Fragmentacija alfa-sinukleina pomoću sonikatora VialTweeter
Fibrile i vrpce α-sinukleina fragmentiraju se u znanstvenim istraživanjima kako bi se stvorili manji isječci fibrila ili čak pojedinačne proteinske molekule, koje se lakše mogu analizirati različitim eksperimentalnim tehnikama. VialTweeter Sonicator jedan je od najčešće korištenih ultrazvučnih uređaja za učinkovitu i pouzdanu fragmentaciju alfa-sinukleina.
α-Sinuklein u istraživanju
Alfa-sinukleinske fibrile su proteinski agregati koji su snažno povezani s neurodegenerativnim poremećajima kao što su Parkinsonova bolest i određeni oblici demencije, uključujući demenciju s Lewyjevim tjelešcima. Istraživanje usmjereno na fibrile alfa-sinukleina ima za cilj razumjeti njihovu ulogu u napredovanju bolesti i razviti potencijalne terapijske intervencije. Razbijanjem fibrila alfa-sinukleina na manje fragmente, istraživači mogu istražiti njihove specifične strukturne značajke. Na primjer, fragmentiranje fibrila alfa-sinukleina omogućuje istraživačima da istraže njihove interakcije s drugim molekulama, poput proteina, lipida ili malih molekula. Stvaranjem manjih fragmenata, mjesta vezivanja i afinitet za te partnere u interakciji mogu se učinkovitije ispitati. Manji α-Syn fribrili i vrpce također mogu pokazati izmijenjenu toksičnost i biokemijske učinke. Stoga je ključna pouzdana i učinkovita tehnika fragmentacije, koja daje ponovljive rezultate u brzoj i jednostavnoj obradi uzorka.
Ultrazvučna Alpha-Syn fragmentacija: VialTweeter sonicator je uspostavljeni ultrazvučni sustav za pripremu uzoraka koji sonicira do 10 bočica istovremeno pod potpuno istim uvjetima. Programabilne postavke omogućuju jednostavno i brzo ponovno izvođenje istih eksperimenata, što daje vrlo pouzdane i ponovljive rezultate u fragmentaciji fibrila alfa-sinukleina.
VialTweeter sonikator za istovremenu ultrazvučnu fragmentaciju više uzoraka alfa-sinukleina.
Priprema uzorka α-sinukleina pomoću sonikatora
Jedan pristup proučavanju fibrila alfa-sinukleina uključuje njihovu ekstrakciju i fragmentaciju korištenjem tehnika kao što je sonikacija. Sonikacija je proces koji koristi ultrazvučne valove visokog intenziteta i niske frekvencije za ometanje i razgradnju proteinskih agregata, što dovodi do oslobađanja manjih fibrila ili pojedinačnih proteinskih molekula. Sonikator VialTweeter često je korišten uređaj u istraživačkim studijama vezanim uz α-sinuklein u tu svrhu.
Brojne istraživačke studije opisuju precizne protokole pripreme uzoraka sonikacije fibrila alfa-sinukleina, koje koriste Hielscher VialTweeter za učinkovitu i pouzdanu fragmentaciju fibrila α-sinukleina. Fragmentiranjem fibrila ultrazvučno, istraživači mogu analizirati nastale proizvode i ispitati njihovu strukturu, toksičnost i interakcije s drugim molekulama. Ovo istraživanje daje važne uvide u mehanizme koji leže u pozadini neurodegeneracije i potencijalno identificira nove terapijske ciljeve. Dobro uspostavljeni protokoli ultrazvuka α-sinukleina pomoću sonikatora VialTweeter omogućuju pouzdane i ponovljive rezultate.
Gornje slike: nefragmentirane fibrile alfa-sinukleina
Donje slike: Ultrazvučno fragmentirane alfa-sinukleinske fibrile s VialTweeter sonikatorom
(studija i slike: ©Dieriks et al., 2022.)
Ultrazvučna fragmentacija fibrila α-sinukleina – Protokoli
Budući da brojni istraživači koriste sonikator VialTweeter kao preferiranu tehniku fragmentacije za proizvodnju ujednačenih fragmenata fibrila α-sinukleina, utvrđeni protokoli su lako dostupni. U nastavku možete pronaći nekoliko primjera protokola fragmentacije.
