סוניקציה לליזיס של תאים: פירוק תאים ומיצוי
ליזיס אולטרסוני של תאים הוא טכניקה נפוצה להכנת דגימות במעבדות ביוטכנולוגיה מודרניות. מטרתו העיקרית היא לפרק ממברנות תאים או תאים שלמים כדי לשחרר רכיבים תוך־תאיים כגון חלבונים, חומצות גרעין או אברונים. בעבודת המעבדה היומיומית, משמעות הדבר היא שסוניקציה היא שיטה מקובלת לפירוק מבוקר של תאים ולמיצוי יעיל של ביומולקולות. היתרון המרכזי של מכשירי סוניקציה טמון ביכולתם לווסת במדויק פרמטרים קריטיים של התהליך, ובהם עוצמת האולטרסאונד, הפעלה בפולסים ובקרת טמפרטורה. שליטה זו מאפשרת לחוקרים להשיג ליזיס אמין תוך מזעור הנזק התרמי או המכני לביומולקולות רגישות, וכך מתקבל תהליך מיצוי עדין אך יעיל ביותר.
ליזיס של תאים באמצעות מכשירי סוניקציה
ליזיס אולטרסוני של תאים מנצל קוויטציה אקוסטית לפירוק ממברנות תאים ולשחרור מולקולות תוך־תאיות. Hielscher Ultrasonics מציעה את מכשיר הסוניקציה הקלאסי מסוג גשוש וכן מכשירי סוניקציה למספר דגימות לעיבוד סטרילי: VialTweeter למספר מבחנות ובקבוקונים ומכשיר הסוניקציה לפלטות בעלות 96 באריות UIP400MTP למיקרופלטות סטנדרטיות.
Hielscher Ultrasonics מספקת מכשירי סוניקציה רבי־עוצמה ללא מגע להכנת דגימות ולאנליזה קלינית. מכשיר הסוניקציה לפלטות מרובות באריות UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn ומכשיר הסוניקציה בזרימה GDmini2 מעבדים את הדגימות בתנאים סטריליים.
הומוגנייזרים אולטרסוניים UP100H (100 וואט) ו־UP400St (400 וואט): סוניקציה לליזיס של תאים ולמיצוי.
הומוגנייזרים אולטרסוניים לליזיס של תאים ולמיצוי
| סוג המכשיר האולטרסוני | יישום עיקרי | נפח הדגימה | שימוש אופייני | יתרונות | דגמים לדוגמה |
|---|---|---|---|---|---|
| מכשירי סוניקציה מסוג גשוש | סוניקציה של דגימה יחידה | 0.1 mL עד ~1000 mL | ליזיס של תאים, מיצוי חלבונים, פרגמנטציה של DNA/RNA | בקרת אנרגיה מדויקת; מגוון סונוטרודות; מיטביים לדגימות קטנות עד בינוניות | UP100H, UP200St, UP400St |
| VialTweeter / CupHorn | עיבוד מקביל של מספר בקבוקונים אטומים | 8–10 בקבוקונים (~1–20 mL כל אחד) | ליזיס בתנאים אחידים של מספר תרחיפי תאים | סוניקציה אחידה; מניעת זיהום צולב; תוצאות הניתנות לשחזור | VialTweeter, CupHorn |
| מכשיר סוניקציה לפלטות בעלות 96 באריות | סוניקציה של פלטות מרובות באריות ופלטות מיקרוטיטר | פורמט מיקרופלטה | סריקה בתפוקה גבוהה, פרוטאומיקה, מבחנים תאיים | סוניקציה בו־זמנית ואחידה בכל הבאריות; אידיאלי לתהליכי עבודה עם מספר דגימות | UIP400MTP |
| ריאקטורים עם תאי זרימה | סוניקציה רציפה לנפחים גדולים יותר | >1 L, ניתן להגדלה בקנה מידה | פירוק תאים בקנה מידה תעשייתי, ייצור מיצויים | עיבוד רציף; ניתן להגדלה בקנה מידה; בקרה מלאה על התהליך (משרעת, לחץ, טמפרטורה) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + תא זרימה |
| מערכות סוניקציה סטריליות / עקיפות | עיבוד דגימות ללא זיהום | תלוי בבקבוקון/במבחנה/במיקרופלטה | דגימות רגישות, סביבות סטריליות, סביבות הכפופות לדרישות רגולטוריות | ללא מגע עם גשוש; מניעת העברת שאריות בין דגימות; מאמץ ניקוי מזערי | VialTweeter, CupHorn, UIP400MTP |
יתרונות השימוש בסוניקציה לליזיס של תאים
בהשוואה לשיטות אחרות לליזיס של תאים ולמיצוי, לליזיס אולטרסוני של תאים יש כמה יתרונות:
- מהירות: ליזיס אולטרסוני של תאים ומיצוי אולטרסוני הם שיטה מהירה שיכולה לבקע תאים בתוך שניות ספורות. שיטה זו מהירה בהרבה משיטות אחרות כגון הומוגניזציה, הקפאה והפשרה או טחינה בחרוזים.
- יעילות: ניתן להשתמש בליזיס אולטרסוני של תאים ובמיצוי אולטרסוני לטיפול בדגימות קטנות, גדולות או מרובות בבת אחת, ולכן שיטה זו יעילה יותר משיטות אחרות המחייבות עיבוד נפרד של דגימות קטנות.
- ללא כימיקלים: ליזיס אולטרסוני של תאים ומיצוי אולטרסוני הם שיטה לא פולשנית שאינה מחייבת שימוש בכימיקלים אגרסיביים או באנזימים. תכונה זו הופכת אותה לאידיאלית ליישומים שבהם יש לשמור על שלמות תכולת התא. ניתן למנוע זיהום לא רצוי של הדגימות.
- תפוקה גבוהה: ליזיס אולטרסוני של תאים ומיצוי אולטרסוני מאפשרים למצות תכולה תאית בתפוקה גבוהה, לרבות DNA, RNA וחלבונים. זאת משום שגלי הקול בתדר גבוה מבקעים את דופנות התאים ומשחררים את תכולתם לתמיסה הסובבת.
- בקרת טמפרטורה: מכשירי אולטרסאונד מתקדמים מאפשרים בקרת טמפרטורה מדויקת של הדגימה. מכשירי הסוניקציה הדיגיטליים של Hielscher מצוידים בחיישן טמפרטורה שניתן לחיבור ובתוכנה לניטור טמפרטורה.
- ניתן לשחזור: ניתן לשחזר בקלות פרוטוקולים לליזיס אולטרסוני של תאים ואף להתאים אותם לנפחי דגימות שונים, גדולים יותר או קטנים יותר, באמצעות הגדלה ליניארית פשוטה של קנה המידה.
- רב־תכליתי: ניתן להשתמש בליזיס ובמיצוי אולטרסוניים של תאים למיצוי מגוון רחב של סוגי תאים, ובהם חיידקים, שמרים, פטריות, תאי צמח ותאי יונקים. ניתן להשתמש בהם גם למיצוי סוגים שונים של מולקולות, ובהם חלבונים, DNA, RNA וליפידים.
- הכנה בו־זמנית של דגימות רבות: Hielscher Ultrasonics מציעה מספר פתרונות לעיבוד נוח של דגימות רבות בתנאי תהליך זהים בדיוק. כך שלב הכנת הדגימות באמצעות ליזיס ומיצוי נעשה יעיל ביותר וחוסך זמן.
- קל לשימוש: ציוד לליזיס ולמיצוי אולטרסוניים של תאים קל לשימוש ודורש הכשרה מינימלית. הציוד גם חסכוני, שכן מדובר בהשקעה חד־פעמית ללא צורך ברכישה חוזרת של חומרים מתכלים חד־פעמיים. הדבר הופך אותו לאפשרות אטרקטיבית עבור מגוון רחב של חוקרים ומעבדות.
