تحول ژنتیکی در سلول های گیاهی با استفاده از اولتراسونیک
انتقال به واسطه آگروباکتریوم به کمک فراصوت (SAAT) یک روش کارآمد برای آلوده کردن سلول های گیاهی به ژن های خارجی با استفاده از آگروباکتریوم به عنوان ناقل است. حفره اولتراسونیک باعث sonoporation، که می تواند به عنوان میکرو زخم هدف از بافت گیاهی توصیف. از طریق این اولتراسونیک ایجاد میکرو زخم ها، بردارهای DNA و DNA را می توان به طور موثر به ماتریکس سلولی منتقل کرد.
sonoporation – التراسونیک افزایش تبدیل سلولی
هنگامی که سونوگرافی با فرکانس پایین (تقریبا 20 کیلوهرتز) روی سوسپانسیون سلولی اعمال می شود، اثرات حفره صوتی باعث نفوذپذیری گذرا غشای روی بافت های سلولی می شود. این اثر اولتراسونیک به عنوان sonoporation شناخته شده است و برای انتقال ژن به سلول ها یا بافت ها استفاده می شود.
مزایای استفاده از فراصوت بر اساس اصل کار مکانیکی غیر حرارتی آن است که باعث می شود فراصوت اغلب همه کاره تر و کمتر وابسته به انواع سلول. کاربرد همه کاره از sonoporation باز می کند امکان استفاده از گیاهان تراریخته, که پتانسیل قابل توجهی در تولید زیستی پروتئین های درمانی پیچیده انسانی دارند. چنین بیوراکتورهای گیاهی می توانند به راحتی از نظر ژنتیکی دستکاری شوند، از آلودگی احتمالی با پاتوژن های انسانی جلوگیری کنند، به باکتری های واسطه تبدیل (به عنوان مثال آگروباکتریوم) آسیب نرسانند و یک روش ارزان و کارآمد برای سنتز زیستی هستند.
Ultrasonicator UP200St (200W، 26kHz) با محفظه صدا
تبدیل سلول به کمک اولتراسونیک
فراصوت تکنیکی است که از امواج اولتراسوند با فرکانس پایین برای هم زدن ذرات در محلول، مخلوط کردن محلول ها استفاده می کند و در نتیجه سرعت انتقال جرم و انحلال را افزایش می دهد. به طور همزمان، فراصوت می تواند گازهای محلول از مایعات حذف. در تبدیل گیاه، فراصوت باعث تشکیل microwounds بر روی بافت گیاه و افزایش تحویل DNA برهنه به پروتوپلاست گیاه.
برای تبدیل ژنتیکی، فراصوت به کمک آگروباکتریوم واسطه تبدیل (SAAT) روش ارجح است و دارای کارایی قابل توجهی بالاتر از فراصوت مورد استفاده برای انتقال DNA برهنه و بردارهای DNA به طور مستقیم به پروتوپلاست است. مطالعات متعدد نشان داده اند که فراصوت به کمک Agrobacterium به واسطه تحول (SAAT) می تواند مورد استفاده قرار گیرد برای القای اختلال مکانیکی و تشکیل زخم بر روی سلول های گیاهی توسط امواج فوق العاده و حفره صوتی در نتیجه. یک درمان اولتراسونیک کوتاه باعث ایجاد زخم های میکرو در سطح ریزنمونه ها می شود. از آنجا که سلولهای زخمی اجازه نفوذ آگروباکتریوم به قسمت عمیق تر بافت های گیاهی را می دهند ، بنابراین احتمال آلوده شدن سلول های گیاهی را افزایش می دهد. علاوه بر این، ترکیبات فنلی ترشح شده باعث تحول می شوند. میکرو زخم های تولید شده توسط التراسونیک باعث نفوذ ریزنمونه توسط باکتری ها نیز امکان پذیر تر می شود. SAAT با موفقیت برای انتقال ژنتیکی در گونه های گیاهی به ویژه مقاوم به آگروباکتریوم مورد استفاده قرار گرفت.
روشی بسیار ساده و ارزان بودن و همچنین افزایش قابل توجه انتقال ژن با واسطه آگروباکتریوم از مزایای اصلی SAAT است. جدا از کاربرد موفقیت آمیز SAAT در تبدیل Chenopodium rubrum L. و Beta vulgaris L.، این رویکرد در تولید ادجوانت های نوترکیب هولوتوکسین مقاوم گرما از نوع وحشی اشریشیا کلی و ادجوانت واکسن LT جهش یافته اشریشیا کلی در Nicotiana tabacum نیز به کار گرفته شده است که در آن بالاترین تیترهای IgG سیستمیک اختصاصی LT-B در پرندگان شناسایی شد.
