טרנספורמציה גנטית בתאי צמח באמצעות אולטרסאונד

טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium בסיוע סוניקציה (SAAT) היא שיטה יעילה להחדרת גנים זרים לתאי צמח באמצעות הדבקה, תוך שימוש ב-Agrobacterium כנשא. קוויטציה אולטרסונית גורמת לסונופורציה, שניתן לתאר כיצירה ממוקדת של פצעים זעירים ברקמת הצמח. דרך פצעים זעירים אלה, הנוצרים באמצעות אולטרסאונד, ניתן להעביר ביעילות DNA ווקטורי DNA אל מטריצת התא.

סונופורציה – טרנספורמציה תאית משופרת באמצעות אולטרסאונד

כאשר מפעילים אולטרסאונד בתדר נמוך (כ-20kHz) על תרחיפי תאים, השפעות הקוויטציה האקוסטית גורמות לעלייה זמנית בחדירות הממברנות ברקמות התאים. השפעה אולטרסונית זו מכונה סונופורציה ומשמשת להעברת גנים לתאים או לרקמות.
יתרונות הטיפול באולטרסאונד מבוססים על עקרון הפעולה המכני הלא-תרמי שלו, שבזכותו סוניקציה היא לעיתים קרובות רב-תכליתית יותר ותלויה פחות בסוגי התאים. מגוון היישומים של סונופורציה פותח אפשרות לשימוש בצמחים טרנסגניים, בעלי פוטנציאל משמעותי לייצור ביולוגי של חלבונים אנושיים מורכבים לשימוש טיפולי. ביוריאקטורים כאלה, המבוססים על צמחים, ניתנים לשינוי גנטי בקלות, מונעים זיהום אפשרי בפתוגנים אנושיים, אינם פוגעים בחיידקים המתווכים את הטרנספורמציה (למשל Agrobacterium), ומהווים שיטה זולה ויעילה לביוסינתזה.

טרנספורמציה תאית בסיוע אולטרסאונד

סוניקציה היא טכניקה המשתמשת בגלי אולטרסאונד בתדר נמוך להנעת חלקיקים בתמיסה ולערבוב תמיסות, ובכך מגבירה את קצב מעבר המסה וההמסה. במקביל, סוניקציה יכולה להסיר גזים מומסים מנוזלים. בטרנספורמציה של צמחים, סוניקציה תגרום להיווצרות פצעים זעירים ברקמת הצמח ותגביר את החדרת ה-DNA העירום לפרוטופלסט הצמחי.

לטרנספורמציה גנטית, טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium בסיוע סוניקציה (SAAT) היא השיטה המועדפת, ויעילותה גבוהה באופן משמעותי מזו של סוניקציה המשמשת להעברה ישירה של DNA עירום ווקטורי DNA לפרוטופלסט. מחקרים רבים הראו שניתן להשתמש בטרנספורמציה בתיווך Agrobacterium בסיוע סוניקציה (SAAT) כדי לגרום לפירוק מכני ולהיווצרות פצעים בתאי צמח באמצעות גלי אולטרסאונד והקוויטציה האקוסטית הנוצרת בעקבותיהם. טיפול אולטרסוני קצר יוצר פצעים זעירים על פני מקטעי הצמח. התאים הפצועים יאפשרו ל-Agrobacterium לחדור לחלקים עמוקים יותר של רקמות הצמח, ובכך יגדילו את הסבירות להדבקת תאי הצמח. בנוסף, התרכובות הפנוליות המופרשות מגבירות את הטרנספורמציה. הפצעים הזעירים הנוצרים באמצעות אולטרסאונד גם מקלים על חדירת חיידקים למקטעי הצמח. SAAT שימשה בהצלחה לטרנספורמציה גנטית במיני צמחים הנחשבים עמידים במיוחד ל-Agrobacterium.
היתרונות העיקריים של SAAT הם פשטותה הרבה ועלותה הנמוכה, וכן השיפור המשמעותי בהעברת גנים בתיווך Agrobacterium. מלבד היישום המוצלח של SAAT בטרנספורמציה של Chenopodium rubrum L. ושל Beta vulgaris L., גישה זו יושמה גם לייצור ב-Nicotiana tabacum של הולוטוקסין רקומביננטי רגיש לחום של Escherichia coli מטיפוס הבר ושל אדג'ובנטים לחיסונים המבוססים על LT מוטנטי של Escherichia coli, ובמסגרת זו זוהו בעופות כיילי ה-IgG המערכתיים הספציפיים ל-LT-B הגבוהים ביותר.
(cf. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

הליך כללי להעברת גנים באמצעות סונופורציה בתאי צמח

1. הכנת החומר הגנטי: התחילו בהכנת החומר הגנטי שברצונכם להחדיר לתאי הצמח. חומר זה יכול להיות DNA פלסמידי, RNA או חומצות גרעין אחרות.
2. בידוד תאי צמח: בודדו את תאי הצמח שאליהם תרצו להחדיר את החומר הגנטי. בהתאם לניסוי שלכם, ניתן לבודד תאים אלה מרקמות צמחיות או מתרביות.
3. תרחיף תאים: הרחיפו את תאי הצמח במצע או בתמיסת בופר מתאימים. פעולה זו חיונית כדי להבטיח שהתאים בריאים ונמצאים במצב התורם לקליטת גנים.
4. הכנת מכשיר הסוניקציה: הכינו את מכשיר הסוניקציה בעל הגשושית באמצעות הגדרה מראש של פרמטרי הסוניקציה, כגון משרעת, זמן, אנרגיה וטמפרטורה. טבלו את הגשושית האולטרסונית בתרחיף התאים.
5. סוניקציה: התחילו בתהליך הסוניקציה. התנודה המהירה של קצה הגשושית יוצרת בועות קוויטציה בנוזל. בועות אלה מתפשטות וקורסות עקב הגלים האולטרסוניים, וכך יוצרות כוחות מכניים ומיקרו־זרימה בתרחיף.
6. סונופורציה: הכוחות המכניים והמיקרו־זרימה הנוצרים עקב קוויטציה יוצרים נקבוביות וחורים זמניים בקרומי תאי הצמח. החומר הגנטי המצוי בתרחיף יכול להיכנס לתאי הצמח דרך נקבוביות אלה.
7. הדגרה: לאחר טיפול הסונופורציה, הדגירו את תאי הצמח כדי לאפשר להם להתאושש ולייצב את קרומיהם. זהו שלב מכריע להבטחת הישרדות התאים והעברת גנים מוצלחת.

העברת גנים באמצעות Agrobacterium או ליפוזומים

קיימות שתי דרכים נפוצות להחדרת חומר גנטי לתאי צמח. בדרכים אלה משתמשים ב־Agrobacterium, סוג של חיידקים גראם־שליליים, או בליפוזומים כנשאים של החומר הגנטי.

• סונופורציה בתיווך Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens הוא חיידק הנמצא בשימוש נפוץ בהנדסה גנטית של צמחים. בשיטה זו מחדירים DNA פלסמידי המכיל את הגן הרצוי לחיידקי Agrobacterium, ולאחר מכן מערבבים אותם עם תאי צמח. תרחיף התאים עובר סונופורציה באמצעות מכשיר סוניקציה בעל גשושית. האנרגיה האולטרסונית מגבירה את העברת החומר הגנטי מ־Agrobacterium לתאי הצמח. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לשינוי גנטי של צמחים.
• סונופורציה בתיווך ליפוזומים: ליפוזומים הם שלפוחיות המבוססות על ליפידים, היכולות לשאת חומר גנטי. בשיטה זו מערבבים ליפוזומים הטעונים ב־DNA פלסמידי או בחומצות גרעין אחרות עם תאי צמח. משתמשים בסונופורציה באמצעות מכשיר סוניקציה בעל גשושית כדי להקל על קליטת הליפוזומים בתאי הצמח. האולטרסאונד משבש את השכבות הליפידיות הכפולות של הליפוזומים, וכך משחרר את החומר הגנטי לתוך תאי הצמח. גישה זו שימושית למחקרים על ביטוי גנים זמני בתאי צמח.

יתרונות מוכחים מדעית של טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium בסיוע סוניקציה (SAAT)

טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium בסיוע סוניקציה (SAAT) יושמה במיני צמחים רבים. טיפול אולטרסוני קצר ומתון יחסית בתרביות תאי צמח גורם לסונופורציה, המאפשרת לאחר מכן חדירה עמוקה של Agrobacterium כנשא גנים. להלן תוכלו לקרוא מחקרים לדוגמה המדגימים את ההשפעות המועילות של SAAT.

טרנספורמציה של אשווגנדה בסיוע אולטרסאונד

כדי לשפר את יעילות הטרנספורמציה ב־W. somnifera (המוכר כאשווגנדה או כדובדבן החורף), בדקו Dehdashti ועמיתיו (2016) את השימוש באצטוסירינגון (AS) ובסוניקציה.
אצטוסירינגון (AS) הוסף בשלושה שלבים: תרבית נוזלית של Agrobacterium, הדבקה ב־Agrobacterium ותרבית משותפת של מקטעי רקמה עם Agrobacterium. נמצא כי הוספת 75 μM AS לתרבית נוזלית של Agrobacterium הייתה מיטבית להשראת גני vir.
השימוש הנוסף בסוניקציה (SAAT) הניב את ביטוי הגנים הגבוה ביותר. נמצא כי ביטוי הגן gusA בשורשים שעירים היה מיטבי כאשר העלים וקצות הנצרים עברו סוניקציה במשך 10 ו־20s, בהתאמה. יעילות הטרנספורמציה של הפרוטוקול המשופר נרשמה כ־66.5 ו־59.5% במקטעי רקמה מעלים ומקצות נצרים, בהתאמה. בהשוואה לפרוטוקולים אחרים, נמצא כי יעילות הטרנספורמציה של פרוטוקול משופר זה הייתה גבוהה פי 2.5 בעלים ופי 3.7 בקצות נצרים. אנליזות תספיג Southern אישרו 1–2 עותקים של הטרנסגן gusA בקווים W1-W4, ואילו בקו W5 שנוצר באמצעות הפרוטוקול המשופר זוהו 1–4 עותקים של הטרנסגן.

השפעת משך הטרנספורמציה בתיווך Agrobacterium בסיוע סוניקציה (SAAT) על תדירות הטרנספורמציה במקטעי רקמה מעלים (a) ומקצות נצרים (b) של W. somnifera
(מחקר ותרשים: © Dehdashti et al., 2016)

טרנספורמציה של כותנה בסיוע אולטרסאונד

Hussain ועמיתיו (2007) מדגימים את ההשפעות המועילות של טרנספורמציה של כותנה בסיוע סוניקציה. קוויטציה אקוסטית הנגרמת מאולטרסאונד בתדר נמוך יוצרת פצעים זעירים על פני רקמת הצמח ומתחת לפני השטח שלה (סונופורציה), ומאפשרת ל־Agrobacterium לחדור עמוק יותר ולהתפשט בכל רקמת הצמח. אופן פציעה זה מגדיל את ההסתברות להדבקת תאי צמח הנמצאים בעומק הרקמה. כדי להעריך את יעילות הטרנספורמציה של SAAT, נמדד ביטוי הגן GUS. מערכת הדיווח GUS היא מערכת של גן מדווח, שימושית במיוחד בביולוגיה מולקולרית של צמחים ובמיקרוביולוגיה. התאמת פרמטרים שונים של SAAT הגבירה באופן מובהק את הביטוי החולף של GUS בכותנה, תוך שימוש בעוברים בשלים כמקטעי הרקמה לטרנספורמציה. GUS זוהה לראשונה 24h לאחר הדגרת מקטעי הרקמה, ובחלוף 48h ביטוי GUS היה חזק מאוד, ושימש מדד שימושי לטרנספורמציה מוצלחת של מקטע רקמת הכותנה בעקבות טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium בסיוע סוניקציה (SAAT). בהשוואה בין שיטות טרנספורמציה שונות (דהיינו ביוליסטיקה, Agro, BAAT, SAAT), טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium בסיוע סוניקציה (SAAT) הניבה את תוצאות הטרנספורמציה הטובות ביותר בפער ניכר.

בחירת הליך הטרנספורמציה על בסיס הביטוי החולף של GUS. טרנספורמציה בתיווך Agrobacterium בסיוע סוניקציה (SAAT) מציגה ביטוי חולף גבוה יותר באופן מובהק.
(מחקר ותרשים: © Hussain et al., 2007)

פתרונות אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים לסונופורציה ול־SAAT

ל-Hielscher Ultrasonics ניסיון רב שנים בפיתוח ובייצור של מכשירים אולטרסוניים בעלי ביצועים גבוהים למעבדות, למתקני מחקר וכן לייצור תעשייתי בתפוקות גבוהות מאוד. עבור מיקרוביולוגיה ומדעי החיים, Hielscher מציעה מגוון פתרונות למענה על הדרישות השונות של רקמות מסוימות והטיפולים בהן. לסוניקציה בו־זמנית של דגימות רבות, Hielscher מציעה את UIP400MTP לפלטות מרובות באריות, את VialTweeter לסוניקציה של עד 10 בקבוקונים (למשל, מבחנות Eppendorf) או את CupHorn האולטרסוני. מכשירים אולטרסוניים מסוג גשושית זמינים כהומוגנייזרים מעבדתיים בהספקים של 50 עד 400 וואט, ואילו המערכות התעשייתיות מכסות את טווח ההספקים שבין 500 וואט ל-16kW.
צרו איתנו קשר וספרו לנו על היישום שלכם ועל דרישות התהליך. הצוות המנוסה שלנו ישמח להמליץ על המכשיר האולטרסוני המתאים ביותר לתהליך הביולוגי שלכם.
הטבלה שלהלן מציגה את כושר העיבוד המשוער של המכשירים האולטרסוניים שלנו: