טרנספורמציה גנטית בתאי צמח באמצעות אולטרסאונד

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) היא שיטה יעילה להדביק תאי צמח בגנים זרים באמצעות אגרובקטריום כטרנספורטר. קוויטציה קולית גורמת לסונופורציה, אשר ניתן לתאר כמיקרו-פצע ממוקד של רקמת הצמח. באמצעות אולטרה-סאונד זה יוצר מיקרו-פצעים, ניתן להעביר ביעילות וקטורי DNA ו-DNA לתוך מטריצת התא.

סונופורציה – טרנספורמציית תאים משופרת באולטרסאונד

כאשר אולטרסאונד בתדר נמוך (כ -20kHz) מוחל על מתלי תאים, ההשפעות של קוויטציה אקוסטית גורמות לחדירות קרום חולפת על רקמות התא. השפעה קולית זו ידועה בשם סונופורציה ומשמשת להעברת גנים לתאים או רקמות.
היתרונות של אולטרה-סוניקציה מבוססים על עקרון העבודה המכנית הלא-תרמית שלה, מה שהופך את הסוניקציה לעתים קרובות יותר תכליתית ופחות תלויה בסוגי תאים. היישום הרב-תכליתי של סונופורציה פותח את האפשרות לניצול צמחים טרנסגניים, שיש להם פוטנציאל משמעותי בייצור ביולוגי של חלבונים טיפוליים אנושיים מורכבים. ביוריאקטורים צמחיים כאלה יכולים להיות קלים למניפולציה גנטית, למנוע זיהום פוטנציאלי בפתוגנים אנושיים, אינם פוגעים בחיידקים מתווכי טרנספורמציה (למשל אגרובקטריום), והם שיטה זולה ויעילה לביוסינתזה.

טרנספורמציה של תאים בסיוע אולטראסוני

סוניקציה היא טכניקה המיישמת גלי אולטרסאונד בתדר נמוך כדי לעורר חלקיקים בתמיסה, לערבב תמיסות, ובכך להגביר את קצב העברת המסה וההמסה. במקביל, סוניקציה יכולה להסיר גזים מומסים מנוזלים. בטרנספורמציה של צמחים, סוניקציה תגרום להיווצרות מיקרו-פצעים על רקמת הצמח ותשפר את העברת הדנ"א העירום לתוך הפרוטופלסט של הצמח.

עבור טרנספורמציה גנטית, SAAT (Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation) היא השיטה המועדפת ויש לה יעילות גבוהה משמעותית מסוניקציה המשמשת להעברת וקטורי DNA ו-DNA עירומים ישירות לתוך הפרוטופלסט. מחקרים רבים הוכיחו כי הטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום (SAAT) בסיוע סוניקציה יכולה לשמש לגרימת שיבוש מכני והיווצרות פצעים על תאי צמחים על ידי גלי אולטרסאונד והקוויטציה האקוסטית הנובעת מכך. טיפול קולי קצר יוצר מיקרו פצעים על פני השטח של explants. מכיוון שהתאים הפגועים יאפשרו חדירה של אגרובקטריום לחלק העמוק יותר של רקמות הצמח, ובכך יגדילו את הסבירות לזיהום תאי צמחים. בנוסף, התרכובות הפנוליות המופרשות מגבירות את הטרנספורמציה. המיקרו-פצעים הנוצרים באולטרסאונד הופכים גם את חדירת הצמחים על ידי חיידקים לאפשרית יותר. SAAT שימש בהצלחה לטרנספורמציה גנטית במינים של צמחים הנחשבים במיוחד כעמידים בפני אגרובקטריום.
בהיותה שיטה פשוטה וזולה מאוד, כמו גם השיפור המשמעותי של העברת גנים בתיווך אגרובקטריום הם היתרונות העיקריים של SAAT. מלבד יישום מוצלח של SAAT בטרנספורמציה של Chenopodium rubrum L. ו- Beta vulgaris L., גישה זו יושמה גם בייצור של אדג'ובנטים רקומביננטיים של Escherichia coli מסוג חום-labile holotoxin ו- Escherichia coli mutant LT vaccine ב- Nicotiana tabacum, שבהם זוהו טיטרי IgG מערכתיים ספציפיים ל- LT-B הגבוהים ביותר בציפורים.
(ראה: Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

