Poboljšajte HPLC analizu pouzdanom pripremom uzoraka
Tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC) i dalje je jedna od najvažnijih analitičkih tehnika za identifikaciju i kvantifikaciju spojeva u složenim matricama. Od kontrole kvalitete u farmaceutskoj industriji do praćenja stanja okoliša i analize hrane, HPLC metode cijene se zbog svoje osjetljivosti, selektivnosti i ponovljivosti. Međutim, pouzdanost kromatografskih podataka uvelike ovisi o jednom ključnom koraku: pripremi uzoraka za HPLC.
Istraživanja i rutinski postupci pripreme uzoraka pokazuju da ekstrakcija i priprema uzoraka potpomognute sonikacijom znatno poboljšavaju učinkovitost, točnost i brzinu HPLC analize. Primjenom ultrazvučne energije za razaranje matrica i poboljšanje prijenosa analita u otapala laboratoriji mogu postići veća iskorištenja, kraća vremena ekstrakcije i ponovljivije analitičke rezultate.
Zašto je priprema uzoraka važna za HPLC
U mnogim analitičkim postupcima matrica uzorka – poput biljnog materijala, biološkog tkiva, tla ili vode – sadržava složene smjese spojeva koji mogu ometati kromatografsko razdvajanje. Stoga je učinkovita priprema uzoraka potrebna za izolaciju analita, uklanjanje ometajućih tvari i koncentriranje ciljnih spojeva prije injektiranja u HPLC sustav.
Tradicionalne tehnike ekstrakcije često uključuju dugotrajne postupke, velike volumene organskih otapala i više koraka pročišćavanja. Te metode mogu unijeti varijabilnost, povećati operativne troškove i produljiti ukupno vrijeme analize.
Ultrazvučna priprema uzoraka nudi učinkovitu alternativu. Sonikacijom se u tekući medij unosi visokofrekventna akustična energija, pri čemu nastaju mikroskopski kavitacijski mjehurići. Pri urušavanju tih mjehurića nastaju lokalizirane smične sile i učinci mikromiješanja koji razaraju čvrste matrice i ubrzavaju prijenos mase. Taj proces izrazito povećava učinkovitost ekstrakcije.
Sonikator UIP400MTP za obradu velikog broja uzoraka s nosačem epruveta za bočice automatskog uzorkivača
Znanstveni dokazi: sonikacija poboljšava analitičku učinkovitost
Nekoliko recenziranih istraživanja pokazalo je prednosti ultrazvučne ekstrakcije u HPLC postupcima.
Primjerice, metoda razvijena za praćenje ostataka pesticida u uzorcima vode primjenjivala je sonikaciju u kombinaciji s LC–MS/MS analizom za određivanje koncentracija pesticida karbarila. U tom su pristupu uzorci vode prije kromatografske analize ekstrahirani acetonitrilom uz ultrazvučnu obradu. Metodom su postignute vrlo dobre analitičke značajke, uključujući iskorištenja između 89,53% i 101,72%, čime su potvrđene točnost i pouzdanost postupka ultrazvučne pripreme uzoraka.
Korak ultrazvučne ekstrakcije omogućio je učinkovit prijenos analita iz vodene matrice u organsko otapalo, uz smanjenje potrošnje otapala i uklanjanje potrebe za opsežnim postupcima pročišćavanja. Validirana analitička metoda pokazala je izvrsnu linearnost, preciznost i granice kvantifikacije, ističući učinkovitost sonikacije u suvremenim kromatografskim postupcima. (usp. Roudani et al., 2018)
U drugom je istraživanju uvedena ultrazvučno potpomognuta disperzija matrice u čvrstoj fazi (UA-MSPD) za određivanje oleuropeina u listovima masline HPLC analizom. U toj su tehnici biljni prah i sorbens pomiješani, a zatim izloženi ultrazvučnim valovima tijekom koraka eluiranja. Ultrazvuk je poboljšao desorpciju analita s površine sorbensa, istodobno poboljšavajući ekstrakciju iz matrice uzorka. (usp. Rashidipour i Heydari, 2018)
Optimizirani ultrazvučni postupak doveo je do znatnih analitičkih poboljšanja, uključujući:
- Linearne kalibracijske krivulje s R² = 0,9979
- Granice detekcije od svega 0,03 µg mL⁻¹
- Iskorištenja između 90,2% i 96,7%
Ti rezultati potvrđuju da ultrazvučno potpomognuta ekstrakcija ne samo da ubrzava pripremu uzoraka nego i povećava prinos ekstrakcije u usporedbi s klasičnim tehnikama disperzije matrice u čvrstoj fazi.
