi Mikroplat untuk Proteomik Shotgun yang Lebih Dapat Direproduksi

Bagi peneliti proteomik, preparasi sampel yang dapat direproduksi sangat penting untuk memperoleh data LC-MS/MS berkualitas tinggi. Sonikator mikroplat UIP400MTP mendukung sonikasi terstandar dan paralel dalam alur kerja berbasis plat serta alur kerja bervolume kecil dengan kapasitas pemrosesan sampel yang tinggi.

Perangkat ini sangat berguna bagi laboratorium yang menangani:

• Kumpulan sampel besar yang memerlukan pemrosesan konsisten di banyak sumur
• Bahan dengan jumlah masukan terbatas, yang kehilangan sampel dan variabilitasnya harus diminimalkan
• Sampel kaya lipid, seperti vesikel ekstraseluler
• Preparat biologis kompleks yang memerlukan disrupsi, ekstraksi, atau pelarutan kembali yang efisien
• Proteomik shotgun komparatif, yang memerlukan reproduksibilitas antar kondisi dan replikat

Dengan mengintegrasikan sonikasi mikroplat sebelum digesti, peneliti dapat meningkatkan kesiapan sampel untuk:

• Ekstraksi dan pelarutan kembali protein
• Digesti tripsin/Lys-C
• Akuisisi Nano-LC/MS/MS
• Analisis proteomik kuantitatif pada tahap hilir

Sonikasi mikroplat dapat bermanfaat bagi:

• Fasilitas inti proteomik
• Laboratorium penelitian EV
• Laboratorium imunologi dan biologi sel
• Kelompok penelitian translasional
• Tim ilmu hayati yang meningkatkan skala dari preparasi sampel tunggal ke alur kerja dengan kapasitas pemrosesan sampel yang lebih tinggi

Preparasi Sampel dengan Kapasitas Pemrosesan yang Tinggi untuk Analisis Proteom Vesikel Ekstraseluler

Apa Itu Proteomik Shotgun?

Proteomik shotgun telah menjadi strategi analitis utama untuk mengarakterisasi sampel biologis kompleks, mulai dari lisat sel utuh dan ekstrak jaringan hingga organel yang dimurnikan, vesikel ekstraseluler, dan spesimen klinis dengan jumlah masukan rendah. Kekuatan utamanya terletak pada penggabungan digesti protein, kromatografi cair–spektrometri massa tandem beresolusi tinggi, dan inferensi komputasional dari peptida ke protein. Namun, kualitas kumpulan data proteom akhir ditentukan jauh sebelum sampel mencapai spektrometer massa. Disrupsi sampel yang efisien, pelarutan protein, penghilangan zat pengganggu, digesti enzimatik yang dapat direproduksi, dan perolehan kembali peptida yang andal semuanya menentukan kedalaman cakupan dan keandalan kuantitatif.
Bagi peneliti proteomik dan laboratorium ilmu hayati yang menangani sampel terbatas atau berharga, preparasi sampel sering menjadi hambatan utama.

Tantangan Vesikel Ekstraseluler dalam Proteomik

Vesikel ekstraseluler (EV), misalnya, merupakan kelas sampel yang sangat menantang. Vesikel ini adalah partikel berskala nano yang diselubungi membran dan kaya lipid, dengan hasil protein yang relatif rendah serta potensi tinggi terbawanya lipid, garam, detergen, protein serum, dan komponen matriks lainnya. Karakteristik ini dapat mengganggu efisiensi digesti, kinerja kromatografi, stabilitas electrospray, dan identifikasi peptida. Oleh karena itu, alur kerja preparasi untuk proteomik EV harus cukup kuat untuk mendisrupsi struktur vesikel dan melarutkan muatan proteinnya, sekaligus tetap kompatibel dengan digesti enzimatik dan analisis LC-MS/MS pada tahap hilir.
Dalam konteks ini, ultrasonikasi yang kompatibel dengan mikroplat menawarkan pendekatan praktis untuk pemrosesan sampel secara paralel yang dapat direproduksi. Model sonikator mikroplat Hielscher UIP400MTP (400 W) dan UIP550MTP (550 W) dirancang untuk sonikasi sampel dalam plat multisumur dan wadah bervolume kecil, mendukung alur kerja dengan kapasitas pemrosesan sampel yang lebih tinggi daripada sonikator probe tunggal konvensional. Bagi laboratorium proteomik, format ini menarik karena dapat mengurangi variabilitas akibat pengerjaan manual, meningkatkan perlakuan paralel terhadap banyak sampel, dan terintegrasi lebih mudah ke dalam rangkaian preparasi sampel berbasis plat.

