تراریختی ژنتیکی در سلول‌های گیاهی با استفاده از فراصوت
تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT) روشی کارآمد برای آلوده‌سازی سلول‌های گیاهی با ژن‌های خارجی با استفاده از Agrobacterium به‌عنوان ناقل است. کاویتاسیون فراصوتی موجب سونوپوریشن می‌شود که می‌توان آن را ایجاد ریززخم‌های هدفمند در بافت گیاهی توصیف کرد. از طریق این ریززخم‌های ایجادشده با فراصوت، DNA و ناقل‌های DNA می‌توانند به‌طور کارآمد به ماتریس سلولی منتقل شوند.
سونوپوریشن – تراریختی سلولی تقویت‌شده با فراصوت
هنگامی که فراصوت با فرکانس پایین (حدود 20kHz) به سوسپانسیون‌های سلولی اعمال می‌شود، اثرات کاویتاسیون آکوستیکی موجب نفوذپذیرشدن گذرای غشا در بافت‌های سلولی می‌شوند. این اثر فراصوتی سونوپوریشن نام دارد و برای انتقال ژن به سلول‌ها یا بافت‌ها استفاده می‌شود.
مزایای فراصوت‌دهی بر اصل عملکرد مکانیکی و غیرحرارتی آن استوار است؛ اصلی که اغلب فراصوت‌دهی را چندمنظوره‌تر و وابستگی آن را به نوع سلول کمتر می‌کند. کاربرد چندمنظورهٔ سونوپوریشن امکان بهره‌گیری از گیاهان تراریخته را فراهم می‌کند که ظرفیت قابل‌توجهی برای تولید زیستی پروتئین‌های درمانی پیچیدهٔ انسانی دارند. چنین زیست‌راکتورهای گیاه‌پایه‌ای را می‌توان به‌آسانی از نظر ژنتیکی دست‌کاری کرد؛ آن‌ها از آلودگی احتمالی با عوامل بیماری‌زای انسانی جلوگیری می‌کنند، به باکتری‌های واسطهٔ تراریختی (مانند Agrobacterium) آسیب نمی‌رسانند و روشی کم‌هزینه و مؤثر برای زیست‌سنتز هستند.
سونیکاتور UP200St (200W, 26kHz) همراه با محفظهٔ عایق صدا
تراریختی سلولی به کمک فراصوت
فراصوت‌دهی روشی است که از امواج فراصوت با فرکانس پایین برای به‌حرکت‌درآوردن ذرات در محلول و اختلاط محلول‌ها استفاده می‌کند و در نتیجه سرعت انتقال جرم و انحلال را افزایش می‌دهد. هم‌زمان، فراصوت‌دهی می‌تواند گازهای محلول را از مایعات خارج کند. در تراریختی گیاهی، فراصوت‌دهی موجب تشکیل ریززخم‌ها در بافت گیاهی می‌شود و رساندن DNA برهنه به درون پروتوپلاست گیاهی را بهبود می‌بخشد.
برای تراریختی ژنتیکی، تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT) روش ترجیحی است و در مقایسه با فراصوت‌دهی برای انتقال مستقیم DNA برهنه و ناقل‌های DNA به درون پروتوپلاست، کارایی به‌مراتب بالاتری دارد. مطالعات متعدد نشان داده‌اند که می‌توان از تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT) برای القای تخریب مکانیکی و ایجاد زخم در سلول‌های گیاهی به‌وسیلهٔ امواج فراصوت و کاویتاسیون آکوستیکی حاصل از آن‌ها استفاده کرد. یک تیمار کوتاه فراصوتی ریززخم‌هایی روی سطح ریزنمونه‌ها ایجاد می‌کند. سلول‌های زخمی امکان نفوذ Agrobacterium به بخش‌های عمیق‌تر بافت‌های گیاهی را فراهم می‌کنند و در نتیجه احتمال آلوده‌شدن سلول‌های گیاهی افزایش می‌یابد. افزون بر این، ترکیبات فنولی ترشح‌شده تراریختی را تقویت می‌کنند. ریززخم‌های ایجادشده با فراصوت همچنین نفوذ باکتری‌ها به ریزنمونه را تسهیل می‌کنند. SAAT برای تراریختی ژنتیکی گونه‌های گیاهی که به‌ویژه مقاوم به Agrobacterium تلقی می‌شوند، با موفقیت استفاده شده است.