Sonikator sa sondom UP200St za pripremu uzoraka za HPLC
Ključne prednosti ultrazvučne pripreme uzoraka za HPLC
Sve šira primjena ultrazvučne ekstrakcije u analitičkim laboratorijima potaknuta je nizom mjerljivih prednosti.
- Veća učinkovitost ekstrakcije
Akustična kavitacija razgrađuje čvrste matrice i poboljšava prodiranje otapala. Time se pospješuje oslobađanje analita i povećava iskorištenje, osobito za spojeve prisutne u tragovima u složenim uzorcima. - Kraće vrijeme pripreme uzoraka
Ultrazvučnom ekstrakcijom priprema uzoraka često se može dovršiti u nekoliko sekundi ili minuta. Primjerice, optimiziranim parametrima ultrazvučne ekstrakcije u postupku UA-MSPD postignuto je učinkovito izdvajanje analita za oko 30 sekundi sonikacije, što pokazuje koliko se znatno mogu ubrzati analitički radni postupci. - Manja potrošnja otapala
Budući da ultrazvuk pospješuje prijenos tvari, obično su potrebni manji volumeni otapala. Smanjena uporaba otapala poboljšava održivost laboratorija i smanjuje operativne troškove. - Bolja reproducibilnost
Ravnomjerna raspodjela ultrazvučne energije osigurava ujednačeno razaranje uzoraka i ekstrakciju među replikatima, što dovodi do veće preciznosti analitičkih mjerenja. - Kompatibilnost sa suvremenim kromatografskim metodama
Ultrazvučna ekstrakcija lako se integrira sa sustavima HPLC, UHPLC i LC-MS, što je čini prikladnom za analitička okruženja u kojima se obrađuje velik broj uzoraka.
HPLC kromatogram fenolnih spojeva iz ekstrakta listova vrste Annona muricata izoliranog ultrazvukom pomoću ultrazvučnog uređaja UP400S.
(Istraživanje i grafički prikaz: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktična rješenja za sonikaciju pri pripremi uzoraka za HPLC
Laboratorijima koji primjenjuju ultrazvučnu ekstrakciju sonikatori Hielscher omogućuju preciznu kontrolu parametara kao što su amplituda, vrijeme i pulsni način rada. Stoga su laboratorijski sonikatori Hielscher posebno prikladni za analitičke laboratorije.
Odaberite najprikladniji laboratorijski sonikator za svoje uzorke za HPLC
| Model sonikatora | Prednosti za HPLC | Najprikladnija primjena u pripremi uzoraka za HPLC |
| Sonikator za više epruveta VialTweeter |
• Istodobna sonikacija do 10 zatvorenih bočica uz jednaku ultrazvučnu energiju • Sterilno: nema unakrsne kontaminacije jer uzorci ostaju zatvoreni • Visoko reproducibilni uvjeti ekstrakcije među serijama • Učinkovita kavitacija za analitičke uzorke malog volumena |
• Priprema velikog broja okolišnih, prehrambenih ili farmaceutskih uzoraka • Ekstrakcija analita u tragovima prije analize HPLC, UHPLC ili LC-MS • Standardizirani radni postupci koji zahtijevaju jednaku obradu više uzoraka |
| Sonikator za mikropločice UIP400MTP |
• Beskontaktna sonikacija cijelih mikropločica (formati s 96 i 384 jažice) • Ravnomjerna raspodjela ultrazvučne energije po svim jažicama • Omogućuje automatizaciju i integraciju robotskih sustava u analitičke radne postupke • Obrada velikog broja uzoraka uz preciznu kontrolu amplitude i vremena sonikacije |
• Radni postupci probira velikog broja uzoraka metodom UHPLC • Zbirke farmaceutskih spojeva i priprema uzoraka za metabolomiku • Ekstrakcija na pločicama za analitičke postupke LC-MS ili UHPLC |
| Laboratorijski sonikatori s mikrovrhom (izravna sonikacija) |
• Maksimalni intenzitet ultrazvuka za učinkovito razaranje matrice • Vrlo brza ekstrakcija analita iz čvrstih, viskoznih ili heterogenih uzoraka • Podesiva amplituda i parametri pulsiranja za optimizirane uvjete ekstrakcije • Visoka energija kavitacije poboljšava iskorištenje analita i prinos ekstrakcije |