Contoh Alur Kerja

Alur kerja proteomik vesikel ekstraseluler terkini dalam biologi sel Th17 yang dipengaruhi PLA2G12A memberikan contoh berguna yang telah diuji di laboratorium tentang cara memasukkan sonikator mikroplat UIP400MTP ke dalam preparasi sampel proteomik shotgun. Dalam rangkaian studi tersebut, sampel EV diproses untuk analisis proteom menggunakan perlakuan metanol, sonikasi UIP400MTP, sentrifugasi, pengeringan, digesti tripsin/Lys-C, serta LC aliran nano–MS tandem beresolusi tinggi. Penelitian biologis tersebut dilaporkan pada 2026 oleh Mochizuki-Ono dan rekan-rekannya, dengan analisis proteomik yang membantu mengarakterisasi bagaimana PLA2G12A mengubah protein muatan EV dalam konteks respons sel T patogenik.

Sonikator plat multisumur UIP400MTP

Mengapa sonikasi mikroplat?
UIP400MTP memungkinkan sonikasi terstandar dan paralel untuk sampel bervolume kecil. Hal ini berguna ketika reproduksibilitas, jumlah masukan sampel yang rendah, dan kapasitas pemrosesan banyak sampel menjadi faktor penting.


Daftar Periksa Pengendalian Mutu

• Pastikan jumlah masukan EV setara protein sama untuk semua sampel.
• Gunakan tata letak pemrosesan sampel yang diacak atau diseimbangkan.
• Jaga konsistensi volume metanol, waktu sonikasi, waktu pengeringan, dan volume digesti.
• Pantau hasil peptida dan jumlah total protein yang teridentifikasi.
• Periksa tingkat pemotongan yang terlewat dan distribusi panjang peptida.
• Periksa bentuk puncak kromatografi dan reproduksibilitas waktu retensi.
• Sertakan blanko untuk memantau terbawanya residu.
• Gunakan sampel QC gabungan untuk studi yang lebih besar.
• Evaluasi koefisien variasi replikat.
• Gunakan PCA atau metode terkait untuk mengidentifikasi efek batch atau sampel pencilan.

Rekomendasi Pencatatan

Saat memublikasikan atau mendokumentasikan alur kerja ini, laporkan jumlah masukan EV, format plat, volume metanol, amplitudo dan waktu sonikasi UIP400MTP, kondisi sentrifugasi, metode pengeringan, bufer digesti, konsentrasi enzim, waktu digesti, kondisi pengasaman, platform LC-MS/MS, mode akuisisi, versi perangkat lunak, basis data, ambang FDR, metode normalisasi, dan alur kerja statistik.
Semua sonikator mikroplat Hielscher secara otomatis mencatat parameter proses penting seperti amplitudo, durasi sonikasi, dan suhu beserta cap tanggal dan waktu sebagai berkas CVS pada kartu SD terintegrasi. Pencatatan data untuk reproduksibilitas dan pengendalian mutu belum pernah semudah ini!