سادگی بسیار و هزینهٔ پایین روش، همراه با تقویت چشمگیر انتقال ژن با واسطهٔ Agrobacterium، از مزایای اصلی SAAT هستند. افزون بر کاربرد موفق SAAT در تراریختی Chenopodium rubrum L. و Beta vulgaris L.، این رویکرد برای تولید هولوتوکسین نوترکیب حساس به حرارتِ تیپ وحشی Escherichia coli و ادجوانت‌های واکسن LT جهش‌یافتهٔ Escherichia coli در Nicotiana tabacum نیز به کار رفته است؛ در این کاربرد، بالاترین تیترهای سیستمیک IgG اختصاصی LT-B در پرندگان شناسایی شدند.
(رجوع کنید به Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)
VialTweeter برای فراصوت‌دهی هم‌زمان چندین لولهٔ نمونه، برای مثال برای تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT)
روش عمومی انتقال ژن از طریق سونوپوریشن در سلول‌های گیاهی
- آماده‌سازی مادهٔ ژنتیکی: ابتدا مادهٔ ژنتیکی موردنظر برای ورود به سلول‌های گیاهی را آماده کنید. این ماده می‌تواند DNA پلاسمیدی، RNA یا سایر اسیدهای نوکلئیک باشد.
- جداسازی سلول‌های گیاهی: سلول‌های گیاهی موردنظر را جدا کنید. بسته به آزمایش شما، این سلول‌ها ممکن است از بافت‌ها یا کشت‌های گیاهی جدا شوند.
- سوسپانسیون سلولی: سلول‌های گیاهی را در یک محیط یا بافر مناسب معلق کنید. این کار برای اطمینان از سلامت سلول‌ها و قرارداشتن آن‌ها در شرایط مساعد برای جذب ژن ضروری است.
- راه‌اندازی سونیکاتور: سونیکاتور پروبی خود را با تنظیم اولیهٔ پارامترهای فراصوت‌دهی مانند دامنه، زمان، انرژی و دما آماده کنید. پروب فراصوتی را در سوسپانسیون سلولی فرو ببرید.
- فراصوت‌دهی: فرایند فراصوت‌دهی را آغاز کنید. نوسان سریع نوک پروب حباب‌های کاویتاسیون را در مایع ایجاد می‌کند. این حباب‌ها بر اثر امواج فراصوت منبسط و فروپاشیده می‌شوند و نیروهای مکانیکی و ریزجریان‌هایی در سوسپانسیون ایجاد می‌کنند.
- سونوپوریشن: نیروهای مکانیکی و ریزجریان‌های ایجادشده بر اثر کاویتاسیون، منافذ و سوراخ‌هایی موقتی در غشای سلول‌های گیاهی ایجاد می‌کنند. مادهٔ ژنتیکی موجود در سوسپانسیون می‌تواند از طریق این منافذ وارد سلول‌های گیاهی شود.
- انکوباسیون: پس از تیمار سونوپوریشن، سلول‌های گیاهی را انکوبه کنید تا فرصت بازیابی و پایدارسازی غشاهای خود را داشته باشند. این مرحله برای اطمینان از بقای سلول‌ها و انتقال موفق ژن حیاتی است.
انتقال ژن از طریق Agrobacterium یا لیپوزوم‌ها
برای ترانسفکشن سلول گیاهی دو روش رایج وجود دارد. در این روش‌ها از agrobacterium، سرده‌ای از باکتری‌های گرم‌منفی، یا از لیپوزوم‌ها به‌عنوان حامل مادهٔ ژنتیکی استفاده می‌شود.
- سونوپوریشن با واسطهٔ Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens باکتری‌ای است که معمولاً در مهندسی ژنتیک گیاهی استفاده می‌شود. در این روش، DNA پلاسمیدی حاوی ژن موردنظر وارد Agrobacterium می‌شود و سپس این باکتری با سلول‌های گیاهی مخلوط می‌شود. سوسپانسیون سلولی با استفاده از یک سونیکاتور پروبی تحت سونوپوریشن قرار می‌گیرد. انرژی فراصوتی انتقال مادهٔ ژنتیکی از Agrobacterium به سلول‌های گیاهی را تقویت می‌کند. این روش به‌طور گسترده برای اصلاح ژنتیکی گیاهان استفاده می‌شود.
- سونوپوریشن با واسطهٔ لیپوزوم: لیپوزوم‌ها وزیکول‌هایی با پایهٔ لیپیدی هستند که می‌توانند مادهٔ ژنتیکی را حمل کنند. در این روش، لیپوزوم‌های بارگذاری‌شده با DNA پلاسمیدی یا سایر اسیدهای نوکلئیک با سلول‌های گیاهی مخلوط می‌شوند. برای تسهیل جذب لیپوزوم‌ها توسط سلول‌های گیاهی، از سونوپوریشن با استفاده از یک سونیکاتور پروبی بهره گرفته می‌شود. فراصوت دولایه‌های لیپیدی لیپوزوم‌ها را تخریب می‌کند و مادهٔ ژنتیکی را درون سلول‌های گیاهی آزاد می‌سازد. این رویکرد برای مطالعات بیان گذرای ژن در سلول‌های گیاهی مفید است.
مزایای اثبات‌شدهٔ علمیِ تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT)
تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT) در گونه‌های گیاهی متعددی به کار رفته است. تیمار فراصوتی کوتاه و نسبتاً ملایم کشت‌های سلولی گیاهی موجب سونوپوریشن می‌شود که در پی آن، نفوذ عمیق Agrobacterium به‌عنوان ناقل ژن امکان‌پذیر می‌شود. در ادامه می‌توانید نمونه‌هایی از مطالعات نشان‌دهندهٔ اثرات سودمند SAAT را مطالعه کنید.
سونیکاتور UP200Ht برای ترانسفکشن ژن از طریق سونوپوریشن
تراریختی آشواگاندا به کمک فراصوت
برای بهبود کارایی تراریختی در W. somnifera (معروف به آشواگاندا یا گیلاس زمستانی)، Dehdashti و همکاران (2016) استفاده از استوسیرینگون (AS) و فراصوت‌دهی را بررسی کردند.
استوسیرینگون (AS) در سه مرحله افزوده شد: کشت مایع Agrobacterium، آلوده‌سازی با Agrobacterium و هم‌کشتی ریزنمونه‌ها با Agrobacterium. مشخص شد که افزودن 75 μM AS به کشت مایع Agrobacterium برای القای ژن‌های vir بهینه است.
به‌کارگیری تکمیلی فراصوت‌دهی (SAAT) به بالاترین میزان بیان ژن منجر شد. مشخص شد که بیان ژن gusA در ریشه‌های مویین زمانی بهترین وضعیت را دارد که برگ‌ها و نوک شاخساره‌ها به‌ترتیب به‌مدت 10 و 20s فراصوت‌دهی شوند. کارایی تراریختی پروتکل بهبودیافته برای ریزنمونه‌های برگ و نوک شاخساره به‌ترتیب 66٫5 و 59٫5% ثبت شد. در مقایسه با سایر پروتکل‌ها، کارایی تراریختی این پروتکل بهبودیافته برای برگ‌ها 2٫5 برابر و برای نوک شاخساره‌ها 3٫7 برابر بیشتر بود. تحلیل‌های ساترن بلات وجود 1–2 نسخه از ترانس‌ژن gusA را در لاین‌های W1-W4 تأیید کردند، در حالی که در لاین W5 حاصل از پروتکل بهبودیافته، 1–4 نسخه از ترانس‌ژن شناسایی شد.
اثر مدت تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT) بر فراوانی تراریختی ریزنمونه‌های برگ (a) و نوک شاخسارهٔ (b) W. somnifera
(مطالعه و نمودار: © Dehdashti et al., 2016)
هموژنایزر پروبی UP200St برای سونوپوریشن و ترانسفکشن ژن
تراریختی پنبه به کمک فراصوت
Hussain et al. (2007) اثرات سودمند تراریختی پنبه به کمک فراصوت‌دهی را نشان می‌دهند. کاویتاسیون آکوستیکی ناشی از فراصوت با فرکانس پایین، ریززخم‌هایی روی سطح و زیر سطح بافت گیاهی ایجاد می‌کند (سونوپوریشن) و به Agrobacterium امکان می‌دهد به عمق بیشتری نفوذ کند و در سراسر بافت گیاهی حرکت کند. این شیوهٔ زخم‌زنی احتمال آلوده‌شدن سلول‌های گیاهی واقع در بخش‌های عمیق‌تر بافت را افزایش می‌دهد. برای ارزیابی کارایی تراریختی SAAT، بیان ژن GUS اندازه‌گیری شد. سامانهٔ گزارشگر GUS یک سامانهٔ ژن گزارشگر است که به‌ویژه در زیست‌شناسی مولکولی گیاهی و میکروبیولوژی کاربرد دارد. با تنظیم پارامترهای مختلف SAAT و استفاده از جنین‌های بالغ به‌عنوان ریزنمونه، بیان گذرای GUS در پنبه به‌طور چشمگیری افزایش یافت. GUS نخستین بار 24h پس از انکوباسیون ریزنمونه‌ها شناسایی شد و تا 48h، بیان GUS بسیار شدید بود؛ این وضعیت شاخص مفیدی از تراریختی موفق ریزنمونهٔ پنبه پس از تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT) بود. در مقایسهٔ روش‌های مختلف تراریختی (یعنی بیولیستیک، Agro، BAAT، SAAT)، تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT) با اختلاف زیاد بهترین نتایج تراریختی را نشان داد.