ClearTau priprema sjemena: ClearTau fibrile razrijeđene su do 10 μM u dH2O i sonikirane pri amplitudi od 70 % tijekom 50 s s ciklusom 1 s ON 1 s OFF u cijevi pomoću sonikatora UP200St s VialTweeterom. Sjemenke su karakterizirane elektronskim mikroskopom.
ThS mjerenje fluorescencije: ClearTau fibrile razrijeđene su do 2,5 μM u dH2O i sonicirane pri amplitudi od 70 % tijekom 50 s s ciklusom 1 s ON 1 s OFF u epruveti pomoću UP200St s VialTweeterom. 2,5 μM monomera Tau 4R2N pune duljine korišteno je kao kontrola. U reakciju od 100 µl dodano je 100 µl ThS (10 µM), čime su konačne koncentracije proteina bile 1,25 µM. ThS fluorescencija u jednoj vremenskoj točki izmjerena je upotrebom ploča s 96 jažica s prozirnim dnom postavljenih u FLUOstar Omega čitaču mikroploča s ekscitacijom na 445 nm i zabilježenom emisijom na 485 nm.
(usp. Limorenko i dr., 2023.)
Ujednačena duljina α-sinukleina korištenjem sonikacije: Heterogenost duljine α-syn fibrila i vrpci smanjena je ultrazvukom tijekom 20 minuta na ledu u Eppendorfovim epruvetama od 2 ml u VialTweeteru postavljenom na 75% amplitude, 0,5 s impulsa.
(usp. Bousset et al., 2013.)
Provedena je kontrola kvalitete ljudskog rekombinantnog monomernog WT-a ili S129A a-Syn i fibrilarnih polimorfa koje oni stvaraju, kao i a-Syn 1-110. Nakon toga, fibrilarni polimorfi su fragmentirani sonikacijom tijekom 20 minuta u Eppendorfovim epruvetama od 2 mL u VialTweeter ultrasonicatoru kako bi se dobile fibrilarne čestice prosječne veličine 42-52 nm koje su prikladne za endocitozu.
(usp. Shrivastava i sur., 2020.)
Karakterizacija pet fibrilarnih α-Syn polimorfa. (A) Prikazane su transmisijske elektronske mikrografije negativno obojenih fibrilarnih polimorfa α-Syn fibrila, vrpci, fibrila-91, fibrila-65 i fibrila-110 prije (gornja traka) i nakon fragmentacije s VialTweeterom (donja traka). (B) Prikazana je distribucija duljine fragmentiranih fibrilarnih polimorfa. Naveden je broj (n) fibrilarnih sklopova iz kojih su izvedeni histogrami.
(studija i slike: Shrivastava i sur., 2020.)
α-Syn fibrile su fragmentirane ultrazvukom tijekom 20 minuta u Eppendorfovim epruvetama od 2 ml u VialTweeteru kako bi se dobile fibrilarne čestice prosječne veličine 42-52 nm prema procjeni TEM analizom.
(usp. Negrini i sur., 2022.)
Resuspendirane fibrile91 (u PBS-u) su fragmentirane prije dodavanja staničnoj kulturi ultrazvukom tijekom 20 minuta u Eppendorfovim epruvetama od 2 mL pomoću sonikatora Vial Tweeter, alikvotirane su, brzo zamrznute u tekućem dušiku i pohranjene do upotrebe na -80 ̊C.
(usp. Vajhøj et al., 2021.)
Sonicator UIP400MTP za fragmentaciju fibrila alfa-sinukleina u pločama s više jažica.
VialTweeter i laboratorijski sonikatori za α-Syn fragmentaciju
Hielscher Ultrasonics svjetski je priznat kao vodeći proizvođač najsuvremenijih ultrazvučnih uređaja. Pouzdani i uspostavljeni u velikim istraživačkim laboratorijima diljem svijeta, naši ultrazvučni uređaji nude neusporedivu kvalitetu i izvedbu za vaše kritične eksperimente.
Uz Hielscher VialTweeter i bilo koji drugi Hielscher sonikator, doživjet ćete neusporedivu korisničku udobnost, jer su pažljivo projektirani za ponovljive rezultate, jednostavnost korištenja i besprijekoran rad. Uz značajke automatskog snimanja podataka, možete se usredotočiti na svoje istraživanje dok naši ultrazvučni uređaji pedantno bilježe ključne podatke za ponovljivost i preciznost.
