قطعه‌قطعه‌سازی آلفا-سینوکلئین با سونیکاتور VialTweeter
در پژوهش‌های علمی، فیبریل‌ها و نوارهای α-سینوکلئین قطعه‌قطعه می‌شوند تا قطعات فیبریلی کوچک‌تر یا حتی مولکول‌های منفرد پروتئین تولید شوند؛ این محصولات را می‌توان با روش‌های آزمایشی مختلف آسان‌تر بررسی کرد. سونیکاتور VialTweeter یکی از پرکاربردترین دستگاه‌های فراصوت برای قطعه‌قطعه‌سازی کارآمد و قابل‌اعتماد آلفا-سینوکلئین است.
α-سینوکلئین در پژوهش
فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین تجمعات پروتئینی هستند که ارتباط تنگاتنگی با اختلالات تحلیل‌برندهٔ عصبی مانند بیماری پارکینسون و برخی انواع زوال عقل، از جمله زوال عقل با اجسام لویی، دارند. پژوهش‌های متمرکز بر فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین با هدف درک نقش آن‌ها در پیشرفت بیماری و توسعهٔ مداخلات درمانی بالقوه انجام می‌شوند. پژوهشگران با شکستن فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین به قطعات کوچک‌تر می‌توانند ویژگی‌های ساختاری اختصاصی آن‌ها را بررسی کنند. برای مثال، قطعه‌قطعه‌سازی فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین به پژوهشگران امکان می‌دهد برهم‌کنش‌های آن‌ها را با مولکول‌های دیگر، مانند پروتئین‌ها، لیپیدها یا مولکول‌های کوچک، بررسی کنند. با تولید قطعات کوچک‌تر، جایگاه‌های اتصال و میل اتصال به این شرکای برهم‌کنش را می‌توان مؤثرتر بررسی کرد. فیبریل‌ها و نوارهای کوچک‌تر α-Syn همچنین ممکن است سمیت و اثرات بیوشیمیایی متفاوتی نشان دهند. بنابراین، استفاده از روشی قابل‌اعتماد و کارآمد برای قطعه‌قطعه‌سازی که با تیمار سریع و سادهٔ نمونه نتایج تکرارپذیر تولید کند، ضروری است.
قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی Alpha-Syn: سونیکاتور VialTweeter یک سامانهٔ تثبیت‌شده برای آماده‌سازی فراصوتی نمونه است که تا 10 ویال را به‌طور هم‌زمان در شرایط کاملاً یکسان فراصوت‌دهی می‌کند. تنظیمات قابل‌برنامه‌ریزی، اجرای مجدد همان آزمایش‌ها را به‌سادگی و با سرعت امکان‌پذیر می‌کنند و در قطعه‌قطعه‌سازی فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین نتایجی بسیار قابل‌اعتماد و تکرارپذیر به دست می‌دهند.
سونیکاتور VialTweeter برای قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی هم‌زمان چندین نمونهٔ آلفا-سینوکلئین.
آماده‌سازی نمونهٔ α-سینوکلئین با سونیکاتور
یکی از رویکردهای مطالعهٔ فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین، استخراج و قطعه‌قطعه‌سازی آن‌ها با روش‌هایی مانند فراصوت‌دهی است. فراصوت‌دهی فرایندی است که در آن از امواج فراصوت با شدت بالا و فرکانس پایین برای گسستن و شکستن تجمعات پروتئینی استفاده می‌شود و در نتیجه فیبریل‌های کوچک‌تر یا مولکول‌های منفرد پروتئین آزاد می‌شوند. سونیکاتور VialTweeter دستگاهی پرکاربرد برای این منظور در مطالعات پژوهشی مرتبط با α-سینوکلئین است.
مطالعات پژوهشی متعددی پروتکل‌های دقیق آماده‌سازی نمونه برای فراصوت‌دهی فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین را شرح می‌دهند که در آن‌ها از Hielscher VialTweeter برای قطعه‌قطعه‌سازی کارآمد و قابل‌اعتماد فیبریل‌های α-سینوکلئین استفاده می‌شود. پژوهشگران با قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی فیبریل‌ها می‌توانند محصولات حاصل را تحلیل کرده و ساختار، سمیت و برهم‌کنش‌های آن‌ها را با مولکول‌های دیگر بررسی کنند. این پژوهش‌ها بینش‌های مهمی دربارهٔ سازوکارهای زمینه‌ساز تحلیل عصبی فراهم می‌کنند و می‌توانند به شناسایی اهداف درمانی جدید منجر شوند. پروتکل‌های کاملاً تثبیت‌شدهٔ فراصوت‌دهی α-سینوکلئین با سونیکاتور VialTweeter دستیابی به نتایج قابل‌اعتماد و تکرارپذیر را امکان‌پذیر می‌کنند.
تصاویر بالا: فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین قطعه‌قطعه‌نشده
تصاویر پایین: فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین قطعه‌قطعه‌شده با فراصوت توسط سونیکاتور VialTweeter
(مطالعه و تصاویر: ©Dieriks et al., 2022)
قطعه‌قطعه‌سازی فراصوتی فیبریل‌های α-سینوکلئین – پروتکل‌ها
از آنجا که پژوهشگران بسیاری سونیکاتور VialTweeter را به‌عنوان روش ترجیحی قطعه‌قطعه‌سازی برای تولید قطعات یکنواخت فیبریل‌های α-سینوکلئین به کار می‌برند، پروتکل‌های تثبیت‌شده به‌آسانی در دسترس هستند. در ادامه چند نمونه از پروتکل‌های قطعه‌قطعه‌سازی ارائه شده است.
آماده‌سازی بذرهای ClearTau: فیبریل‌های ClearTau در dH2O تا غلظت 10 μM رقیق شدند و با استفاده از سونیکاتور UP200St مجهز به VialTweeter، درون لوله با دامنهٔ 70 % به‌مدت 50 s و چرخهٔ 1 s روشن و 1 s خاموش فراصوت‌دهی شدند. بذرها با میکروسکوپی الکترونی مشخصه‌یابی شدند.
اندازه‌گیری فلورسانس ThS: فیبریل‌های ClearTau در dH2O تا غلظت 2٫5 μM رقیق شدند و با استفاده از UP200St مجهز به VialTweeter، درون لوله با دامنهٔ 70 % به‌مدت 50 s و چرخهٔ 1 s روشن و 1 s خاموش فراصوت‌دهی شدند. از مونومر تمام‌طول Tau 4R2N با غلظت 2٫5 μM به‌عنوان شاهد استفاده شد. به مخلوط واکنش 100 μl، مقدار 100 μl از ThS با غلظت (10 μM) اضافه شد که غلظت نهایی پروتئین را به 1٫25 μM رساند. فلورسانس ThS در یک نقطهٔ زمانی، با استفاده از پلیت‌های 96 خانه‌ای با کف شفاف در دستگاه خوانش میکروپلیت FLUOstar Omega اندازه‌گیری شد؛ تحریک در 445 nm انجام گرفت و نشر در 485 nm ثبت شد.
(رجوع کنید به Limorenko et al., 2023)
یکنواخت‌سازی طول α-سینوکلئین با فراصوت‌دهی: ناهمگنی طول فیبریل‌ها و نوارهای α-syn با فراصوت‌دهی به‌مدت 20 min روی یخ، در لوله‌های Eppendorf با حجم 2-ml و با استفاده از VialTweeter تنظیم‌شده بر دامنهٔ 75% و پالس‌های 0٫5 s کاهش یافت.
(رجوع کنید به Bousset et al., 2013)
کنترل کیفیت a-Syn مونومری نوترکیب انسانی از نوع WT یا S129A و پلی‌مورف‌های فیبریلی حاصل از آن‌ها، و همچنین a-Syn 1–110 انجام شد. سپس پلی‌مورف‌های فیبریلی با فراصوت‌دهی به‌مدت 20 min در لوله‌های Eppendorf با حجم 2-mL در دستگاه فراصوت VialTweeter قطعه‌قطعه شدند تا ذرات فیبریلی با اندازهٔ میانگین 42–52 nm تولید شوند که برای اندوسیتوز مناسب هستند.
(رجوع کنید به Shrivastava et al., 2020)
مشخصه‌یابی پنج پلی‌مورف فیبریلی α-Syn. (A) تصاویر میکروسکوپ الکترونی عبوری از پلی‌مورف‌های فیبریلی α-Syn شامل فیبریل‌ها، نوارها، fibrils-91، fibrils-65 و fibrils-110 با رنگ‌آمیزی منفی، پیش از قطعه‌قطعه‌سازی با VialTweeter (ردیف بالا) و پس از آن (ردیف پایین) نشان داده شده‌اند. (B) توزیع طول پلی‌مورف‌های فیبریلی قطعه‌قطعه‌شده نشان داده شده است. تعداد (n) مجموعه‌های فیبریلی که هیستوگرام‌ها از آن‌ها به دست آمده‌اند، مشخص شده است.