• Ekstrakcija iz zahtjevnih matrica kao što su biljno tkivo, uzorci hrane ili polimeri • Homogenizacija prije SPE-a, filtracije ili ekstrakcije tekućina–tekućina • Razvoj metoda za ultrazvučnu pripremu uzoraka za HPLC |
| CupHorn (“kupelj visokog intenziteta” za laboratorijske čaše i epruvete) |
• Neizravna sonikacija sprječava kontaminaciju sonde • Ujednačeno ultrazvučno polje za više epruveta istodobno • Idealno za sterilne, opasne ili hlapljive uzorke koji moraju ostati zatvoreni • Pojednostavljuje rukovanje uz održavanje snažne energije kavitacije |
• Paralelna ekstrakcija više uzoraka za HPLC u zatvorenim epruvetama za centrifugiranje • Priprema bioloških, farmaceutskih ili okolišnih uzoraka • Radni postupci koji zahtijevaju neizravnu sonikaciju bez kontaminacije |
Znanstvena važnost za analitičku kemiju
Kako se analitička kemija usmjerava prema bržim i održivijim laboratorijskim praksama, ultrazvučna priprema uzoraka postala je moćna tehnologija koja omogućuje taj napredak. Sonikacija podupire razvoj brzih analitičkih metoda s manjom potrošnjom otapala, poboljšanom učinkovitošću ekstrakcije i robusnim validacijskim parametrima.
Sve opsežnija literatura o ultrazvučnoj ekstrakciji pokazuje da priprema uzoraka za HPLC potpomognuta sonikacijom nije samo praktična pogodnost – riječ je o znanstveno potvrđenom pristupu koji poboljšava analitičku izvedbu. Kombiniranjem ultrazvučne ekstrakcije sa suvremenim kromatografskim tehnikama laboratoriji mogu postići pouzdanu detekciju analita u tragovima u sve složenijim matricama uzoraka.
Radni postupci HPLC-a poboljšani sonikacijom
Uz kontinuirani napredak analitičkih instrumenata i tehnologija pripreme uzoraka, ultrazvučna ekstrakcija vjerojatno će imati još veću ulogu u kromatografskim laboratorijima. Njezina sposobnost pojednostavljenja radnih postupaka, poboljšanja kvalitete podataka i smanjenja utjecaja na okoliš dobro je usklađena sa zahtjevima suvremene analitičke znanosti koji se neprestano razvijaju.
Analitičkim kemičarima i industrijskim laboratorijima koji žele optimizirati pripremu uzoraka za HPLC ultrazvučna ekstrakcija nudi dokazano, skalabilno i znanstveno utemeljeno rješenje. Uključivanjem sonikacije u rutinske protokole pripreme uzoraka laboratoriji mogu znatno poboljšati i učinkovitost i pouzdanost kromatografske analize.
Dizajn, proizvodnja i savjetovanje – kvaliteta proizvedena u Njemačkoj
Ultrazvučni uređaji Hielscher poznati su po najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavno rukovanje omogućuju nesmetanu integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijska postrojenja. Ultrazvučni uređaji Hielscher lako podnose teške uvjete i zahtjevna okruženja.
Hielscher Ultrasonics je tvrtka s ISO certifikatom koja poseban naglasak stavlja na ultrazvučne uređaje visokih performansi s najsuvremenijom tehnologijom i jednostavnim rukovanjem. Naravno, ultrazvučni uređaji Hielscher sukladni su zahtjevima CE te ispunjavaju zahtjeve UL, CSA i RoHs.
Literatura / reference
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Često postavljana pitanja
Što je HPLC?
Tekućinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC) analitička je tehnika razdvajanja koja se upotrebljava za identifikaciju, kvantifikaciju i pročišćavanje sastavnica smjese. U HPLC-u tekuća pokretna faza pod visokim tlakom prenosi otopljene analite kroz kolonu ispunjenu nepokretnom fazom. Razlike u interakcijama između analita, nepokretne faze i pokretne faze uzrokuju razdvajanje spojeva tijekom njihova prolaska kroz kolonu. Detektori koji se temelje na UV-Vis spektroskopiji, fluorescenciji ili spektrometriji masa mjere razdvojene spojeve, omogućujući preciznu kvalitativnu i kvantitativnu analizu.
Koje su vrste tekućinske kromatografije?
Tekućinska kromatografija može se klasificirati prema mehanizmu razdvajanja koji se primjenjuje između analita, nepokretne faze i pokretne faze. Najčešće su vrste kromatografija obrnutih faza, u kojoj nepolarna nepokretna faza razdvaja spojeve na temelju hidrofobnih interakcija; kromatografija normalnih faza, koja upotrebljava polarnu nepokretnu fazu i razdvaja spojeve prema polarnosti; kromatografija ionske izmjene, u kojoj nabijene nepokretne faze razdvajaju analite na temelju ionskih interakcija; te kromatografija isključenjem prema veličini, koja razdvaja molekule prema njihovoj hidrodinamičkoj veličini i molekulskoj masi. Dodatne specijalizirane metode uključuju afinitetnu kromatografiju i kromatografiju hidrofilnih interakcija (HILIC), koje ciljaju specifične molekulske interakcije ili polarne spojeve.
Koje se bočice upotrebljavaju za HPLC?
Za HPLC analize obično se upotrebljavaju male staklene ili polimerne bočice namijenjene čuvanju pripremljenih uzoraka prije injektiranja u kromatografski sustav. Najčešći je format bočica od 2-mL za automatski uzorkivač, koja je kompatibilna s većinom automatskih uzorkivača za HPLC. Te su bočice obično izrađene od borosilikatnog stakla kako bi se osigurala kemijska otpornost i minimalna interakcija s otapalima i analitima. Ovisno o vrsti uzorka, bočice mogu imati umetke za uzorke malog volumena, navojne ili krimpane zatvarače te septe izrađene od materijala poput PTFE/silikona radi očuvanja cjelovitosti uzorka.
Što su bočice za automatski uzorkivač?
Bočice za automatski uzorkivač specijalizirani su spremnici za uzorke namijenjeni sustavima za automatsko injektiranje u instrumentima za HPLC i UHPLC. Sadrže pripremljenu otopinu uzorka i postavljaju se u nosač automatskog uzorkivača instrumenta, gdje sustav automatski izvlači određeni volumen za injektiranje u kromatografsku kolonu. Bočice za automatski uzorkivač proizvode se s preciznim dimenzijama kako bi se osigurala kompatibilnost s robotskim iglama za uzorkovanje te smanjilo isparavanje, kontaminacija ili adsorpcija uzorka. Njihova izvedba omogućuje reproducibilnu analizu velikog broja uzoraka u modernim kromatografskim laboratorijima.
Koji su koraci u HPLC-u?
Tipičan radni postupak tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti (HPLC) sastoji se od nekoliko uzastopnih koraka koji osiguravaju pouzdano razdvajanje i detekciju analita.
- Najprije se provodi priprema uzorka kako bi se analit otopio, uklonile čestice te često ekstrahirali ili koncentrirali ciljni spojevi iz matrice uzorka. Ovaj korak može uključivati filtraciju, razrjeđivanje ili tehnike ekstrakcije poput ultrazvučne ekstrakcije, ekstrakcije na čvrstoj fazi ili ekstrakcije tekuće–tekuće.
- Zatim se pripremljeni uzorak stavlja u bočicu za HPLC i umeće u automatski uzorkivač. Automatski uzorkivač injektira precizan volumen uzorka u mobilnu fazu koja protječe.
- U fazi dovoda mobilne faze injektirani se uzorak zatim prenosi kroz sustav pomoću visokotlačne pumpe. Mobilna faza prenosi analite kroz kromatografsku kolonu uz kontrolirani protok.
- Unutar kromatografske kolone dolazi do razdvajanja. Kolona sadrži stacionarnu fazu, obično u obliku pakiranih čestica s definiranim kemijskim svojstvima. Dok analiti prolaze kroz kolonu, različito stupaju u interakcije sa stacionarnom i mobilnom fazom, zbog čega eluiraju u različito vrijeme.
- Nakon razdvajanja spojevi prolaze kroz detektor, primjerice UV-Vis detektor, fluorescencijski detektor ili detektor za masenu spektrometriju. Detektor mjeri prisutnost i koncentraciju spojeva koji eluiraju te pretvara signal u elektroničke podatke.
- Na kraju se prikupljanje i analiza podataka provode pomoću kromatografskog softvera. Sustav generira kromatogram u kojem pikovi odgovaraju pojedinačnim spojevima. Retencijska vremena pikova pomažu u identifikaciji analita, dok površine ili visine pikova omogućuju kvantitativno određivanje njihove koncentracije.
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorijskih do industrijskih veličina.