Postignite dosljedne i ponovljive rezultate s povjerenjem!
Naši ultrazvučni uređaji su projektirani i proizvedeni u Njemačkoj. Njemačka preciznost i najviša inženjerska kvaliteta kako bi se osigurala pouzdana i točna priprema uzorka kao što je fragmentacija fibrila alfa-sinukleina svaki put. Nema više brige o nedosljednim rezultatima – naša ultrazvučna tehnologija osigurava da vaše istraživanje ostane na čelu znanstvenog napretka.
Ali to nije sve! Naša predanost izvrsnosti nadilazi naše proizvode. Ponosimo se svojom izuzetnom korisničkom uslugom, pružajući stručnu podršku za rješavanje svih pitanja ili nedoumica koje možda imate. Naš predani tim je tu da vam pomogne u svakom koraku vašeg istraživačkog putovanja, osiguravajući da izvučete maksimum iz naših ultrazvučnih uređaja.
Odaberite inovaciju, pouzdanost i izuzetno korisničko iskustvo – odaberite naše laboratorijske sonikatore kao što je VialTweeter za fragmentaciju fibrila alfa-sinukleina. Iskoristite već uspostavljene protokole i pridružite se redovima vodećih istraživača koji vjeruju našoj tehnologiji za svoje kritičke studije. Podignite svoje istraživanje i istražite nove granice u istraživanju demencije i neurodegenerativnih bolesti s našim najsuvremenijim ultrazvučnim uređajima.
- visoka efikasnost
- Najnovija tehnologija
- pouzdanost & robusnost
- ponovljivost
- podesiva, precizna kontrola procesa
- za bilo koji volumen
- inteligentni softver
- pametne značajke (npr. programabilne, podatkovni protokol, daljinsko upravljanje)
- jednostavan i siguran za rukovanje
- slabo održavanje
- CIP (čišćenje na mjestu)
Projektiranje, proizvodnja i savjetovanje – Kvaliteta Proizvedeno u Njemačkoj
Hielscher ultrasonicators su poznati po svojim najvišim standardima kvalitete i dizajna. Robusnost i jednostavan rad omogućuju glatku integraciju naših ultrazvučnih uređaja u industrijske objekte. Teški uvjeti i zahtjevna okruženja lako se nose s Hielscher ultrasonicators.
Hielscher Ultrasonics je ISO certificirana tvrtka i stavlja poseban naglasak na ultrazvučne uređaje visokih performansi koji sadrže najsuvremeniju tehnologiju i jednostavnu su za korištenje. Naravno, Hielscher sonikatori su u skladu sa CE i zahtjevima UL, CSA i RoHs.
Donja tablica daje vam naznaku približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja laboratorijske veličine:
| Preporučeni uređaji | Volumen serije | Protok |
|---|---|---|
| UIP400MTP | ploče s više jažica / mikrotitarske ploče | na |
| Ultrazvučni CupHorn | CupHorn za bočice ili čaše | na |
| GDmini2 | ultrazvučni mikroprotočni reaktor | na |
| VialTweeter | 0.5 do 1,5 ml | na |
| UP100H | 1 do 500 ml | 10 do 200 ml/min |
| UP200Ht, UP400St | 10 do 2000 ml | 20 do 400 ml/min |
Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!
VialTweeter se obično koristi za fragmentiranje fibrila alfa-sinukleina kao korak predanalitičke pripreme uzorka
Literatura / Reference
- Emil Dandanell Agerschou, Marie P. Schützmann, Nikolas Reppert, Michael M. Wördehoff, Hamed Shaykhalishahi, Alexander K. Buell, Wolfgang Hoyer (2021): β-Turn exchanges in the α-synuclein segment 44-TKEG-47 reveal high sequence fidelity requirements of amyloid fibril elongation. Biophysical Chemistry, Volume 269, 2021.
- Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G. et al. (2013): Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature Communications 4, 2575 (2013).
- Vajhøj, Charlott; Schmid, Benjamin; Alik, Ania; Melki, Ronald; Fog, Karina; Holst, Bjørn; Stummann, Tina (2021): Establishment of a human induced pluripotent stem cell neuronal model for identification of modulators of A53T α-synuclein levels and aggregation. PLOS ONE 16, 2021.
- Dieriks B.V.; Highet B.; Alik A.; Bellande T.; Stevenson T.J.; Low V.; Park T.I.; Correia J.; Schweder P.; Faull R.L.M.; Melki R.; Curtis M.A.; Dragunow M. (2022): Human pericytes degrade diverse α-synuclein aggregates. PLoS One, Nov 18;17(11), 2022.
- Amulya Nidhi Shrivastava, Luc Bousset, Marianne Renner, Virginie Redeker, Jimmy Savistchenko, Antoine Triller, Ronald Melki (2020): Differential Membrane Binding and Seeding of Distinct α-Synuclein Fibrillar Polymorphs. Biophysical Journal, Volume 118, Issue 6, 2020. 1301-1320.
- Negrini M, Tomasello G, Davidsson M, Fenyi A, Adant C, Hauser S, Espa E, Gubinelli F, Manfredsson FP, Melki R, Heuer A. (2022): Sequential or Simultaneous Injection of Preformed Fibrils and AAV Overexpression of Alpha-Synuclein Are Equipotent in Producing Relevant Pathology and Behavioral Deficits. Journal of Parkinsons Disease 12(4), 2022. 1133-1153.
- Limorenko G, Tatli M, Kolla R, Nazarov S, Weil MT, Schöndorf DC, Geist D, Reinhardt P, Ehrnhoefer DE, Stahlberg H, Gasparini L, Lashuel HA (2023): Fully co-factor-free ClearTau platform produces seeding-competent Tau fibrils for reconstructing pathological Tau aggregates. Nature Communications 4;14(1), July 2023.
Često postavljana pitanja
Je li alfa-sinuklein amiloid?
Da, alfa-sinuklein može formirati fibrile slične amiloidu. To je ključna komponenta Lewyjevih tjelešaca, patološkog obilježja Parkinsonove bolesti i drugih sinukleinopatija. Njegova agregacija slijedi proces polimerizacije ovisan o nukleaciji sličan klasičnim amiloidima.
Koja je razlika između Amyloid-Beta i Alpha-Synuclein?
Amiloid-beta (Aβ) i alfa-sinuklein (α-syn) su različiti proteini koji tvore patološke agregate u neurodegenerativnim bolestima. Ap, izveden iz proteina prekursora amiloida (APP), primarno je povezan s Alzheimerovom bolešću i stvara izvanstanične plakove. Nasuprot tome, α-syn je presinaptički neuronski protein koji se intracelularno nakuplja u Parkinsonovoj bolesti i srodnim poremećajima. Dok oba pokazuju amiloidne strukture bogate β-listom, razlikuju se u svojim sekvencama, putovima agregacije i patologiji specifičnoj za bolest.
Koja je vrsta proteina amiloid?
Amiloid je pogrešno presavijeni, fibrilarni protein koji ima poprečnu strukturu β-lista i agregira se u netopljive fibrile. Ti su proteini tipično izvedeni iz normalno topivih prekursora koji prolaze kroz konformacijske promjene, što dovodi do samosastavljanja i taloženja. Amiloidi su povezani s raznim neurodegenerativnim i sistemskim bolestima, gdje njihova agregacija doprinosi staničnoj toksičnosti i oštećenju tkiva. Saznajte kako sonikator ploče s 96 jažica UIP400MTP pomaže u brzom formiranju standardiziranih amiloidnih fibrila u istraživačke svrhe!
Koje su bolesti uzrokovane amiloidima?
Amiloidi su uključeni u brojne bolesti, koje se zajednički nazivaju amiloidoze. To uključuje:
- Neurodegenerativne bolesti: Alzheimerova bolest (Aβ), Parkinsonova bolest (α-syn), Huntingtonova bolest (mutant Huntingtin) i prionske bolesti (PrPSc). (Pročitajte više o PMCA potpomognutoj ultrazvukom detekcije priona visoke propusnosti!)
- Sistemske amiloidoze: Amiloidoza lakih lanaca (AL), amiloidoza transtiretina (ATTR) i sekundarna (AA) amiloidoza.
- Lokalizirane amiloidoze: Amiloidni polipeptid otočića (IAPP) kod dijabetesa tipa 2.
Svaku bolest povezanu s amiloidom karakterizira pogrešno savijanje, agregacija i taloženje proteina, što dovodi do stanične disfunkcije i toksičnosti.
Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne homogenizatore visokih performansi od laboratorija do industrijska veličina.