PMCA za visokopropusno otkrivanje priona sonikatorom UIP400MTP

Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP nudi snažno rješenje za visokopropusnu pripremu uzoraka u cikličnoj amplifikaciji pogrešno savijenih proteina (PMCA). Distribuiranjem ujednačene energije kroz više jažica i održavanjem preciznih parametara sonikacije ovaj sustav omogućuje istovremenu obradu brojnih uzoraka s iznimnom reproducibilnošću. Te su mogućnosti ključne za optimizaciju PMCA-a radi otkrivanja priona pri niskim koncentracijama u zahtjevnim biološkim uzorcima, primjerice slini, u kojoj inhibitori testa mogu prikriti rezultate.

Prionske bolesti, poput bolesti kronične iscrpljenosti (CWD) kod jelena i Creutzfeldt-Jakobove bolesti (CJD) kod ljudi, neurodegenerativni su poremećaji uzrokovani pogrešno savijenim prionskim proteinima (PrP^Sc). Ove bolesti često uključuju niske razine zaraznih priona u tjelesnim tekućinama, poput sline, krvi i mokraće, što otežava dijagnostiku i istraživanje. Horizontalni prijenos CWD-a prionima koji se ispuštaju u okolišne matrice ima osobito značajne implikacije za upravljanje divljači i ekološko zdravlje. Slično, kod bolesti poput Creutzfeldt-Jakobove bolesti pouzdana amplifikacija pogrešno savijenih prionskih proteina iz ljudskih uzoraka ključna je za napredak dijagnostike i razumijevanje napredovanja bolesti.

Primjenom modificiranog PMCA protokola mogu se zaobići uobičajeni inhibitori testa (npr. mukini u slini) i postići visoka osjetljivost otkrivanja priona koji bi tehnikama poput realno-vremenske reakcije inducirane tresenjem (RT-QuIC) inače bili neotkriveni ili dvosmisleni. Ta unaprijeđenja poboljšavaju otkrivanje priona kod raznih bolesti, čineći PMCA nezamjenjivim alatom za prionska istraživanja i dijagnostiku. Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP olakšava visokopropusni PMCA soniciranjem brojnih uzoraka u mikropločicama (npr. pločice sa 6, 24 ili 96 jažica) ili epruvetama u stalku za epruvete.

Protokol visokopropusne ciklične amplifikacije pogrešno savijenih proteina (PMCA)

Sljedeći protokol omogućuje učinkovitu obradu velikog broja uzoraka pod potpuno istim uvjetima radi robusnih istraživačkih rezultata.

Priprema uzorka

Polazni materijal:
Pripremite uzorke tako da:

• Resuspendirate talog ekstrakcije sarkozilom u PMCA supstrat.
• Izravno dodate prionske sadnice u homogenate mozga ili uzorke krvi.

Supstrat:

• Upotrijebite 10%-tni (wt/vol) homogenat mozga pripremljen od transgeničnih miševa s prekomjernom ekspresijom PrP^C (npr. Tg miševi).
• Homogenizirajte moždano tkivo u:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Čuvajte supstrat na -80ºC do upotrebe.

Postavljanje uzorka u mikropločicu ili epruvete:
Epruvete:

• Dodajte 90 μL supstrata homogenata mozga i inokulirajte s 10 μL uzorka (npr. krv, homogenat mozga ili sarkozilni talog).
• Postavite 3 teflonske kuglice (promjera 1,59-mm ili 2,38-mm) u svaku epruvetu od 0,2 mL.
• Postavite epruvete u stalak kompatibilan sa sonikatorom UIP400MTP.

Pločica sa 6 jažica:

• Dodajte 5 mL supstrata homogenata mozga u svaku jažicu i inokulirajte s 500 μL uzorka.
• Dodajte 3 teflonske kuglice u svaku jažicu.

PMCA postupak

Postavljanje:
Postavite stalak s epruvetama ili pločicu sa 6 jažica u sonikator UIP400MTP prema uputama proizvođača.

Ciklični program:
Izvedite 144 PMCA ciklusa na sljedeći način:

• Inkubacija: 29 minuta i 30 sekundi na 37°C.
• Sonikacija: 30 sekundi pri 60% amplitudi.
• Pratite temperaturu: Upotrijebite priključivi senzor temperature za praćenje temperature uzorka i programirajte UIP400MTP na maksimalnu temperaturu od 48–50°C.

Naknadne runde:
Nakon dovršetka prve runde od 144 ciklusa prenesite alikvot umnoženog materijala:

• Razrijedite 10 puta u svježi supstrat homogenata mozga transgeničnog miša.
• Izvedite 96 PMCA ciklusa za naknadne runde, zadržavajući iste parametre sonikacije.
• Nastavite do željenog broja rundi (obično do 5).

Otkrivanje PrP^Sc

1. Probava proteinazom K:
   – Tretirajte uzorke proteinazom K (50 μg/mL) na 37°C tijekom 1 sata.
   – Prekinite probavu dodavanjem SDS-uzoračnog pufera i vrenjem 10 minuta.
2. Western blot analiza:
   – Analizirajte probavljene uzorke upotrebom:
   – protutijela 6H4 ili PRC1 anti-PrP.
   – Izvedite SDS-PAGE i prijenos na PVDF membrane radi otkrivanja.

 

Hielscher UIP400MTP najsvestraniji je sonikator za Vaše pločice s više jažica, PCR pločice ili epruvete za uzorke. Uz kontinuiranu izlaznu snagu sonikacije od 400 vata namijenjen je primjenama kao što su liza stanica, emulgiranje, ekstrakcija proteina, fragmentacija DNA / RNA, deaglomeracija, ekstrakcija iz FFPE uzoraka, odvajanje stanica i biofilmova ili emulgiranje. UIP400MTP nije ultrazvučna kupelj. To je ultrazvučni rezonator čašastog oblika visokog intenziteta za usmjerenu sonikaciju. Ovaj snažni beskontaktni sonikator osigurava ujednačenu sonikaciju u svim jažicama Vaše standardne pločice. Omogućuje precizno upravljanje amplitudom, snagom i impulsnim radom. Ugrađeni mjerač vremena i temperaturna sonda osiguravaju dosljedne rezultate. Sonikator za pločice UIP400MTP hladi uzorke vodenom kupelji, uz mogućnost dodatnog vanjskog rashladnog uređaja.

 

Obradite više uzoraka za robusnije rezultate

Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP znatno unaprijeđuje učinkovitost i skalabilnost ciklične amplifikacije pogrešno savijenih proteina (PMCA), s kojom se prevladava tradicionalno dugotrajna narav postupka. Omogućujući istovremenu obradu do 96 uzoraka u pločici sa 96 jažica, sustav pojednostavljuje PMCA protokole dok zadržava precizne i ujednačene uvjete sonikacije u svim jažicama. Ta visokopropusna sposobnost smanjuje ručno rukovanje, smanjuje broj radno intenzivnih koraka i osigurava reproducibilnost, čineći ga nezamjenjivim alatom za prionska istraživanja. Bilo da se istražuje bolest kronične iscrpljenosti ili Creutzfeldt-Jakobova bolest, UIP400MTP olakšava obimna istraživanja s većom učinkovitošću, čime istraživačima omogućuje zadovoljavanje zahtjeva modernih dijagnostičkih i znanstvenih primjena.

---

---

Literatura / Reference

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.