انتخاب روش تراریختی بر اساس بیان گذرای GUS. تراریختی با واسطهٔ Agrobacterium به کمک فراصوت‌دهی (SAAT) بیان گذرای به‌مراتب بالاتری نشان می‌دهد.
(مطالعه و نمودار: © Hussain et al., 2007)
راهکارهای فراصوتی با عملکرد بالا برای سونوپوریشن و SAAT
Hielscher Ultrasonics سابقه‌ای طولانی در توسعه و ساخت سونیکاتورهای با عملکرد بالا برای آزمایشگاه‌ها، مراکز پژوهشی و همچنین تولید صنعتی با ظرفیت پردازش بسیار بالا دارد. Hielscher برای میکروبیولوژی و علوم زیستی راهکارهای متنوعی ارائه می‌کند تا نیازهای متفاوت بافت‌های خاص و تیمارهای آن‌ها را برآورده سازد. برای فراصوت‌دهی هم‌زمان تعداد زیادی نمونه، Hielscher دستگاه UIP400MTP را برای پلیت‌های چندچاهکی، VialTweeter را برای فراصوت‌دهی حداکثر 10 ویال (مانند لوله‌های Eppendorf) یا CupHorn فراصوتی را ارائه می‌کند. سونیکاتورهای پروبی با توان 50 تا 400 وات به‌عنوان هموژنایزرهای آزمایشگاهی عرضه می‌شوند، در حالی که سامانه‌های صنعتی محدودهٔ توان 500 وات تا 16kW را پوشش می‌دهند.
لطفاً با ما تماس بگیرید و کاربرد و نیازهای فرایندی خود را با ما در میان بگذارید. کارکنان باتجربهٔ ما با کمال میل مناسب‌ترین سونیکاتور را برای فرایند زیستی شما پیشنهاد می‌کنند.
جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش سونیکاتورهای ما ارائه می‌کند:
| حجم هر بچ | دبی | دستگاه‌های پیشنهادی |
|---|---|---|
| پلیت‌های چندچاهکی / میکروتیتر | قابل اعمال نیست | UIP400MTP |
| حداکثر 10 ویال | قابل اعمال نیست | VialTweeter |
| حداکثر 5 ویال/لوله یا 1 ظرف بزرگ‌تر | قابل اعمال نیست | CupHorn |
| 1 تا 500mL | 10 تا 200mL/min | UP100H |
| 10 تا 2000mL | 20 تا 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0٫1 تا 20L | 0٫2 تا 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 تا 100L | 2 تا 10L/min | UIP4000hdT |
| قابل اعمال نیست | 10 تا 100L/min | UIP16000 |
| قابل اعمال نیست | بیشتر | مجموعه‌ای از UIP16000 |
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را برای کاربردهای اختلاط، پراکنده‌سازی، امولسیون‌سازی و استخراج در مقیاس‌های آزمایشگاهی، پایلوت و صنعتی تولید می‌کند.
منابع علمی / مراجع
- Klimek-Chodacka, Magdalena & Baranski, Rafal (2014): A protocol for sonication-assisted Agrobacterium rhizogenesmediated transformation of haploid and diploid sugar beet (Beta vulgaris L.) explants. Acta biochimica Polonica 2014. 13-17.
- Bing-fu GUO, Yong GUO, Jun WANG, Li-juan ZHANG, Long-guo JIN, Hui-long HONG, Ru-zheng CHANG, Li-juan QIU (2015): Co-treatment with surfactant and sonication significantly improves Agrobacterium-mediated resistant bud formation and transient expression efficiency in soybean. Journal of Integrative Agriculture, Volume 14, Issue 7, 2015. 1242-1250.
- Dehdashti, Sayed Mehdi; Acharjee, Sumita; Kianamiri, Shahla; Deka, Manab (2016): An efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation protocol of Withania somnifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 128(1), 2016. 55–65.
- Syed Sarfraz Hussain; Tayyab Husnain; S. Riazuddin (2007): Sonication Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (Saat): An Alternative Method For Cotton Transformation. Pak. J. Bot., 39(1), 2007. 223-230.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را از مقیاس آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.