הליך כללי להעברת גנים באמצעות סונופורציה בתאי צמח

1. הכנת חומר גנטי: התחילו בהכנת החומר הגנטי שאתם רוצים להכניס לתאי הצמח. זה יכול להיות DNA פלסמיד, RNA, או חומצות גרעין אחרות.
2. בידוד תאי צמח: בודדו את תאי הצמח שברצונכם להתמקד בהם. בהתאם לניסוי שלך, תאים אלה עשויים להיות מבודדים מרקמות צמחים או תרביות.
3. השעיית תאים: מרחפים את תאי הצמח בתווך או חיץ מתאימים. זה חיוני כדי להבטיח כי התאים בריאים במצב תורם ספיגת גנים.
4. הגדירו את הסוניקטור שלכם: הכן את הסוניקטור מסוג בדיקה שלך על ידי סוניקציה להגדיר מראש פרמטרים כגון משרעת, זמן, אנרגיה וטמפרטורה. לטבול את הבדיקה קולי לתוך השעיית התא.
5. סוניקציה: התחל את הליך הסוניקציה. התנודה המהירה של קצה הבדיקה יוצרת בועות קוויטציה בנוזל. בועות אלה מתרחבות וקורסות עקב הגלים העל-קוליים, ויוצרות כוחות מכניים ומיקרו-סטרימינג בתרחיף.
6. סונופורציה: הכוחות המכניים והמיקרו-זרימה הנוצרים על ידי קוויטציה יוצרים באופן זמני נקבוביות וחורים בקרומים של תאי הצמח. החומר הגנטי הקיים בתרחיף יכול להיכנס לתאי הצמח דרך נקבוביות אלה.
7. דגירה: לאחר הטיפול בסונופורציה, דגרו על תאי הצמח כדי לאפשר להם להתאושש ולייצב את הממברנות שלהם. זהו צעד חיוני כדי להבטיח הישרדות תאים והעברת גנים מוצלחת.

העברת גנים באמצעות אגרובקטריום או ליפוזומים

ישנן שתי צורות נפוצות להעברת תאי צמח. הם משתמשים באגרובקטריום, סוג של חיידקים גראם-שליליים, או בליפוזומים כנשאים של החומר הגנטי.

• סונופורציה בתיווך אגרובקטריום: Agrobacterium tumefaciens הוא חיידק נפוץ בהנדסה גנטית של צמחים. בשיטה זו, DNA פלסמיד המכיל את הגן הרצוי הוא הציג לתוך Agrobacterium, אשר לאחר מכן מעורבב עם תאים צמחיים. השעיית התא נתונה לסונופורציה באמצעות סוניק מסוג בדיקה. האנרגיה העל-קולית מגבירה את העברת החומר הגנטי מאגרובקטריום לתאי הצמח. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לשינוי גנטי של צמחים.
• סונופורציה בתיווך ליפוזומים: ליפוזומים הם שלפוחיות מבוססות שומנים שיכולות לשאת חומר גנטי. בשיטה זו, ליפוזומים עמוסים בדנ"א פלסמיד או חומצות גרעין אחרות מעורבבים עם תאי צמחים. סונופורציה באמצעות סוניקטור מסוג בדיקה משמשת כדי להקל על ספיגת ליפוזומים על ידי תאי צמחים. האולטרסאונד משבש את דו-שכבות השומנים של הליפוזומים ומשחרר את החומר הגנטי לתאי הצמח. גישה זו שימושית למחקרי ביטוי גנים חולפים בתאי צמחים.

יתרונות מוכחים מדעית של טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום (SAAT) בסיוע סוניקציה

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) יושם על מיני צמחים רבים. טיפול אולטראסוני קצר ומתון יחסית בתרביות תאי צמחים גורם לסונופורציה, המאפשרת בהמשך חדירה עמוקה של אגרובקטריום כמוביל גנים. להלן תוכלו לקרוא מחקרים לדוגמה המדגימים את ההשפעות המועילות של SAAT.

