טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום בסיוע סוניקציה (SAAT) היא שיטה יעילה להדביק תאי צמחים בגנים זרים באמצעות אגרובקטריום כטרנספורטר. קוויטציה על-קולית גורמת לסונופורציה, אשר ניתן לתאר אותה כמיקרו-פציעה ממוקדת של רקמת הצמח. באמצעות אלה יוצרים באופן קולי מיקרו-פצעים, ניתן להעביר ביעילות וקטורים של דנ"א ודנ"א לתוך מטריצת התאים.

סונופורציה – טרנספורמציית תאים משופרת באופן קולי

כאשר אולטרסאונד בתדר נמוך (כ- 20kHz) מוחל על תרחיפי תאים, ההשפעות של קוויטציה אקוסטית גורמות לחלחלת קרום חולפת על רקמות התא. אפקט על-קולי זה ידוע בשם סונופורציה ומשמש להעברת גנים לתאים או לרקמות.
היתרונות של אולטרה-סוניזציה מבוססים על עקרון העבודה המכני הלא-תרמי שלה, מה שהופך את הסוניקה לעתים קרובות לרב-תכליתית יותר ותלויה פחות בסוגי תאים. היישום הרב-תכליתי של סונופורציה פותח את האפשרות לניצול של צמחים מהונדסים, שיש להם פוטנציאל משמעותי בייצור ביולוגי של חלבונים טיפוליים אנושיים מורכבים. ביו-ריאקטורים צמחיים כאלה יכולים לעבור מניפולציה גנטית קלה, למנוע זיהום פוטנציאלי עם פתוגנים אנושיים, לא לפגוע בחיידקים המתווכים בטרנספורמציה (למשל אגרובקטריום), והם שיטה זולה ויעילה לביו-סינתזה.

טרנספורמציית תאים בסיוע קולי

סוניקציה היא טכניקה המיישמת גלי אולטרסאונד בתדר נמוך כדי להתסיס חלקיקים בתמיסה, כדי לערבב תמיסות, ובכך להגדיל את קצב העברת המסה וההתמוססות. במקביל, סוניקציה יכולה להסיר גזים מומסים מנוזלים. בטרנספורמציה של צמחים, סוניקציה תגרום להיווצרות של מיקרו-וונדים על רקמת הצמח ותגביר את העברת הדנ"א העירום לפרוטופלסט הצמחי.

עבור טרנספורמציה גנטית, הטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום בסיוע סוניקציה (SAAT) היא השיטה המועדפת ויש לה יעילות גבוהה משמעותית מאשר סוניקציה המשמשת להעברת וקטורים של דנ"א ודנ"א עירומים ישירות לפרוטופלסט. מחקרים רבים הראו כי הטרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום (SAAT) בסיוע סוניקציה יכולה לשמש לגרימת הפרעה מכנית והיווצרות פצעים על תאי הצמח על ידי גלי אולטרסאונד והקוויטציה האקוסטית הנובעת מכך. טיפול על-קולי קצר יוצר מיקרו-פצעים על פני השטח של מתפוצצים. מכיוון שהתאים הפצועים יאפשרו חדירה של אגרובקטריום לחלק העמוק יותר של רקמות הצמח, ובכך יגדילו את הסבירות שתאי הצמח יידבקו. בנוסף, התרכובות הפנוליות המופרשות משפרות את הטרנספורמציה. המיקרו-פצעים הנוצרים באופן קולי הופכים את חדירת ההסבר על ידי חיידקים גם לאפשרית יותר. SAAT שימש בהצלחה לטרנספורמציה גנטית במיני צמחים שנחשבו במיוחד כעמידים בפני אגרובקטריום.
להיות שיטה פשוטה מאוד וזולה, כמו גם את השיפור המשמעותי של העברת גנים בתיווך Agrobacterium הם היתרונות העיקריים של SAAT. מלבד יישום מוצלח של SAAT בטרנספורמציה של Chenopodium rubrum L. ו- Beta vulgaris L., גישה זו יושמה גם בייצור של רקומביננטי Escherichia coli מסוג בר מסוג חום-labile holotoxin ו Escherichia coli מוטציה חיסון LT אדג'ובנטים ב Nicotiana tabacum, שבו titres IgG המערכתי הגבוה ביותר ספציפי LT-B זוהו בציפורים.
(ראה: Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

הליך כללי להעברת גנים באמצעות סונופורציה בתאי צמח

1. הכנת חומר גנטי: התחילו בהכנת החומר הגנטי שאתם רוצים להכניס לתאי הצמח. זה יכול להיות DNA פלסמיד, RNA, או חומצות גרעין אחרות.
2. בידוד תאי צמח: בודדו את תאי הצמח שברצונכם להתמקד בהם. בהתאם לניסוי שלך, תאים אלה עשויים להיות מבודדים מרקמות צמחים או תרביות.
3. השעיית תאים: מרחפים את תאי הצמח בתווך או חיץ מתאימים. זה חיוני כדי להבטיח כי התאים בריאים במצב תורם ספיגת גנים.
4. הגדירו את הסוניקטור שלכם: הכן את הסוניקטור מסוג בדיקה שלך על ידי סוניקציה להגדיר מראש פרמטרים כגון משרעת, זמן, אנרגיה וטמפרטורה. לטבול את הבדיקה קולי לתוך השעיית התא.
5. sonication: התחל את הליך הסוניקציה. התנודה המהירה של קצה הבדיקה יוצרת בועות קוויטציה בנוזל. בועות אלה מתרחבות וקורסות עקב הגלים העל-קוליים, ויוצרות כוחות מכניים ומיקרו-סטרימינג במתלים.
6. סונופורציה: הכוחות המכניים והמיקרו-זרימה הנוצרים על ידי קוויטציה יוצרים באופן זמני נקבוביות וחורים בקרומים של תאי הצמח. החומר הגנטי הקיים בתרחיף יכול להיכנס לתאי הצמח דרך נקבוביות אלה.
7. דגירה: לאחר הטיפול בסונופורציה, דגרו על תאי הצמח כדי לאפשר להם להתאושש ולייצב את הממברנות שלהם. זהו צעד חיוני כדי להבטיח הישרדות תאים והעברת גנים מוצלחת.

העברת גנים באמצעות אגרובקטריום או ליפוזומים

ישנן שתי צורות נפוצות להעברת תאי צמח. הם משתמשים באגרובקטריום, סוג של חיידקים גראם-שליליים, או בליפוזומים כנשאים של החומר הגנטי.

• סונופורציה בתיווך אגרובקטריום: Agrobacterium tumefaciens הוא חיידק נפוץ בהנדסה גנטית של צמחים. בשיטה זו, DNA פלסמיד המכיל את הגן הרצוי הוא הציג לתוך Agrobacterium, אשר לאחר מכן מעורבב עם תאים צמחיים. השעיית התא נתונה לסונופורציה באמצעות סוניק מסוג בדיקה. האנרגיה העל-קולית מגבירה את העברת החומר הגנטי מאגרובקטריום לתאי הצמח. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב לשינוי גנטי של צמחים.
• סונופורציה בתיווך ליפוזומים: ליפוזומים הם שלפוחיות מבוססות שומנים שיכולות לשאת חומר גנטי. בשיטה זו, ליפוזומים עמוסים בדנ"א פלסמיד או חומצות גרעין אחרות מעורבבים עם תאי צמחים. סונופורציה באמצעות סוניקטור מסוג בדיקה משמשת כדי להקל על ספיגת ליפוזומים על ידי תאי צמחים. האולטרסאונד משבש את דו-שכבות השומנים של הליפוזומים ומשחרר את החומר הגנטי לתאי הצמח. גישה זו שימושית למחקרי ביטוי גנים חולפים בתאי צמחים.

יתרונות מוכחים מדעית של טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום בסיוע סוניקציה (SAAT)

טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום בסיוע סוניקציה (SAAT) יושמה על מיני צמחים רבים. טיפול על-קולי קצר ומתון יחסית בתרביות תאים צמחיות גורם לסונופורציה, המאפשרת לאחר מכן חדירה עמוקה של אגרובקטריום כמוביל גנים. להלן תוכלו לקרוא מחקרים מופתיים המדגימים את ההשפעות המועילות של SAAT.

טרנספורמציה בסיוע קולי של אשווגנדה

על מנת לשפר את יעילות הטרנספורמציה ב- W. somnifera (המכונה ויתניה או דובדבן חורפי), דהדשטי ועמיתיו (2016) חקרו את השימוש באצטוסירינגון (AS) ובסוניקה.
אצטוסירינגון (AS) נוסף בשלושה שלבים: תרבית נוזלית של אגרובקטריום, זיהום אגרובקטריום ותרבית משותפת של אקסלנטים עם אגרובקטריום. התוספת של 75 μM AS לתרבית נוזלית של אגרובקטריום נמצאה כטובה ביותר להשראת גנים של vir.
היישום הנוסף של סוניקציה (SAAT) הביא לביטוי הגנים הגבוה ביותר. ביטוי הגנים gusA בשורשים שעירים נמצא כטוב ביותר כאשר העלים וקצות היריות הושמעו במשך 10 ו-20 שניות, בהתאמה. יעילות הטרנספורמציה של הפרוטוקול המשופר נרשמה 66.5 ו-59.5% במקרה של גולשי עלה ויורה, בהתאמה. בהשוואה לפרוטוקולים אחרים, יעילות הטרנספורמציה של פרוטוקול משופר זה נמצאה כגבוהה פי 2.5 עבור עלים ופי 3.7 יותר עבור טיפים לצילום. ניתוחי כתמים דרומיים אישרו 1-2 עותקים של הטרנסג'ין gusA בשורות W1-W4, בעוד 1-4 עותקים טרנסג'נדרים זוהו בשורה W5 שנוצרה על ידי הפרוטוקול המשופר.

השפעת משך הזמן של טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום בסיוע סוניקציה (SAAT) על תדירות הטרנספורמציה של עלה W. somnifera (a) וקצה יורה (b) מתפוצצים
(מחקר וגרפיקה: © Dehdashti et al., 2016)

טרנספורמציה בסיוע קולי של כותנה

Hussain et al. (2007) מדגימים את ההשפעות המועילות של טרנספורמציית כותנה בסיוע סוניקציה. קוויטציה אקוסטית הנגרמת על ידי אולטרסאונד בתדר נמוך יוצרת מיקרו-פצעים על ומתחת לפני השטח של רקמת הצמח (סונופורציה) ומאפשרת לאגרובקטריום לנוע עמוק יותר ובאופן מלא בכל רקמת הצמח. צורת פציעה זו מגדילה את ההסתברות להדבקת תאי צמחים הנמצאים עמוק יותר ברקמות. על מנת להעריך את יעילות הטרנספורמציה של SAAT, נמדד ביטוי גנים GUS. מערכת הכתבים GUS היא מערכת גנים מדווחת, שימושית במיוחד בביולוגיה מולקולרית של צמחים ובמיקרוביולוגיה. בהתאמת פרמטרים שונים של SAAT, ביטוי חולף GUS בכותנה באמצעות עוברים בוגרים כאקספלנט שופר באופן משמעותי. GUS זוהה לראשונה 24 שעות לאחר הדגירה של הגולשים וב-48 שעות, ביטוי ה-GUS היה אינטנסיבי מאוד, מה ששימש כאינדיקטור שימושי לטרנספורמציה מוצלחת של תוסף הכותנה בעקבות טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום בסיוע סוניקציה (SAAT). ההשוואה בין טכניקות טרנספורמציה שונות (כלומר ביוליסטיות, אגרו, BAAT, SAAT), טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום בסיוע סוניקציה (SAAT) הראתה ללא ספק את התוצאות הטובות ביותר של טרנספורמציה.

בחירת הליך טרנספורמציה על בסיס ביטוי חולף של GUS. טרנספורמציה בתיווך אגרובקטריום בסיוע סוניקציה (SAAT) מראה ביטוי ארעי גבוה יותר באופן משמעותי.
(מחקר וגרפיקה: © חוסיין ואח', 2007)

פתרונות על-קוליים בעלי ביצועים גבוהים עבור סונופורציה ו-SAAT

Hielscher Ultrasonics מנוסה זמן רב בפיתוח וייצור של ultrasonicators ביצועים גבוהים עבור מעבדות, מתקני מחקר, כמו גם ייצור תעשייתי עם תפוקות גבוהות מאוד. עבור מיקרוביולוגיה ומדעי החיים, Hielscher מציעה פתרונות שונים כדי להתאים לדרישות שונות הדרושות לרקמות ספציפיות ולטיפולים בהן. עבור האולטרה-סוניקציה הסימולטנית של דגימות רבות, Hielscher מציעה את UIP400MTP עבור לוחות מולטי-וול, את ה-VialTweeter עבור ה-sonication של עד 10 בקבוקונים (למשל, צינורות אפנדורף) או את ה-CupHorn האולטרה-קולי. אולטראסוקטורים מסוג בדיקה זמינים בין 50 ל-400 וואט כהומוגנייזרי מעבדה, בעוד שמערכות תעשייתיות מכסות את טווח ההספק שבין 500 וואט ל-16 קילוואט.
אנא צור איתנו קשר והודע לנו על דרישות הבקשה והתהליך שלך. הצוות המנוסה שלנו ישמח להמליץ על האולטרה-סוניקטור המתאים ביותר לתהליך הביולוגי שלכם.
הטבלה להלן נותן לך אינדיקציה של יכולת עיבוד משוער של ultrasonicators שלנו: