PMCA za detekciju priona visoke propusnosti pomoću sonikatora UIP400MTP

UIP400MTP sonikator ploče s više jažica nudi moćno rješenje za pripremu uzorka visoke propusnosti u cikličkom pojačavanju pogrešnog savijanja proteina (PMCA). Isporučujući jednoliku distribuciju energije kroz višestruke jažice i održavajući precizne parametre sonikacije, ovaj sustav omogućuje istovremenu obradu brojnih uzoraka s iznimnom obnovljivošću. Te su mogućnosti kritične za optimizaciju PMCA za otkrivanje priona u niskim koncentracijama u izazovnim biološkim uzorcima, kao što je slina, gdje inhibitori ispitivanja mogu zamagliti rezultate.

Prionske bolesti, kao što je bolest kroničnog gubitka (CWD) kod jelena i Creutzfeldt-Jakobova bolest (CJD) kod ljudi, neurodegenerativni su poremećaji uzrokovani pogrešno presavijenim prionskim proteinima (PrP^sc). Ove bolesti često uključuju niske razine infektivnih priona u tjelesnim tekućinama, kao što su slina, krv i urin, što komplicira dijagnozu i istraživanje. Horizontalni prijenos CWD-a putem priona izlučenih u ekološkim matricama ima osobito značajne implikacije za upravljanje divljim životinjama i ekološko zdravlje. Slično tome, u bolestima poput Creutzfeldt-Jakobove bolesti, pouzdana amplifikacija pogrešno savijenih prionskih proteina iz ljudskih uzoraka ključna je za unaprjeđenje dijagnostike i razumijevanje progresije bolesti.

Primjena modificiranog PMCA protokola omogućuje zaobilaženje uobičajenih inhibitora testa (npr. mucina u slini) i postizanje visoke osjetljivosti u otkrivanju priona koji bi inače bili nemjerljivi ili dvosmisleni korištenjem tehnika kao što je pretvorba izazvana podrhtavanjem u stvarnom vremenu (RT-QuIC). Ova poboljšanja poboljšavaju detekciju priona za razne bolesti, čineći PMCA nezamjenjivim alatom za istraživanje i dijagnostiku priona. Sonikator ploča s više jažica UIP400MTP olakšava PMCA sonikaciju brojnih uzoraka visoke propusnosti u mikropločama (npr. ploče sa 6, 24 ili 96 jažica) ili bočicama u stalku za epruvete.

Protokol za cikličko pojačanje pogrešnog savijanja proteina velike propusnosti (PMCA)

Sljedeći protokol omogućuje učinkovitu obradu velikog broja uzoraka pod potpuno istim uvjetima za robusne rezultate istraživanja.

priprema uzorka

Polazni materijal:
Pripremite uzorke:

• Resuspendiranje peleta za ekstrakciju sarkosila u PMCA supstratu.
• Izravno ubacivanje homogenata mozga ili uzoraka krvi s prionskim sjemenkama.

Podloga:

• Upotrijebite 10% (wt/vol) homogenat mozga pripremljen od transgenih miševa koji prekomjerno izražavaju PrP^C (npr. Tg miševi).
• Homogenizirajte moždano tkivo u:
  – 1 × PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Čuvati supstrat na -80ºC do upotrebe.

Postavljanje uzorka u mikroploču ili epruvete:
cijevi:

• Dodajte 90 μL supstrata homogenata mozga i nasadite s 10 μL uzorka (npr. krvi, homogenata mozga ili peleta sarkosila).
• Stavite 3 teflonske kuglice (promjera 1,59 mm ili 2,38 mm) u svaku epruvetu od 0,2 mL.
• Postavite cijevi u stalak kompatibilan s UIP400MTP sonikatorom.

Mikroploča sa 6 jažica:

• Dodajte 5 mL supstrata homogenata mozga i nasadite s 500 μL uzorka po jažici.
• Dodajte 3 teflonske kuglice u svaku jažicu.

PMCA postupak

Plasman:
Stavite stalak za epruvete ili mikroploču sa 6 jažica u sonikator UIP400MTP prema uputama proizvođača.

Biciklistički program:
Izvedite 144 PMCA ciklusa kako slijedi:

• Inkubacija: 29 minuta i 30 sekundi na 37°C.
• Sonikacija: 30 sekundi pri 60% amplitude.
• Pratite temperaturu: Koristite senzor temperature koji se može priključiti za praćenje temperature uzorka i programirajte UIP400MTP na maks. temperatura 48-50°C.

Naredna kola:
Nakon završetka prve runde od 144 ciklusa, prenesite alikvot amplificiranog materijala:

• Razrijedite 10 puta u svježem supstratu homogena mozga transgenog miša.
• Izvedite 96 PMCA ciklusa za naredne runde, održavajući iste parametre sonikacije.
• Nastavite do željenog broja krugova (obično do 5).

Detekcija PrP^sc

1. Probava proteinaze K:
   – Tretirajte uzorke s proteinazom K (50 μg/mL) na 37°C tijekom 1 sata.
   – Zaustavite digestiju dodavanjem SDS pufera uzorka i kuhanjem 10 minuta.
2. Western Blot analiza:
   – Analizirajte probavljene uzorke pomoću:
   – 6H4 ili PRC1 anti-PrP antitijela.
   – Izvedite SDS-PAGE i prenesite na PVDF membrane za detekciju.

 

 

Obradite više uzoraka za robusnije rezultate

UIP400MTP sonikator ploča s više jažica značajno poboljšava učinkovitost i skalabilnost cikličke amplifikacije pogrešnog savijanja proteina (PMCA), rješavajući tradicionalno dugotrajnu prirodu postupka. Omogućujući istovremenu obradu do 96 uzoraka u ploči s 96 jažica, sustav usmjerava PMCA tijekove rada uz održavanje preciznih i ujednačenih uvjeta sonikacije u svim jažicama. Ova sposobnost velike propusnosti smanjuje ručno rukovanje, smanjuje radno intenzivne korake i osigurava ponovljivost, što ga čini nezamjenjivim alatom za istraživanje priona. Bilo da se radi o istraživanju bolesti kroničnog gubitka ili Creutzfeldt-Jakobove bolesti, UIP400MTP olakšava studije velikih razmjera s većom učinkovitosti, omogućujući istraživačima da zadovolje zahtjeve moderne dijagnostičke i znanstvene primjene.

---

---

Literatura / Reference

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.