(رجوع کنید به Laere و همکاران، 2016؛ M. Klimek-Chodacka و R. Baranski، 2014)
VialTweeter(ویال گروهی) برای فراصوت همزمان از لوله های نمونه چندگانه، به عنوان مثال برای فراصوت به کمک Agrobacterium- تبدیل واسطه (SAAT)
روش عمومی انتقال ژن از طریق Sonoporation در سلول های گیاهی
- تهیه مواد ژنتیکی: با آماده سازی مواد ژنتیکی که می خواهید به سلول های گیاهی وارد کنید شروع کنید. این می تواند DNA پلاسمیدی، RNA یا سایر اسیدهای نوکلئیک باشد.
- جداسازی سلول های گیاهی: سلول های گیاهی را که می خواهید هدف قرار دهید جدا کنید. بسته به آزمایش شما، این سلول ها ممکن است از بافت ها یا کشت های گیاهی جدا شوند.
- تعلیق سلولی: سلول های گیاهی را در یک محیط یا بافر مناسب معلق کنید. این امر برای اطمینان از سالم بودن سلول ها و در حالتی که منجر به جذب ژن می شود، ضروری است.
- Sonicator خود را راه اندازی کنید: آماده سازی پروب نوع فراصوت خود را با فراصوت پارامترهای از پیش تنظیم مانند دامنه، زمان، انرژی و دما. پروب اولتراسونیک را در سیستم تعلیق سلول غوطه ور کنید.
- فراصوتی: روش فراصوت را شروع کنید. نوسان سریع نوک پروب باعث ایجاد حباب های کاویتاسیون در مایع می شود. این حباب ها به دلیل امواج اولتراسونیک منبسط و فرو می ریزند و نیروهای مکانیکی و میکرو استریم را در سیستم تعلیق ایجاد می کنند.
- Sonoporation: نیروهای مکانیکی و میکرواستریم تولید شده توسط کاویتاسیون به طور موقت منافذ و سوراخ هایی را در غشای سلول های گیاهی ایجاد می کند. مواد ژنتیکی موجود در سوسپانسیون می تواند از طریق این منافذ وارد سلول های گیاهی شود.
- اَنکوباسیون: پس از درمان sonoporation، سلول های گیاهی را جوجه کشی کنید تا به آنها اجازه دهد تا غشای خود را بهبود بخشند و تثبیت کنند. این یک گام مهم برای اطمینان از بقای سلول و انتقال موفقیت آمیز ژن است.
انتقال ژن از طریق آگروباکتریوم یا لیپوزوم
دو شکل رایج برای ترانسفکت سلول گیاهی وجود دارد. آنها از آگروباکتریوم، سرده ای از باکتری های گرم منفی یا لیپوزوم ها به عنوان حامل مواد ژنتیکی استفاده می کنند.
- آگروباکتریوم واسطه Sonoporation: Agrobacterium tumefaciens یک باکتری است که معمولا در مهندسی ژنتیک گیاهی مورد استفاده قرار می گیرد. در این روش DNA پلاسمیدی حاوی ژن مورد نظر وارد آگروباکتریوم می شود و سپس با سلول های گیاهی مخلوط می شود. سوسپانسیون سلولی با استفاده از یک فراصوت نوع پروب در معرض sonoporation قرار می گیرد. انرژی مافوق صوت افزایش انتقال مواد ژنتیکی از Agrobacterium به سلول های گیاهی. این روش به طور گسترده ای برای اصلاح ژنتیکی گیاهان استفاده می شود.
- لیپوزوم واسطه Sonoporation: لیپوزوم ها وزیکول های مبتنی بر چربی هستند که می توانند مواد ژنتیکی را حمل کنند. در این روش لیپوزوم های بارگذاری شده با DNA پلاسمید یا سایر اسیدهای نوکلئیک با سلول های گیاهی مخلوط می شوند. Sonoporation با استفاده از یک فراصوت پروب نوع استفاده می شود برای تسهیل جذب لیپوزوم توسط سلول های گیاهی. سونوگرافی دو لایه لیپیدی لیپوزوم ها را مختل می کند و مواد ژنتیکی را در سلول های گیاهی آزاد می کند. این روش برای مطالعات گذرا بیان ژن در سلول های گیاهی مفید است.
مزایای علمی اثبات شده از فراصوت به کمک آگروباکتریوم به واسطه تحول (SAAT)
فراصوت به کمک آگروباکتریوم به واسطه تبدیل (SAAT) به گونه های گیاهی متعددی اعمال شده است. درمان اولتراسونیک کوتاه و نسبتا خفیف از کشت سلول های گیاهی باعث sonoporation, که پس از آن اجازه می دهد تا نفوذ عمیق Agrobacterium به عنوان حمل و نقل ژن. در زیر می توانید مطالعات نمونه ای را بخوانید که اثرات مفید SAAT را نشان می دهد.
سونیکاتور UP200Ht برای انتقال ژن از طریق sonoporation
فراصوت کمک تحول Ashwagandha
به منظور بهبود راندمان تبدیل در W. somnifera (معروف به آشواگاندا یا گیلاس زمستانی)، دهدشتی و همکارانش (2016) استفاده از استوسیرینگون (AS) و فراصوت را بررسی کردند.
استوسیرینگون (AS) در سه مرحله کشت مایع آگروباکتریوم، آلودگی آگروباکتریوم و هم کشتی ریزنمونه با آگروباکتریوم اضافه شد. افزودن 75 میکرومولار آرسنیک به کشت مایع آگروباکتریوم برای القای ژن های بکر بهینه بود.
کاربرد اضافی فراصوت (SAAT) منجر به بالاترین بیان ژن شد. بیان ژن gusA در ریشه های مودار بهترین زمانی بود که برگ ها و نوک ساقه به ترتیب برای 10 و 20 ثانیه فراصوت شدند. راندمان تبدیل پروتکل بهبود یافته به ترتیب در ریزنمونه های نوک برگ و نوک اندام هوایی 5/66 و 5/59 درصد ثبت شد. در مقایسه با سایر پروتکل ها، راندمان تبدیل این پروتکل بهبود یافته برای برگ ها 5/2 برابر و برای نوک ساقه 7/3 برابر بیشتر بود. تجزیه و تحلیل لطمان جنوبی 1-2 نسخه از تراریخته gusA را در لاین های W1-W4 تأیید کرد، در حالی که 1-4 نسخه تراریخته در خط W5 تولید شده توسط پروتکل بهبود یافته شناسایی شد.
اثر مدت زمان ترانسفورمیت به واسطه آگروباکتریوم به کمک فراصوت بر فراوانی تبدیل ریزنمونه های برگ (a) و نوک ساقه (b) W. somnifera
(مطالعه و گرافیک: © دهدشتی و همکاران، 1395)
هموژنایزر نوع پروب UP200St برای sonoporation و ترانسفکشن ژن
تحول التراسونیک به کمک پنبه
حسین و همکاران (2007) نشان می دهد اثرات مفید فراصوت تبدیل پنبه. حفره صوتی ناشی از سونوگرافی فرکانس پایین ایجاد میکرو زخم ها بر روی و زیر سطح بافت گیاه (sonoporation) و اجازه می دهد تا آگروباکتریوم به سفر عمیق تر و کامل در سراسر بافت گیاهی. این روش زخم احتمال آلوده شدن سلول های گیاهی را که در عمق بافت قرار دارند افزایش می دهد. به منظور ارزیابی کارایی انتقال SAAT، بیان ژن GUS اندازه گیری شد. سیستم گزارشگر GUS یک سیستم ژنی گزارشگر است که به ویژه در زیست شناسی مولکولی گیاهی و میکروبیولوژی مفید است. با تنظیم پارامترهای مختلف SAAT، بیان گذرای GUS در پنبه با استفاده از جنین های بالغ به عنوان ریزنمونه به طور معنی داری افزایش یافت. GUS برای اولین بار 24 ساعت پس از انکوباسیون ریزنمونه ها شناسایی شد و تا 48 ساعت، بیان GUS بسیار شدید بود که به عنوان شاخص مفیدی برای تبدیل موفقیت آمیز ریزنمونه پنبه به دنبال فراصوت به کمک گرگونی Agrobacterium (SAAT) عمل کرد. مقایسه تکنیک های مختلف تبدیل (یعنی بیولیتیک، آگرو، BAAT، SAAT)، فراصوت به کمک آگروباکتریوم واسطه تبدیل (SAAT) تا کنون بهترین نتایج تبدیل را نشان داد.
انتخاب روش تبدیل بر اساس بیان گذرا GUS. فراصوت به کمک آگروباکتریوم تبدیل واسطه (SAAT) بیان گذرا به طور قابل توجهی بالاتر را نشان می دهد.
(مطالعه و گرافیک: © حسین و همکاران، 2007)
راه حل های اولتراسونیک با کارایی بالا برای Sonoporation و SAAT
Hielscher مافوق صوت طولانی مدت در توسعه و ساخت مافوق صوت با کارایی بالا برای آزمایشگاه ها، امکانات تحقیقاتی و همچنین تولید صنعتی با توان عملیاتی بسیار بالا تجربه است. برای میکروبیولوژی و علوم زیستی, Hielscher ارائه می دهد راه حل های مختلف به جای نیازهای مختلف لازم برای بافت های خاص و درمان های آنها. برای سونوگرافی همزمان از نمونه های متعدد Hielscher ارائه می دهد UIP400MTP برای صفحات چند چاه، VialTweeter برای فراصوت تا 10 ویال (به عنوان مثال، لوله های Eppendorf) و یا اولتراسونیک CupHorn. مافوق صوت نوع پروب از 50 تا 400 وات به عنوان هموژنایزر آزمایشگاهی در دسترس هستند، در حالی که سیستم های صنعتی محدوده قدرت از 500 وات تا 16 کیلو وات را پوشش می دهند.
لطفا با ما تماس بگیرید و در مورد درخواست و الزامات فرآیند خود به ما اطلاع دهید. کارکنان با تجربه ما خوشحال خواهند شد که مناسب ترین سونوگرافی را برای فرآیند بیولوژیکی شما توصیه کنند.
جدول زیر به شما نشانه ای از ظرفیت پردازش تقریبی مافوق صوت ما می دهد:
| حجم دسته ای | نرخ جریان | دستگاه های توصیه شده |
|---|---|---|
| صفحات مولتی ول / میکروتیتر | ن.ا. | UIP400MTP |
| تا 10 ویال | ن.ا. | VialTweeter(ویال گروهی) |
| حداکثر 5 ویال / لوله یا 1 ظرف بزرگتر | ن.ا. | کاپ هورن |
| 1 تا 500 میلی لیتر | 10 تا 200 میلی لیتر در دقیقه | UP100H |
| 10 تا 2000 میلی لیتر | 20 تا 400 میلی لیتر در دقیقه | تا 200 هرتز، UP400St |
| 0.1 تا 20 لیتر | 0.2 تا 4 لیتر در دقیقه | UIP2000hdT |
| 10 تا 100 لیتر | 2 تا 10 لیتر در دقیقه | UIP4000hdT |
| ن.ا. | 10 تا 100 لیتر در دقیقه | UIP16000 |
| ن.ا. | بزرگتر | خوشه ای از UIP16000 |
تماس با ما! / از ما بپرسید!
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا برای مخلوط کردن برنامه های کاربردی، پراکندگی، امولسیون و استخراج در آزمایشگاه، خلبان و مقیاس صنعتی.
ادبیات / منابع
- Klimek-Chodacka, Magdalena & Baranski, Rafal (2014): A protocol for sonication-assisted Agrobacterium rhizogenesmediated transformation of haploid and diploid sugar beet (Beta vulgaris L.) explants. Acta biochimica Polonica 2014. 13-17.
- Bing-fu GUO, Yong GUO, Jun WANG, Li-juan ZHANG, Long-guo JIN, Hui-long HONG, Ru-zheng CHANG, Li-juan QIU (2015): Co-treatment with surfactant and sonication significantly improves Agrobacterium-mediated resistant bud formation and transient expression efficiency in soybean. Journal of Integrative Agriculture, Volume 14, Issue 7, 2015. 1242-1250.
- Dehdashti, Sayed Mehdi; Acharjee, Sumita; Kianamiri, Shahla; Deka, Manab (2016): An efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation protocol of Withania somnifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 128(1), 2016. 55–65.
- Syed Sarfraz Hussain; Tayyab Husnain; S. Riazuddin (2007): Sonication Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (Saat): An Alternative Method For Cotton Transformation. Pak. J. Bot., 39(1), 2007. 223-230.
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.