Formiranje amiloidnih fibrila pomoću UIP400MTP Microplate sonicatora

Amiloidne fibrile, poput kristala, nastaju kroz proces nukleacije i kasnijeg rasta. Međutim, zbog visoke barijere slobodne energije nukleacije, spontano stvaranje amiloidnih fibrila događa se tek nakon produljene lag faze. Ultrazvuk se pojavio kao moćan alat za induciranje nukleacije amiloida, čime se značajno ubrzava stvaranje fibrila. U kombinaciji s čitačem mikropločica koji koristi fluorescenciju tioflavina T (ThT), ultrazvučna obrada omogućuje detekciju amiloidnih fibrila visoke propusnosti u više uzoraka istovremeno.

Ultrazvučno inducirana formacija amiloidnih fibrila s UIP400MTP sonikatorom mikroploča

Uz UIP400MTP sonikator ploče s više jažica, amiloidna vlakna iste kvalitete u velikim količinama mogu se brzo sintetizirati u istraživačke svrhe. Ovaj učinkovit pristup omogućuje proučavanje amiloidogenosti proteina. Ova tehnika olakšava brzu i reproducibilnu amiloidnu fibrilaciju, kao što je pokazano s β2-mikroglobulinom (β2-m), amiloidogenim proteinom povezanim s amiloidozom povezanom s dijalizom.

Jednostavan eksperimentalni pristup: Ultrazvučno inducirana amiloidna fibrilacija

Kako bi se induciralo stvaranje fibrila, mikroploča s 96 jažica postavljena je u središte sonikatora ploče s više jažica UIP400MTP, što osigurava ravnomjerno izlaganje ultrazvuku u svim jažicama. Eksperimentalni uvjeti bili su sljedeći:

1. Svaka jažica sadržavala je 0,2 ml otopine β2-mikroglobulina (0,3 mg/ml, pH 2,5) dopunjene s 5 µM ThT.
2. Ploča je podvrgnuta ciklusima ultrazvučne obrade, kao što je 1-minutna ultrazvučna obrada nakon koje je uslijedila pauza od 9 minuta.
3. Nakon sonikacije, ThT fluorescencija je izmjerena pomoću čitača mikropločica.

(usp. So et al., 2011.)

Usporedba s konvencionalnim miješanjem

U usporedbi s tradicionalnim metodama miješanja, ultrazvučna obrada drastično je smanjila lag fazu stvaranja fibrila. Pod uobičajenim uvjetima mućkanja mikropločice, samo je 1 od 10 jažica pokazalo povećanu ThT fluorescenciju nakon 20 sati. Nasuprot tome, upotrebom cikličke ultrazvučne obrade (15 minuta sonikacije nakon koje slijedi 5 minuta mirovanja), značajno povećanje ThT fluorescencije otkriveno je odmah nakon prvog tretmana sonikacijom.

Rapid Acceleration of Fibrillation Kinetics

Rezultati dobiveni od So et al. (2011.) pokazali su da se spontano stvaranje fibrila β2-mikroglobulina pri pH 2,5 može ubrzati s nekoliko sati na samo 10-15 minuta ultrazvučnom obradom.
Slike mikroskopije atomske sile (AFM) potvrdile su da se fibrili generirani 10-minutnom ultrazvučnom obradom svakih 15 minuta morfološki ne razlikuju od onih formiranih 1-minutnom ultrazvučnom obradom svakih 10 minuta. Ovo naglašava ponovljivost i robusnost ultrazvučno inducirane amiloidne fibrilacije.

AFM slike amiloidnih fibrila proizvedenih 1-minutnom ultrazvučnom obradom svakih 10 minuta (i), 10-minutnom ultrazvučnom obradom svakih 15 minuta (ii) i reakcijom sijanja bez ultrazvučne obrade (iii). Bijela skala predstavlja 1 μm.
Studija i slike: ©So et al., 2011

Fibrilacija pri neutralnim pH uvjetima

Čak i pod neutralnim pH uvjetima, formiranje fibrila je postignuto nakon vremena kašnjenja od 1,5 sata, pokazujući da ultrazvučna obrada značajno smanjuje energetsku barijeru nukleaciji i rastu. Ovo dodatno podupire hipotezu da je amiloidna fibrilacija prvenstveno fizička reakcija, uvelike ograničena energetskom barijerom nukleacije, koju ultrazvučna obrada učinkovito smanjuje.

Utjecaj na istraživanje bolesti povezanih s amiloidom

Lako i pouzdano formiranje amiloidnih fibrila korištenjem sonikatora mikropločica UIP400MTP ima značajne implikacije za istraživanje Alzheimerove bolesti (AD) i drugih poremećaja povezanih s amiloidom, kao što su Parkinsonova bolest, dijabetes tipa II i sistemske amiloidoze. U AD-u, agregacija amiloida-β (Aβ) ključni je patološki znak, no proučavanje kinetike fibrilacije ostaje izazovno zbog dugih faza kašnjenja i varijabilnosti u konvencionalnim metodama. Formiranje fibrila potaknuto ultrazvučnom obradom ubrzava nukleaciju, osiguravajući visoku reproducibilnost i smanjenu varijabilnost, što je ključno za probir potencijalnih inhibitora i razumijevanje amiloidogenih mehanizama. Nadalje, sposobnost visoke propusnosti UIP400MTP omogućuje velika istraživanja pogrešnog savijanja i agregacije proteina, olakšavajući otkrivanje terapeutskih sredstava koja mogu modulirati stvaranje fibrila i potencijalno ublažiti neurodegenerativno napredovanje.

Ova studija utvrđuje ultrazvučnu obradu pomoću sonikatora ploča s više jažica UIP400MTP kao vrlo učinkovitu metodu za ubrzavanje stvaranja amiloidnih fibrila. Ključne prednosti ovog pristupa uključuju:

• Dramatično smanjenje vremena kašnjenja za fibrilaciju.
• Ujednačeno izlaganje ultrazvuku u svim jažicama, omogućavajući ponovljivo stvaranje fibrila.
• Mogućnost probira visoke propusnosti, što ga čini prikladnim za pretraživanje amiloidogenosti proteina na cijelom genomu.

Integriranjem ultrazvučne obrade s ThT fluorescentnom detekcijom, ova metoda pruža brzu, skalabilnu i pouzdanu platformu za proučavanje amiloidne fibrilacije. S obzirom na njegovu učinkovitost i potencijal velike propusnosti, ovaj pristup može olakšati laku sintezu amiloidnih fibrila za biofizička i farmaceutska istraživanja, nudeći obećavajući alat za studije povezane s amiloidom i probir lijekova.