Stvaranje amiloidnih fibrila pomoću sonikatora za mikrotitarske ploče UIP400MTP

Amiloidne fibrile, slično kristalima, nastaju procesom nukleacije i naknadnog rasta. Međutim, zbog visoke barijere slobodne energije nukleacije, spontano stvaranje amiloidnih fibrila događa se tek nakon produljene faze kašnjenja. Sonikacija se pokazala kao moćan alat za poticanje nukleacije amiloida, čime se znatno ubrzava stvaranje fibrila. U kombinaciji s čitačem mikrotitarskih ploča koji mjeri fluorescenciju tioflavina T (ThT), sonikacija omogućuje istodobnu detekciju amiloidnih fibrila u velikom broju uzoraka.

Ultrazvučno potaknuto stvaranje amiloidnih fibrila sonikatorom za mikrotitarske ploče UIP400MTP

Sonikatorom za ploče s više jažica UIP400MTP mogu se brzo sintetizirati velike količine amiloidnih fibrila ujednačene kvalitete za istraživačke svrhe. Ovaj učinkovit pristup omogućuje proučavanje amiloidogenosti proteina. Ova tehnika olakšava brzu i reproducibilnu amiloidnu fibrilaciju, kao što je pokazano na β2-mikroglobulinu (β2-m), amiloidogenom proteinu povezanom s amiloidozom povezanom s dijalizom.

Jednostavan eksperimentalni pristup: ultrazvučno potaknuta amiloidna fibrilacija

Kako bi se potaknulo stvaranje fibrila, mikrotitarska ploča s 96 jažica postavljena je u središte sonikatora za ploče s više jažica UIP400MTP, koji osigurava ravnomjerno izlaganje ultrazvuku u svim jažicama. Eksperimentalni uvjeti bili su sljedeći:

Svaka jažica sadržavala je 0,2 ml otopine β2-mikroglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) uz dodatak 5 μM ThT-a.
Ploča je podvrgnuta ciklusima sonikacije, primjerice sonikaciji u trajanju od 1 minute nakon koje je slijedila stanka od 9 minuta.
Nakon sonikacije fluorescencija ThT-a izmjerena je čitačem mikrotitarskih ploča.

(usp. So i sur., 2011)

Hielscher UIP400MTP najsvestraniji je sonikator za Vaše pločice s više jažica, PCR pločice ili epruvete za uzorke. Uz kontinuiranu izlaznu snagu sonikacije od 400 vata namijenjen je primjenama kao što su liza stanica, emulgiranje, ekstrakcija proteina, fragmentacija DNA / RNA, deaglomeracija, ekstrakcija iz FFPE uzoraka, odvajanje stanica i biofilmova ili emulgiranje. UIP400MTP nije ultrazvučna kupelj. To je ultrazvučni rezonator čašastog oblika visokog intenziteta za usmjerenu sonikaciju. Ovaj snažni beskontaktni sonikator osigurava ujednačenu sonikaciju u svim jažicama Vaše standardne pločice. Omogućuje precizno upravljanje amplitudom, snagom i impulsnim radom. Ugrađeni mjerač vremena i temperaturna sonda osiguravaju dosljedne rezultate. Sonikator za pločice UIP400MTP hladi uzorke vodenom kupelji, uz mogućnost dodatnog vanjskog rashladnog uređaja.

Usporedba s konvencionalnim miješanjem

U usporedbi s tradicionalnim metodama miješanja, sonikacija je drastično skratila fazu kašnjenja pri stvaranju fibrila. U konvencionalnim uvjetima protresanja mikrotitarskih ploča samo je 1 od 10 jažica pokazala povećanu fluorescenciju ThT-a nakon 20 sati. Nasuprot tome, primjenom cikličke sonikacije (15 minuta sonikacije nakon koje slijedi 5 minuta mirovanja) znatno povećanje fluorescencije ThT-a otkriveno je odmah nakon prvog sonikacijskog tretmana.

Naglo ubrzanje kinetike fibrilacije

Rezultati istraživanja So i sur. (2011) pokazali su da se spontano stvaranje fibrila β2-mikroglobulina pri pH 2,5 sonikacijom može ubrzati s nekoliko sati na samo 10–15 minuta.
Snimke dobivene mikroskopijom atomskih sila (AFM) potvrdile su da se fibrile nastale sonikacijom u trajanju od 10 minuta svakih 15 minuta morfološki nisu razlikovale od onih nastalih sonikacijom u trajanju od 1 minute svakih 10 minuta. To ističe reproducibilnost i robusnost ultrazvučno potaknute amiloidne fibrilacije.

Sonikator za ploče s više jažica UIP400MTP ubrzava stvaranje amiloidnih fibrila ultrazvučnom nukleacijom

AFM snimke amiloidnih fibrila proizvedenih sonikacijom od 1 min svakih 10 min (i), sonikacijom od 10 min svakih 15 min (ii) i reakcijom zasijavanja bez sonikacije (iii). Bijela mjerna crta predstavlja 1 μm.
Istraživanje i snimke: ©So i sur., 2011

Fibrilacija pri neutralnom pH

Čak i pri neutralnom pH stvaranje fibrila postignuto je nakon vremena kašnjenja od 1,5 sati, što pokazuje da sonikacija znatno snižava energetsku barijeru nukleacije i rasta. To dodatno podupire hipotezu da je amiloidna fibrilacija prvenstveno fizikalna reakcija, uvelike ograničena energetskom barijerom nukleacije, koju sonikacija učinkovito snižava.

Utjecaj na istraživanje bolesti povezanih s amiloidom

Jednostavno i pouzdano stvaranje amiloidnih fibrila sonikatorom za mikrotitarske ploče UIP400MTP ima značajne implikacije za istraživanje Alzheimerove bolesti (AD) i drugih poremećaja povezanih s amiloidom, poput Parkinsonove bolesti, dijabetesa tipa II i sistemskih amiloidoza. Kod AD-a agregacija amiloida-β (Aβ) ključno je patološko obilježje, no proučavanje kinetike njegove fibrilacije i dalje je izazovno zbog dugih faza kašnjenja i varijabilnosti konvencionalnih metoda. Stvaranje fibrila potaknuto sonikacijom ubrzava nukleaciju, osiguravajući visoku reproducibilnost i smanjenu varijabilnost, što je ključno za probir potencijalnih inhibitora i razumijevanje amiloidogenih mehanizama. Nadalje, sposobnost uređaja UIP400MTP za obradu velikog broja uzoraka omogućuje opsežna istraživanja pogrešnog smatanja i agregacije proteina, olakšavajući otkrivanje terapijskih sredstava koja mogu modulirati stvaranje fibrila i potencijalno ublažiti napredovanje neurodegeneracije.

Ovo istraživanje potvrđuje sonikaciju sonikatorom za ploče s više jažica UIP400MTP kao vrlo učinkovitu metodu za ubrzavanje stvaranja amiloidnih fibrila. Ključne prednosti ovog pristupa uključuju:

Drastično skraćenje vremena kašnjenja fibrilacije.
Ravnomjerno izlaganje ultrazvuku u svim jažicama, što omogućuje reproducibilno stvaranje fibrila.
Mogućnost probira velikog broja uzoraka, što ovaj pristup čini prikladnim za pretraživanja amiloidogenosti proteina na razini cijelog genoma.

Povezivanjem sonikacije s detekcijom fluorescencije ThT-a ova metoda pruža brzu, skalabilnu i pouzdanu platformu za proučavanje amiloidne fibrilacije. S obzirom na učinkovitost i potencijal za obradu velikog broja uzoraka, ovaj pristup može olakšati jednostavnu sintezu amiloidnih fibrila za biofizička i farmaceutska istraživanja, nudeći obećavajući alat za istraživanja povezana s amiloidom i probir lijekova.

Povezane teme

Literatura / reference

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Često postavljana pitanja

Što je primarna nukleacija amiloida?

Primarna nukleacija amiloida početni je korak u stvaranju amiloidnih fibrila koji ograničava brzinu procesa, a pri kojem monomerni proteini prolaze kroz konformacijske promjene i spontano se udružuju u kritičnu jezgru. Ta jezgra služi kao predložak za daljnju agregaciju.

Kako nastaje fibrila kod amiloidoze?

Kod amiloidoze pogrešno smotani proteini agregiraju polimerizacijom ovisnom o nukleaciji. Nakon što se stvori jezgra, monomeri se brzo izdužuju u fibrile bogate β-pločama putem sekundarne nukleacije i rasta prema predlošku, što dovodi do nastanka amiloidnih naslaga.

Što je polimorfizam amiloidnih fibrila?

Polimorfizam amiloidnih fibrila odnosi se na strukturne varijacije fibrila koje tvori isti protein. Razlike u morfologiji fibrila, rasporedu protofilamenata i molekularnom pakiranju nastaju zbog okolišnih uvjeta, mutacija ili različitih putova agregacije.

Koja je razlika između amiloidnih fibrila i plakova?

Amiloidne fibrile linearni su proteinski agregati bogati β-pločama, dok su amiloidni plakovi izvanstanične naslage agregiranih fibrila, često pomiješanih s lipidima, metalima i staničnim ostacima, kakve se opažaju kod neurodegenerativnih bolesti poput Alzheimerove bolesti.

Koja je razlika između alfa-sinukleina i amiloida?

Alfa-sinuklein je neuronski protein uključen u sinaptičku funkciju, ali u patološkim uvjetima pogrešno se smata i stvara fibrile nalik amiloidu. „Amiloid” je opći naziv za pogrešno smotane fibrilarne proteinske agregate, dok su fibrile alfa-sinukleina specifične za bolesti poput Parkinsonove bolesti.

Što je proteinska fibrila?

Proteinska fibrila visoko je uređen, nitast agregat bogat β-pločama koji nastaje od pogrešno smotanih ili djelomično odmotanih proteina. Te su fibrile obično netopljive i nastaju polimerizacijom ovisnom o nukleaciji. Povezane su s različitim patološkim stanjima, uključujući amiloidoze i neurodegenerativne bolesti (npr. Alzheimerovu i Parkinsonovu bolest). Međutim, u biološkim sustavima postoje i neke funkcionalne proteinske fibrile, poput vlakana curli u bakterija i svilenih fibrila u pauka.