טרנספורמציה בסיוע אולטרה-סאונד של ויתניה

על מנת לשפר את יעילות הטרנספורמציה ב- W. somnifera (המכונה אשווגנדה או דובדבן חורף), Dehdashti ועמיתיו (2016) חקרו את השימוש באצטוסירינגון (AS) וסוניקציה.
אצטוסירינגון (AS) נוסף בשלושה שלבים: תרבית נוזלית של אגרובקטריום, זיהום אגרובקטריום ותרבית משותפת של צמחים עם אגרובקטריום. תוספת של 75 מיקרומטר AS לתרבית נוזלית של אגרובקטריום נמצאה אופטימלית להשראת גנים של vir.
היישום הנוסף של סוניקציה (SAAT) הביא לביטוי הגנים הגבוה ביותר. ביטוי הגן gusA בשורשים שעירים נמצא כטוב ביותר כאשר העלים וקצות הנבטים היו סוניים במשך 10 ו -20, בהתאמה. יעילות הטרנספורמציה של הפרוטוקול המשופר נרשמה 66.5% ו -59.5% במקרה של צמחי קצה עלה ונבט, בהתאמה. בהשוואה לפרוטוקולים אחרים, יעילות השינוי של פרוטוקול משופר זה נמצאה גבוהה פי 2.5 עבור עלים ופי 3.7 יותר עבור קצות צילום. ניתוחי כתמים דרומיים אישרו 1-2 עותקים של טרנסגן gusA בקווים W1-W4, בעוד 1-4 עותקי טרנסגן התגלו בקו W5 שנוצר על ידי הפרוטוקול המשופר.

השפעת משך הזמן של טרנספורמציה מתווכת אגרובקטריום (SAAT) בסיוע סוניקציה על תדירות הטרנספורמציה של עלה W. somnifera (a) וקצה הירי (b) explants
(מחקר וגרפיקה: © Dehdashti et al., 2016)

טרנספורמציה בסיוע אולטרה-סאונד של כותנה

Hussain et al. (2007) מדגימים את ההשפעות המועילות של טרנספורמציית כותנה בסיוע סוניקציה. קוויטציה אקוסטית הנגרמת על ידי אולטרסאונד בתדר נמוך יוצרת מיקרו-פצעים על ומתחת לפני השטח של רקמת הצמח (סונופורציה) ומאפשרת לאגרובקטריום לנוע עמוק יותר ושלם ברחבי רקמת הצמח. צורת פציעה זו מגדילה את ההסתברות להדביק תאי צמח השוכנים עמוק יותר ברקמות. על מנת להעריך את יעילות הטרנספורמציה של SAAT, נמדד ביטוי הגן GUS. מערכת המדווח GUS היא מערכת גנים לכתב, שימושית במיוחד בביולוגיה מולקולרית של צמחים ובמיקרוביולוגיה. התאמת פרמטרים שונים של SAAT, ביטוי חולף GUS בכותנה באמצעות עוברים בוגרים כמו explant היה משופר באופן משמעותי. GUS זוהה לראשונה 24 שעות לאחר הדגירה של הצמחים ועד 48 שעות, ביטוי GUS היה אינטנסיבי מאוד אשר שימש אינדיקטור שימושי לשינוי מוצלח של צמח הכותנה בעקבות טרנספורמציה מתווכת אגרובקטריום בסיוע סוניקציה (SAAT). ההשוואה בין טכניקות טרנספורמציה שונות (כלומר ביוליסטית, אגרו, BAAT, SAAT), טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום (SAAT) בסיוע סוניקציה הראתה ללא ספק את התוצאות הטובות ביותר של טרנספורמציה.

בחירת הליך טרנספורמציה על בסיס ביטוי ארעי של GUS. טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום (SAAT) בסיוע סוניקציה מראה ביטוי ארעי גבוה יותר באופן משמעותי.
(מחקר וגרפיקה: © חוסיין ואחרים, 2007)

פתרונות על-קוליים בעלי ביצועים גבוהים עבור סונופורציה ו-SAAT

Hielscher Ultrasonics הוא זמן רב מנוסה בפיתוח וייצור של ultrasonicators ביצועים גבוהים עבור מעבדות, מתקני מחקר, כמו גם ייצור תעשייתי עם תפוקות גבוהות מאוד. עבור מיקרוביולוגיה ומדעי החיים, Hielscher מציעה פתרונות שונים כדי להתאים לדרישות שונות הדרושות עבור רקמות ספציפיות ואת הטיפולים שלהם. עבור ultrasonication בו זמנית של דגימות רבות Hielscher מציעה את UIP400MTP עבור לוחות multiwell, VialTweeter עבור סוניקציה של עד 10 בקבוקונים (למשל, צינורות Eppendorf) או CupHorn קולי. אולטרסוניקטורים מסוג בדיקה זמינים בין 50 ל -400 וואט כהומוגנייזרים במעבדה, בעוד שמערכות תעשייתיות מכסות את טווח ההספק בין 500 וואט ל -16 קילוואט.
אנא צור איתנו קשר והודע לנו על דרישות היישום והתהליך שלך. הצוות המנוסה שלנו ישמח להמליץ על האולטרסאונד המתאים ביותר לתהליך הביולוגי שלך.
הטבלה הבאה נותנת לך אינדיקציה ליכולת העיבוד המשוערת של האולטרסאונד שלנו: