סוניקציה לליזה של תאים: שיבוש ומיצוי תאים
פירוק תאים באמצעות אולטרסאונד הוא טכניקה נפוצה להכנת דגימות במעבדות ביוטכנולוגיה מודרניות. מטרתה העיקרית היא לשבש את קרום התאים או את התאים עצמם על מנת לשחרר רכיבים תאיים כגון חלבונים, חומצות גרעין או אברונים. בעבודה מעבדתית יומיומית, פירוק תאים באמצעות אולטרסאונד הוא שיטה מקובלת לפירוק תאים מבוקר ולמיצוי יעיל של מולקולות ביולוגיות. היתרון העיקרי של מכשירי סוניקציה טמון ביכולתם לווסת במדויק פרמטרים קריטיים בתהליך, כולל עוצמת הקול, הפעימות ובקרת הטמפרטורה. בקרה זו מאפשרת לחוקרים להשיג ליזיס אמין תוך מזעור הנזק התרמי או המכני למולקולות ביולוגיות רגישות, וכתוצאה מכך מתקבל תהליך מיצוי עדין אך יעיל ביותר.
תמוגה תאים באמצעות מכשירי סוניקציה
פירוק תאים באמצעות אולטרסאונד מנצל קוויטציה אקוסטית כדי לשבש את קרום התאים ולשחרר מולקולות תאיות. Hielscher Ultrasonics מציעה סוניקטור קלאסי מסוג בדיקה, כמו גם סוניקטורים רב-דגימה לעיבוד סטרילי: VialTweeter למספר מבחנות ובקבוקונים, ו-96-Well Plate Sonicator UIP400MTP למיקרו-צלחות סטנדרטיות.
Hielscher Ultrasonics מספקת סוניקטורים חזקים ללא מגע להכנת מדגם וניתוח קליני. סוניקטור הצלחת רב הבאר UIP400MTP, ה-VialTweeter, הגביע והסוניקטור הזרימה GDmini2 לעבד את הדגימות בתנאים סטריליים.
הומוגנייזרים על-קוליים UP100H (100 וואט) ו-UP400St (400 וואט): סוניקציה לליזה וחילוץ תאים.
הומוגנייזרים קוליים עבור ליזה התא מיצוי
| סוג מכשיר אולטראסוני | התמקדות ביישום | נפח לדוגמה | מקרה שימוש טיפוסי | יתרונות | דוגמאות לדגמים |
|---|---|---|---|---|---|
| סוניקטורים מסוג בדיקה | סוניקציה של דגימה בודדת | 0.1 מ"ל עד ~1000 מ"ל | פירוק תאים, מיצוי חלבונים, פיצול DNA/RNA | בקרת אנרגיה מדויקת; סונוטרודים שונים; אופטימלי לדגימות קטנות עד בינוניות | UP100H, UP200ST, UP400ST |
| VialTweeter / CupHorn | עיבוד מקביל של מספר בקבוקונים אטומים | 8–10 בקבוקונים (כ-1–20 מ"ל כל אחד) | ליזיס סטנדרטי של תמיסות תאים מרובות | סוניקציה אחידה; מונעת זיהום צולב; תוצאות ניתנות לשחזור | VialTweeter, קופהורן |
| סוניקטור לפלטה עם 96 שקעים | סוניקציה של צלחות רב-תאיות ומיקרו-טיטר | פורמט מיקרו-פלטה | סינון בתפוקה גבוהה, פרוטאומיקה, בדיקות תאים | סוניקציה סימולטנית ואחידה בכל הבארות; אידיאלי לעבודה עם דגימות מרובות | UIP400MTP |
| כורי תאי זרימה | סוניקציה רציפה לנפחים גדולים יותר | >1 ליטר, ניתן להרחבה | פירוק תאים בקנה מידה תעשייתי, ייצור תמציות | עיבוד רציף; ניתן להרחבה; בקרה מלאה על התהליך (אמפליטודה, לחץ, טמפרטורה) | UIP1000hdT, UIP2000hdT + תא זרימה |
| מערכות סוניקציה סטריליות / עקיפות | עיבוד דגימות ללא זיהום | תלוי בבקבוקון/צינור/מיקרו-צלחת | דגימות רגישות, סביבות סטריליות, הגדרות רגולטוריות | אין מגע עם החללית; מונע העברה; ניקוי מינימלי | VialTweeter, קופהורן, UIP400MTP |
יתרונות השימוש בסוניקציה לליזה של תאים
בהשוואה לשיטות אחרות של ליזה וחילוץ תאים, לליזה של תאים על-קוליים יש מספר יתרונות:
- מהירות: ליזה וחילוץ תאים אולטראסוניים היא שיטה מהירה שיכולה לשבור תאים פתוחים תוך שניות. זה הרבה יותר מהר מאשר שיטות אחרות כגון הומוגניזציה, הקפאה-הפשרה או טחינת חרוזים.
- יעילות: ניתן להשתמש בליזה ובמיצוי של תאים אולטראסוניים לטיפול בדגימות קטנות, גדולות או מרובות בבת אחת, מה שהופך אותו ליעיל יותר משיטות אחרות הדורשות עיבוד פרטני של דגימות קטנות.
- ללא כימיקליםליזה ומיצוי תאים אולטראסוניים היא שיטה לא פולשנית שאינה דורשת שימוש בכימיקלים או אנזימים קשים.: זה הופך אותו לאידיאלי עבור יישומים שבהם יש לשמור על שלמות תוכן התא. זיהום לא רצוי של דגימות ניתן להימנע.
- תשואה גבוהה: ליזה ומיצוי של תאים על-קוליים יכולים לחלץ תפוקה גבוהה של תוכן תאי, כולל DNA, RNA וחלבונים. הסיבה לכך היא שגלי הקול בתדר גבוה פורצים את דפנות התא ומשחררים את התוכן לתמיסה שמסביב.
- בקרת טמפרטורה: אולטרה-סאונד מתוחכם מאפשר בקרת טמפרטורה מדויקת של הדגימה. הסוניקטורים הדיגיטליים של Hielscher מצוידים בחיישן טמפרטורה הניתן לחיבור ובתוכנת ניטור טמפרטורה.
- ניתן לשחזור: פרוטוקולים לליזה של תאים על-קוליים ניתנים לשכפול בקלות ואפילו להתאמה לנפחי דגימה גדולים או קטנים יותר על ידי הרחבה ליניארית פשוטה.
- רב-תכליתי: ניתן להשתמש בליזה ובמיצוי של תאים על-קוליים כדי לחלץ מגוון רחב של סוגי תאים, כולל חיידקים, שמרים, פטריות, תאי צמחים ויונקים. ניתן להשתמש בו גם כדי לחלץ סוגים שונים של מולקולות, כולל חלבונים, דנ"א, רנ"א ושומנים.
- הכנה סימולטנית של דוגמאות רבות: Hielscher Ultrasonics מציעה מספר פתרונות כדי לעבד בנוחות דגימות רבות תחת אותם תנאי תהליך בדיוק. זה הופך את שלב הכנת הדגימה של ליזה ומיצוי יעיל מאוד וחוסך זמן.
- קל לשימוש: ליזה תאים קוליים וציוד חילוץ קל לשימוש ודורש הכשרה מינימלית. הציוד הוא גם חסכוני שכן מדובר בהשקעה בודדת ללא דרישה לרכישה חוזרת של סילוקים. זה עושה את זה אטרקטיבי עבור מגוון רחב של חוקרים ומעבדות.
באופן כללי, ליזה וחילוץ תאים על-קוליים היא שיטה מהירה, יעילה, ניתנת לשליטה מדויקת ורב-תכליתית לחילוץ תוכן תאי. יתרונותיו על פני שיטות חלופיות הופכים אותו לבחירה אטרקטיבית עבור מגוון רחב של יישומי מחקר ותעשייה.
עקרון העבודה של ליזה תא קולי
ליזה וחילוץ תאים על-קוליים משתמשים בגלי קול בתדר גבוה כדי לשבש תאים ולחלץ את תוכנם. גלי הקול יוצרים שינויי לחץ בנוזל שמסביב, וגורמים לבועות קטנות להיווצר ולקרוס בתהליך המכונה קוויטציה. בועות אלה מייצרות כוחות מכניים מקומיים בעוצמה גבוהה שיכולים לשבור תאים פתוחים ולשחרר את תכולתם לתמיסה שמסביב.
ליזה של תאים באמצעות אולטרסאונד כוללת בדרך כלל את השלבים הבאים:
- הדגימה ממוקמת בצינור או במיכל עם חיץ נוזלי.
- בדיקה קולית מוכנסת לדגימה, וגלי קול בתדר גבוה עם כ. 20-30 קילוהרץ מוחלים.
- גלי האולטרסאונד גורמים לתנודה וקוויטציה בנוזל שמסביב, ויוצרים כוחות מקומיים השוברים תאים פתוחים ומשחררים את תכולתם.
- הדגימה עוברת צנטריפוגה או סינון כדי להסיר פסולת תאית, והתכולה שחולצה נאספת לניתוח במורד הזרם.
חסרונות של שיטות ליזה נפוצות
במהלך עבודתך במעבדות, ייתכן שכבר חווית את הטרחה של ליזה של תאים באמצעות פרוטוקולי ליזה מכניים או כימיים מסורתיים.
- ליזה מכנית: שיטות ליזה מכניות, כגון השחזה עם טיט ופשט או הומוגניזציה באמצעות מכבש צרפתי, טחנת חרוזים, או מערכת רוטור-סטטור לעתים קרובות חסרות אפשרויות בקרה והתאמה מדויקות. משמעות הדבר היא שהשימוש בטחינה וטחינה יכול לייצר במהירות כוחות חום וגזירה שיכולים לפגוע בדגימה ולנטרל חלבונים. הם יכולים גם לגזול זמן רב ודורשים כמויות גדולות של חומר התחלתי.
- ליזה כימית: שיטות ליזה כימיות, כגון ליזה מבוססת דטרגנט, יכולות להזיק לדגימה על ידי שיבוש דו-שכבתי השומנים וחלבוני דנטורציה. הם יכולים גם לדרוש שלבים מרובים ועשויים להשאיר מזהמים שיוריים המפריעים ליישומים במורד הזרם. מציאת המינון האופטימלי של חומר ניקוי היא אתגר נוסף.
- מחזורי הקפאה-הפשרה: מחזורי הקפאה-הפשרה עלולים לגרום לקרומי התאים להיקרע, אך מחזורים חוזרים ונשנים יכולים גם לגרום לדנטורציה ופירוק חלבונים. שיטה זו יכולה גם לדרוש מחזורים מרובים, אשר יכול להיות זמן רב ולעתים קרובות מביא יבולים נמוכים יותר.
- ליזה אנזימטית: שיטות ליזה אנזימטיות יכולות להיות ספציפיות לסוגי תאים מסוימים ודורשות שלבים מרובים, מה שהופך אותן לגוזלות זמן. הם גם מייצרים פסולת ודורשים אופטימיזציה זהירה כדי למנוע השפלה של המדגם. ערכות ליזה אנזימטיות הן לעתים קרובות יקרות. אם הליך הליזה האנזימטי הנוכחי שלך אינו נותן תוצאות מספיקות, ניתן ליישם סוניקציה כשיטה סינרגטית כדי להגביר את שיבוש התא.
בניגוד לשיטות מכניות וכימיות קונבנציונליות של ליזה תאית, סוניקציה היא כלי יעיל ואמין מאוד להתפוררות תאים המאפשר שליטה מלאה על פרמטרי הסוניקציה. זה מבטיח סלקטיביות גבוהה על שחרור חומרים וטוהר המוצר. [ראה: Balasundaram et al., 2009]
הוא מתאים לכל סוגי התאים וניתן ליישם אותו בקלות בקנה מידה קטן וגדול – תמיד בתנאים מבוקרים. Ultrasonicators קל לנקות. הומוגנייזר על-קולי כולל תמיד פונקציית ניקוי במקום (CIP) וסטריליזה במקום (SIP). הסונוטרוד מורכב מקרן טיטניום מסיבית אשר ניתן לנגב או לשטוף במים או ממס (בהתאם למדיום העבודה). תחזוקה של ultrasonicators הוא בשל החוסן שלהם כמעט הזניח.
ליזה קולית ושיבוש תאים
בדרך כלל, ליזה של דגימות במעבדה ייקח בין 15 שניות ל 2 דקות. מכיוון שקל מאוד לכוונן את עוצמת הסוניקציה על ידי קביעת זמן סוניקציה על ידי משרעת וכן על ידי בחירת הציוד הנכון, ניתן לשבש את קרום התא בעדינות רבה או בפתאומיות רבה, בהתאם למבנה התא ולמטרה של ליזה (למשל, מיצוי DNA דורש סוניקציה רכה יותר, מיצוי חלבון מלא של חיידקים דורש טיפול אולטרסאונד אינטנסיבי יותר). הטמפרטורה במהלך התהליך ניתנת לניטור על ידי חיישן טמפרטורה משולב וניתן לשלוט בה בקלות על ידי קירור (אמבט קרח או תאי זרימה עם מעילי קירור) או על ידי סוניקציה במצב פולסים. במהלך סוניקציה במצב פולס, מחזורי פרץ סוניקציה קצרים של 1-15 שניות מאפשרים פיזור חום וקירור בפרקי זמן ארוכים יותר לסירוגין.
כל התהליכים המונעים על ידי אולטרסאונד ניתנים לשחזור לחלוטין וניתנים להרחבה ליניארית.
ה-VialTweeter הוא הומוגנייזר קולי להכנה סטרילית סימולטנית, אחידה ומהירה של דגימות רבות.
- הכנת מתלה התא: כדורי התא חייבים להיות תלויים לחלוטין בתמיסת חיץ על ידי הומוגניזציה (בחר את פתרון החיץ שלך התואם לניתוח הבא, למשל שיטת כרומטוגרפיה ספציפית). להוסיף ליזואנזים ו/או תוספים אחרים, במידת הצורך (עליהם להתאים גם לאמצעי הפרדה/טיהור). מערבבים/הומוגניים את התמיסה בעדינות תחת סוניקציה עדינה עד לקבלת מתלה מלא.
קרא עוד על הסינרגיה של ליזוזים בשילוב עם סוניקציה! - ליזה קולית: הניחו את הדגימה באמבט קרח. להפרעה בתאים, הפעל את המתלים בהתפרצויות של 60-90 שניות (באמצעות מצב פולס של הסוניקטור).
- הפרדה: צנטריפוגה של הליזט (למשל 10 דקות ב-10,000 x גרם; ב-4 מעלות צלזיוס). הפרידו בזהירות את הסופרנאטנט מכדורית התא. הסופרנאטנט הוא סך כל התא ליזט. לאחר סינון של supernatant, אתה מקבל נוזל מזוהר של חלבון התא המסיס.
היישומים הנפוצים ביותר עבור ultrasonicators בביולוגיה וביוטכנולוגיה הם:
- הכנת תמצית תאים
- הפרעה של שמרים, חיידקים, תאי צמחים, רקמת תאים רכים או קשים, חומר גרעין
- מיצוי חלבונים
- הכנה ובידוד של אנזימים
- ייצור אנטיגנים
- מיצוי DNA ו/או פיצול ממוקד
- הכנת ליפוזומים
הפרעה בתאים עם אולטרסאונד מסוג בדיקה היא שיטת הכנת דגימה יעילה.