Studi secara Terperinci: Proteomik Shotgun EV dalam Studi PLA2G12A

Studi PLA2G12A memberikan contoh konkret penggunaan UIP400MTP dalam alur kerja proteomik shotgun. Pertanyaan biologisnya adalah bagaimana fosfolipase PLA2G12A yang disekresikan memodifikasi vesikel ekstraseluler yang berasal dari sel Th17 dan dengan demikian memengaruhi diferensiasi sel T patogenik. Para penulis menunjukkan bahwa PLA2G12A bekerja pada membran EV untuk menghasilkan lisofosfolipid, termasuk 1-oleoil-lisofosfatidiletanolamina, dan bahwa pensinyalan asam lisofosfatidat pada tahap hilir melalui LPA2 berkontribusi terhadap diferensiasi Th17. Selain pensinyalan lipid, studi-studi tersebut juga memeriksa muatan EV, termasuk kandungan RNA dan protein, sehingga proteomik shotgun menjadi komponen penting dalam strategi karakterisasi.
Dalam alur kerja preparasi EV, sel Th17 dikultur dalam medium yang mengandung serum janin sapi yang telah dikurangi kandungan eksosomnya. Supernatan kultur terlebih dahulu disentrifugasi untuk menghilangkan sel, disaring melalui filter 0,22 µm, dipekatkan melalui ultrafiltrasi/ultrasentrifugasi, dicuci, disuspensikan kembali dalam PBS, dan dikuantifikasi dengan uji protein BCA. Preparasi EV pada tahap hulu ini memastikan bahwa bahan EV dalam jumlah setara protein yang telah ditentukan dapat dimasukkan ke dalam alur kerja proteomik.
Untuk analisis proteomik shotgun, para penulis menggunakan sampel EV yang setara dengan 5 µg protein. Sampel ini dikeringkan dalam tabung PCR, lalu ditambahkan 25 µL metanol. Sampel kemudian disonikasi selama 3 menit menggunakan sonikator mikroplat UIP400MTP. Setelah sonikasi, sampel disentrifugasi pada 4°C selama 20 menit pada 19.000 × g. Setelah 20 µL supernatan dikeluarkan, sampel disentrifugasi hingga kering. Protein kemudian dilarutkan melalui sonikasi dalam 4 µL larutan tripsin/Lys-C dengan konsentrasi 100 ng/µL dalam 50 mM amonium bikarbonat. Digesti dilakukan selama 2 jam pada 37°C dengan pengocokan pada 300 rpm. Hasil digesti diasamkan dengan 1 µL asam trifluoroasetat 1,25% dan dianalisis menggunakan LC aliran nano–spektrometri massa tandem beresolusi tinggi.
Alur kerja ini menyoroti beberapa prinsip yang berguna untuk proteomik EV dengan jumlah masukan rendah. Pertama, masukan dinormalisasi berdasarkan ekuivalen protein, yang penting saat membandingkan EV dari genotipe atau perlakuan berbeda. Kedua, metanol digunakan sebelum sonikasi, mendukung disrupsi dan ekstraksi sekaligus menghindari sistem detergen yang dapat mempersulit LC-MS/MS. Ketiga, langkah sonikasi singkat dan terstandar, sehingga kompatibel dengan pemrosesan sampel secara paralel. Keempat, digesti tripsin/Lys-C dilakukan dalam volume yang sangat kecil, mengurangi pengenceran dan mendukung perolehan kembali peptida dari masukan rendah. Terakhir, peralihan langsung dari digesti ke pengasaman dan LC-MS/MS meminimalkan langkah penanganan yang tidak diperlukan.
Metode LC-MS/MS pada tahap hilir menggunakan pemisahan fase terbalik dengan aliran nano yang digabungkan dengan spektrometer massa Q-Exactive HF Orbitrap. Sampel ditangkap pada prakolom C18, lalu dipisahkan pada kolom analitis berdiameter dalam 50 µm dengan laju alir 200 nL/min dan suhu 40°C. Gradien beralih dari kadar pelarut organik rendah ke 35% pelarut B selama 60 menit, diikuti pencucian dengan kadar organik tinggi dan penyeimbangan kembali. Akuisisi MS dilakukan dalam mode ion positif menggunakan akuisisi independen data dengan disosiasi tumbukan berenergi lebih tinggi. Berkas mentah DIA dianalisis menggunakan DIA-NN 1.8 dengan pustaka spektral yang diprediksi secara in silico.