בסך הכול, ליזיס ומיצוי אולטרסוניים של תאים הם שיטה מהירה, יעילה, ניתנת לבקרה מדויקת ורב־תכליתית למיצוי תכולת תאים. יתרונותיה על פני שיטות חלופיות הופכים אותה לבחירה אטרקטיבית למגוון רחב של יישומים במחקר ובתעשייה.
עקרון הפעולה של ליזיס אולטרסוני של תאים
ליזיס ומיצוי אולטרסוניים של תאים משתמשים בגלי קול בתדר גבוה לפירוק תאים ולמיצוי תכולתם. גלי הקול יוצרים שינויי לחץ בנוזל הסובב, הגורמים להיווצרות בועות קטנות ולקריסתן בתהליך המכונה קוויטציה. בועות אלו יוצרות כוחות מכניים מקומיים עזים ביותר, שיכולים לבקע תאים ולשחרר את תכולתם לתמיסה הסובבת.
ליזיס של תאים באמצעות מכשיר אולטרסאונד כולל בדרך כלל את השלבים הבאים:
- הדגימה מוכנסת למבחנה או למכל עם תמיסת בופר.
- גשוש אולטרסוני מוחדר לדגימה, ומופעלים גלי קול בתדר גבוה של כ־20–30 kHz.
- גלי האולטרסאונד גורמים לתנודות ולקוויטציה בנוזל הסובב, ויוצרים כוחות מקומיים המבקעים תאים ומשחררים את תכולתם.
- הדגימה עוברת צנטריפוגה או סינון להסרת כל שאריות התאים, והתכולה שמוצתה נאספת לאנליזה בהמשך.
חסרונות של שיטות ליזיס נפוצות
במהלך עבודתכם במעבדות, ייתכן שכבר נתקלתם בקשיים הכרוכים בליזיס של תאים באמצעות פרוטוקולים מסורתיים לליזיס מכני או כימי.
- ליזיס מכני: שיטות ליזיס מכני, כגון כתישה במכתש ועלי או הומוגניזציה באמצעות מכבש פרנץ', טחנת חרוזים או מערכת רוטור־סטטור, חסרות לעיתים קרובות אפשרויות בקרה וכוונון מדויקות. פירוש הדבר הוא שהשימוש בטחינה ובכתישה עלול לייצר במהירות חום וכוחות גזירה העלולים לפגוע בדגימה ולגרום לדנטורציה של חלבונים. שיטות אלו עלולות גם לגזול זמן ולדרוש כמויות גדולות של חומר מוצא.
- ליזיס כימי: שיטות ליזיס כימי, כגון ליזיס המבוסס על דטרגנטים, עלולות לפגוע בדגימה באמצעות פגיעה בדו־שכבה הליפידית וגרימת דנטורציה של חלבונים. הן עשויות גם לדרוש שלבים מרובים ועלולות להותיר שאריות מזהמים המפריעות ליישומים בהמשך. מציאת המינון המיטבי של הדטרגנט היא אתגר נוסף.
- מחזורי הקפאה והפשרה: מחזורי הקפאה והפשרה יכולים לגרום לקריעה של קרומי התאים, אך מחזורים חוזרים עלולים גם לגרום לדנטורציה ולפירוק של חלבונים. שיטה זו עשויה גם לדרוש מחזורים מרובים, דבר שעלול לגזול זמן ולעיתים קרובות מוביל לתפוקות נמוכות יותר.
- ליזיס אנזימטי: שיטות ליזיס אנזימטי עשויות להיות ספציפיות לסוגי תאים מסוימים ולדרוש שלבים מרובים, ולכן הן גוזלות זמן. הן גם מייצרות פסולת ומחייבות אופטימיזציה קפדנית כדי למנוע התפרקות של הדגימה. ערכות לליזיס אנזימטי הן לעיתים קרובות יקרות. אם הליך הליזיס האנזימטי הנוכחי שלכם מניב תוצאות שאינן מספקות, ניתן להשתמש בסוניקציה כשיטה סינרגטית להגברת פירוק התאים.
בהשוואה לשיטות מכניות וכימיות קונבנציונליות לליזיס של תאים, סוניקציה היא כלי יעיל ואמין מאוד לפירוק תאים, המאפשר שליטה מלאה בפרמטרים של הסוניקציה. כך מובטחים סלקטיביות גבוהה בשחרור החומרים וטוהר המוצר. [ראו Balasundaram et al., 2009]
היא מתאימה לכל סוגי התאים וקלה ליישום בקנה מידה קטן וגדול – תמיד בתנאים מבוקרים. מכשירים אולטרסוניים קלים לניקוי. הומוגנייזר אולטרסוני כולל תמיד פונקציות לניקוי במקום (CIP) ולעיקור במקום (SIP). הסונוטרודה עשויה מקרן טיטניום מסיבית, שניתן לנגב או לשטוף במים או בממס (בהתאם לתווך העבודה). בזכות עמידותם, התחזוקה הנדרשת למכשירים אולטרסוניים זניחה כמעט לחלוטין.
ליזיס אולטרסוני ופירוק תאים
בדרך כלל, ליזיס של דגימות במעבדה נמשך בין 15 שניות ל־2 דקות. מכיוון שקל מאוד להתאים את עוצמת הסוניקציה באמצעות קביעת המשרעת ומשך הסוניקציה, וכן באמצעות בחירת הציוד המתאים, ניתן לפרק את קרומי התאים בעדינות רבה או בפתאומיות רבה, בהתאם למבנה התא ולמטרת הליזיס (למשל, מיצוי DNA דורש סוניקציה עדינה יותר, ואילו מיצוי מלא של חלבונים מחיידקים דורש טיפול אולטרסוני עוצמתי יותר). ניתן לנטר את הטמפרטורה במהלך התהליך באמצעות חיישן טמפרטורה משולב ולשלוט בה בקלות באמצעות קירור (אמבט קרח או תאי זרימה בעלי מעטפות קירור) או באמצעות סוניקציה במצב פעימות. במהלך סוניקציה במצב פעימות, מחזורי סוניקציה קצרים בני 1–15 שניות מאפשרים פיזור חום וקירור במהלך ההפסקות הארוכות יותר שביניהם.
כל התהליכים המונעים באמצעות אולטרסאונד ניתנים לשחזור מלא ולהגדלת קנה המידה באופן ליניארי.
VialTweeter הוא הומוגנייזר אולטרסוני להכנה סטרילית בו־זמנית, אחידה ומהירה של דגימות רבות.
- הכנת תרחיף התאים: יש להרחיף את משקעי התאים במלואם בתמיסת בופר באמצעות הומוגניזציה (בחרו תמיסת בופר התואמת לאנליזה שתתבצע בהמשך, למשל לשיטת כרומטוגרפיה מסוימת). הוסיפו ליזוזימים ו/או תוספים אחרים לפי הצורך (גם הם חייבים להתאים לאמצעי ההפרדה/הטיהור). ערבבו את התמיסה בעדינות או בצעו בה הומוגניזציה בעדינות, תוך סוניקציה מתונה, עד לקבלת תרחיף מלא.
קראו עוד על הסינרגיה של ליזוזימים בשילוב עם סוניקציה! - ליזיס אולטרסוני: הניחו את הדגימה באמבט קרח. לפירוק התאים, בצעו סוניקציה של התרחיף בפרצים בני 60–90 שניות (באמצעות מצב הפעימות של מכשיר הסוניקציה שלכם).
- הפרדה: סרכזו את הליזט (למשל 10 min. ב־10,000 x g; ב־4degC). הפרידו בזהירות את הנוזל העליון ממשקע התאים. הנוזל העליון הוא ליזט התאים הכולל. לאחר סינון הנוזל העליון מתקבל נוזל צלול המכיל את החלבון התאי המסיס.
היישומים הנפוצים ביותר של מכשירים אולטרסוניים בביולוגיה ובביוטכנולוגיה הם:
- הכנת מיצויי תאים
- פירוק שמרים, חיידקים, תאי צמחים, רקמות תאים רכות או קשות וחומר נוקלאיני
- מיצוי חלבונים
- הכנה ובידוד של אנזימים
- ייצור אנטיגנים
- מיצוי DNA ו/או פרגמנטציה ממוקדת
- הכנת ליפוזומים
פירוק תאים באמצעות מכשיר אולטרסוני מסוג גשוש הוא שיטה יעילה להכנת דגימות.
היישומים הרבים של אולטרסאונד משתרעים על תחומי הביוטכנולוגיה, הביו־הנדסה, המיקרוביולוגיה, הביולוגיה המולקולרית, הביוכימיה, האימונולוגיה, הבקטריולוגיה, הווירולוגיה, הפרוטאומיקה, הגנטיקה, הפיזיולוגיה, הביולוגיה התאית, ההמטולוגיה והבוטניקה.
ליזיס: פירוק מבנים תאיים
התאים מוגנים באמצעות קרום פלזמה חדיר למחצה, המורכב מדו־שכבה פוספוליפידית (גם דו־שכבה של חלבונים וליפידים; הנוצרת מליפידים הידרופוביים וממולקולות זרחן הידרופיליות, שבתוכה משובצות מולקולות חלבון), ויוצר מחסום בין פנים התא (הציטופלזמה) לבין הסביבה החוץ־תאית. תאי צמחים ותאים פרוקריוטיים מוקפים בדופן תא. בשל דופן התא העבה המורכבת משכבות רבות של תאית, קשה יותר לבצע ליזיס של תאי צמחים מאשר של תאי בעלי חיים. שלד התא מייצב את המרכיבים הפנימיים של התא, כגון האברונים, הגרעין והמיטוכונדריון.
מטרת הליזיס של התאים היא למצות ולהפריד את האברונים, החלבונים, ה-DNA, ה-mRNA או ביומולקולות אחרות.
שיטות מקובלות לליזיס של תאים וחסרונותיהן
יש כמה שיטות לליזיס של תאים, שאפשר לחלקן לשיטות מכניות וכימיות. שיטות אלה כוללות שימוש בדטרגנטים או בממסים, הפעלת לחץ גבוה, או שימוש בטחנת חרוזים או במכבש פרנץ'. החיסרון הבעייתי ביותר של שיטות אלה הוא הקושי לשלוט בפרמטרים של התהליך ולכוונן אותם, ובכך גם לשלוט בהשפעת התהליך.
הטבלה שלהלן מציגה את החסרונות העיקריים של שיטות ליזיס נפוצות:
טבלה: לשיטות מקובלות לליזיס של תאים יש חסרונות משמעותיים
הליך הליזיס
ליזיס הוא תהליך רגיש. במהלך הליזיס נהרסת ההגנה שמספק קרום התא, אך יש למנוע השבתה, דנטורציה ופירוק של החלבונים שמוצו עקב סביבה שאינה פיזיולוגית (סטייה מערך ה-pH). לכן, בדרך כלל מבצעים ליזיס בתמיסת בופר. רוב הקשיים נובעים מפירוק תאים בלתי מבוקר, הגורם לשחרור בלתי ממוקד של כל החומר התוך־תאי ו/או לדנטורציה של תוצר המטרה.
שאלות נפוצות על סוניקציה וליזיס של תאים
- האם אפשר לבצע ליזיס של תאים באמצעות סוניקציה? כן, סוניקציה מבצעת ליזיס של תאים ביעילות באמצעות גלים אולטרסוניים בתדירות גבוהה, המחוללים קוויטציה – תופעה שבה בועות אדים זעירות נוצרות וקורסות בעוצמה בתוך תרחיף התאים. הכוחות המכניים הנוצרים מפרקים את קרומי התאים ומסייעים לשחרור רכיבים תוך־תאיים אל הנוזל.
- כיצד משתמשים בסוניקטור לליזיס של תאים? השימוש בסוניקטור לליזיס של תאים כולל טבילת הגשוש של הסוניקטור בתרחיף תאים וכוונון פרמטרים כגון משרעת ומשך הפולס. יש לנטר את התהליך בקפידה כדי לייעל את פירוק התאים תוך מזעור דנטורציה של חלבונים והשבתת אנזימים.
- מהו עקרון הפעולה של סוניקציה לליזיס של תאים? סוניקציה פועלת על פי עקרון הקוויטציה האקוסטית. אנרגיה אולטרסונית מועברת לתווך הנוזלי וגורמת לתנודות לחץ מהירות, המובילות להיווצרות מיקרו־בועות ולקריסתן פנימה. קריסות אלה יוצרות כוחות גזירה עזים וטמפרטורות גבוהות באופן מקומי, מפרקות מבנים תאיים ומשפרות את אחידות הליזט.
- כמה זמן נמשכת סוניקציה לליזיס של תאים? משך הסוניקציה לליזיס של תאים עשוי להשתנות במידה ניכרת בהתאם לגורמים כגון סוג התאים, צפיפות התאים, הספק הסוניקטור והפרוטוקול המסוים שבו משתמשים. הליכים טיפוסיים עשויים להימשך מכמה שניות עד כמה דקות, ולעיתים קרובות מבוצעים במחזורים כדי לווסת את יצירת החום ולהבטיח פירוק אחיד של התאים.
- מהי מטרת הסוניקציה במיצוי חלבונים? במיצוי חלבונים, סוניקציה משמשת לקריעה יעילה של קרומי התאים ולהמסה של חלבונים. שיטה זו מועילה במיוחד לשחרור חלבונים מתוך מדורים תאיים, ולכן היא חיונית להכנת ליזטים שמהם יטוהרו חלבונים או שבהם ייערך ניתוח של החלבונים.
- מדוע משתמשים בסוניקציה למיצוי? סוניקציה היא שיטה מועדפת למיצוי בזכות פעולתה המהירה ויכולתה להפעיל אנרגיה ממוקדת, המפרקת מבנים תאיים כדי לשחרר מולקולות בעלות פעילות ביולוגית ללא שימוש בטיפולים כימיים אגרסיביים, ובכך שומרת על השלמות התפקודית של התרכובות שמוצו.
- האם סוניקציה משבשת אינטראקציות בין חלבונים? סוניקציה יכולה לפרק ביעילות קרומי תאים, אך היא עשויה גם לשבש אינטראקציות בין חלבונים. מידת השיבוש תלויה בעוצמת הסוניקציה ובמשך החשיפה, ועלולה להוביל לדנטורציה או להתפרקות של קומפלקסים חלבוניים, דבר שעשוי להשפיע על מחקרים אנליטיים או תפקודיים בהמשך.
- האם ניתן להשתמש בסוניקציה לליזיס של E. coli? הסוניקטורים של Hielscher יעילים במיוחד לליזיס של תאי חיידקים כגון E. coli, בעלי דופנות תא עמידות. הטכניקה מספקת שיטה פיזיקלית לגזירת דופן התא והקרום, ולכן היא שיטה מועדפת להכנת ליזטים חיידקיים במעבדות לביולוגיה מולקולרית ולביוכימיה.
- אילו תהליכים מתבצעים לאחר שלב הסוניקציה?
שלבי ההמשך לאחר ליזיס אולטרסוני כוללים בדרך כלל הפרדה של הליזט למקטעים, בידוד ממוקד של אברונים ומיצוי או טיהור נוספים של חלבונים.
לאחר מכן הליזט המעובד מופרד ומוכן ליישומים אנליטיים או תפקודיים, כגון פרוטאומיקה ברזולוציה גבוהה, טרנסקריפטומיקה או מחקרי קישור לקולטנים.
ספרות/מקורות
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.