היישומים הרבים של אולטרסאונד מסתעפים בענפי הביוטכנולוגיה, ביו-הנדסה, מיקרוביולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, ביוכימיה, אימונולוגיה, בקטריולוגיה, וירולוגיה, פרוטאומיקה, גנטיקה, פיזיולוגיה, ביולוגיה תאית, המטולוגיה ובוטניקה.
ליזיס: שבירת מבני תאים
התאים מוגנים על ידי קרום פלזמה חדיר למחצה המורכב מדו-שכבה פוספו-ליפידית (גם דו-שכבה חלבונית-ליפידית; נוצרת על ידי ליפידים הידרופוביים ומולקולות זרחן הידרופיליות עם מולקולות חלבון משובצות) ויוצרת מחסום בין פנים התא (ציטופלסמה) לבין הסביבה החוץ תאית. תאי צמחים ותאים פרוקריוטים מוקפים בדופן התא. בשל שכבות מרובות של דופן תאים עבה של תאית, תאים צמחיים קשים יותר לשקר מאשר תאים של בעלי חיים. פנים התא, כגון אברונים, גרעין, מיטוכונדריה, מיוצב על ידי שלד התא.
על ידי שקר התאים, הוא נועד לחלץ ולהפריד אברונים, חלבונים, DNA, mRNA או ביומולקולות אחרות.
שיטות קונבנציונליות של ליזה התאית וחסרונותיהן
ישנן מספר שיטות לתאי ליזט, אשר ניתן לחלק לשיטות מכניות וכימיות, הכוללות שימוש בדטרגנטים או ממסים, יישום לחץ גבוה, או שימוש בטחנת חרוזים או במכבש צרפתי. החיסרון הבעייתי ביותר של שיטות אלה הוא הבקרה הקשה וההתאמה של פרמטרים בתהליך ובכך השפעה.
הטבלה הבאה מציגה את החסרונות העיקריים של שיטות ליזה נפוצות:
טבלה: לשיטות קונבנציונליות של ליזה של תאים יש חסרונות עיקריים
הליך של ליזיס
ליזה היא תהליך רגיש. במהלך הליזה ההגנה על קרום התא נהרסת, אולם יש למנוע את ההשבתה, הדנטורציה וההשפלה של החלבונים המופקים על ידי סביבה לא פיזיולוגית (סטייה מערך ה- pH). לכן, באופן כללי ליזה מתבצעת בתמיסת חיץ. רוב הקשיים נובעים משיבוש בלתי מבוקר של התאים וכתוצאה מכך שחרור לא ממוקד של כל החומר התוך תאי או/ו דנטורציה של מוצר המטרה.
שאלות נפוצות לגבי Sonication and Cell Lysis
- האם אתה יכול ליזה תאים עם סוניקציה? כן, סוניקציה משרתת תאים ביעילות באמצעות גלים על-קוליים בתדר גבוה שגורמים לקוויטציה, תופעה שבה בועות אדים זעירות נוצרות וקורסות באלימות בתוך תרחיף התא. הכוחות המכניים הנובעים מכך משבשים את קרום התא ומקלים על שחרור רכיבים תוך תאיים לתוך הנוזל.
- כיצד להשתמש sonicator עבור ליזה התא? שימוש בסוניקטור עבור ליזה של תאים כרוך בטבילת הגשושית הסוניקטור לתוך מתלה התא והתאמת פרמטרים כגון משרעת ומשך הדופק. יש לעקוב מקרוב אחר התהליך כדי למטב את שיבוש התאים תוך מזעור דנטורציה של חלבונים ונטרול אנזימים.
- מהו עקרון הסוניקציה עבור ליזה של תאים? סוניקציה פועלת על העיקרון של קוויטציה אקוסטית. אנרגיה קולית מועברת למדיום הנוזלי, וגורמת לתנודות לחץ מהירות המובילות להיווצרות וקריסה של מיקרו-בועות. קריסות אלה יוצרות כוחות גזירה אינטנסיביים וטמפרטורות גבוהות מקומיות, משבשות מבנים תאיים ומשפרות את הומוגניות הליזט.
- כמה זמן אורכת סוניקציה של ליזה תאית? משך הסוניקציה של ליזה התאית יכול להשתנות באופן משמעותי בהתאם לגורמים כמו סוג התא, צפיפות התא, עוצמת הסוניקטור והפרוטוקול הספציפי שבו משתמשים. הליכים אופייניים עשויים לנוע בין מספר שניות למספר דקות, המבוצעים לעתים קרובות במחזורים כדי לנהל את ייצור החום ולהבטיח הפרעה אחידה לתאים.
- מהי מטרת הסוניקציה במיצוי חלבונים? במיצוי חלבונים, סוניקציה משמשת לקרע יעיל של קרום התא ולמסיסים חלבונים. שיטה זו שימושית במיוחד לשחרור חלבונים מתוך תאי התא, מה שהופך אותה חיונית להכנת ליזטים שמהם יש לטהר או לנתח חלבונים.
- מדוע סוניקציה משמשת לחילוץ? סוניקציה מועדפת למיצוי בשל פעולתה המהירה ויכולתה להפעיל אנרגיה ממוקדת, פירוק מבנים תאיים לשחרור מולקולות ביו-אקטיביות ללא שימוש בטיפולים כימיים קשים, ובכך לשמור על שלמותן התפקודית של התרכובות המופקות.
- האם סוניקציה משבשת אינטראקציות חלבון-חלבון? בעוד סוניקציה יכולה לשבש ביעילות את קרום התא, היא עלולה גם לשבש אינטראקציות חלבון-חלבון. רמת ההפרעה תלויה בעוצמת הסוניקציה ובמשך החשיפה, מה שעלול להוביל לדנטורציה או דיסוציאציה של קומפלקסים חלבוניים, מה שעשוי להשפיע על מחקרים אנליטיים או פונקציונליים הבאים.
- האם ניתן להשתמש בסוניקציה כדי ליזה E. coli? הסוניקטורים של Hielscher יעילים במיוחד לשכיבת תאי חיידקים כגון E. coli, שיש להם דפנות תאים חזקות. הטכניקה מספקת שיטה פיזיקלית לגזירת דופן התא וקרום התא, מה שהופך אותה לשיטה מועדפת להכנת ליזטים חיידקיים במעבדות ביולוגיה מולקולרית וביוכימיה.
- מהם התהליכים הבאים לאחר שלב הסוניקציה?
שלבים הבאים לאחר פירוק אולטראסוני כוללים בדרך כלל הפרדת תוצרי הפירוק, בידוד ממוקד של אברונים, והמשך מיצוי או טיהור חלבונים.
הליזט המעובד מופרד לאחר מכן ומוכן ליישומים אנליטיים או פונקציונליים, כגון פרוטאומיקה ברזולוציה גבוהה, טרנסקריפטומיקה או מחקרים על קישור קולטנים.
ספרות/מקורות
- Balasundaram, B.; Harrison, S.; Bracewell, D. G. (2009): Advances in product release strategies and impact on bioprocess design. Trends in Biotechnology 27/8, 2009. pp. 477-485.
- Vilkhu, K.; Manasseh, R.; Mawson, R.; Ashokkumar, M. (2011): Ultrasonic Recovery and Modification of Food ingredients. In: Feng/ Barbosa-Cánovas/ Weiss (2011): Ultrasound Technologies for Food and Bioprocessing. New York: Springer, 2011. pp. 345-368.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
- Brandy Verhalen, Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.