(مطالعه و تصاویر: Shrivastava et al., 2020)
فیبریل‌های α-Syn با فراصوت‌دهی به‌مدت 20 min در لوله‌های Eppendorf با حجم 2 ml در VialTweeter قطعه‌قطعه شدند تا ذرات فیبریلی با اندازهٔ میانگین 42–52 nm تولید شوند؛ این اندازه با تحلیل TEM ارزیابی شد.
(رجوع کنید به Negrini et al., 2022)
فیبریل‌های fibrils91 که دوباره در PBS معلق شده بودند، پیش از افزودن به کشت‌های سلولی، با فراصوت‌دهی به‌مدت 20 min در لوله‌های Eppendorf با حجم 2 mL و با استفاده از سونیکاتور Vial Tweeter قطعه‌قطعه شدند، به بخش‌های کوچک تقسیم شدند، در نیتروژن مایع به‌سرعت منجمد شدند و تا زمان استفاده در -80 ̊C نگهداری شدند.
(رجوع کنید به Vajhøj et al., 2021)
سونیکاتور UIP400MTP برای قطعه‌قطعه‌سازی فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین در پلیت‌های چندخانه‌ای.
VialTweeter و سونیکاتورهای آزمایشگاهی برای قطعه‌قطعه‌سازی α-Syn
Hielscher Ultrasonics در سراسر جهان به‌عنوان تولیدکنندهٔ پیشرو دستگاه‌های فراصوت پیشرفته شناخته می‌شود. دستگاه‌های فراصوت ما که در آزمایشگاه‌های پژوهشی بزرگ سراسر جهان جایگاهی تثبیت‌شده دارند و مورد اعتماد هستند، کیفیت و عملکردی بی‌نظیر برای آزمایش‌های حساس شما ارائه می‌دهند.
با Hielscher VialTweeter و هر سونیکاتور دیگر Hielscher، راحتی کاربری بی‌نظیری را تجربه خواهید کرد؛ زیرا این دستگاه‌ها با دقت برای دستیابی به نتایج تکرارپذیر، سهولت استفاده و عملکرد روان مهندسی شده‌اند. قابلیت‌های ثبت خودکار داده‌ها به شما امکان می‌دهند بر پژوهش خود تمرکز کنید، در حالی که دستگاه‌های فراصوت ما داده‌های حیاتی برای تکرارپذیری و دقت را با جزئیات ثبت می‌کنند.
با اطمینان به نتایج یکنواخت و تکرارپذیر دست یابید!
دستگاه‌های فراصوت ما در آلمان مهندسی و تولید می‌شوند. دقت آلمانی و بالاترین کیفیت مهندسی، آماده‌سازی قابل‌اعتماد و دقیق نمونه، مانند قطعه‌قطعه‌سازی فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین، را در هر بار استفاده تضمین می‌کنند. دیگر نگران نتایج ناهماهنگ نباشید – فناوری فراصوت ما تضمین می‌کند که پژوهش شما در خط مقدم پیشرفت علمی باقی بماند.
اما این همهٔ ماجرا نیست! تعهد ما به برتری فراتر از محصولاتمان است. ما به خدمات استثنایی خود به مشتریان افتخار می‌کنیم و برای پاسخ‌گویی به هر پرسش یا نگرانی شما، پشتیبانی تخصصی ارائه می‌دهیم. تیم متعهد ما در هر مرحله از مسیر پژوهش در کنار شماست تا اطمینان حاصل کند که بیشترین بهره را از دستگاه‌های فراصوت ما می‌برید.
نوآوری، قابلیت اعتماد و تجربهٔ کاربری استثنایی را انتخاب کنید – سونیکاتورهای آزمایشگاهی ما مانند VialTweeter را برای قطعه‌قطعه‌سازی فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین برگزینید. از پروتکل‌های ازپیش‌تثبیت‌شده بهره ببرید و به جمع پژوهشگران پیشرویی بپیوندید که برای مطالعات حساس خود به فناوری ما اعتماد دارند. با دستگاه‌های فراصوت پیشرفتهٔ ما پژوهش خود را ارتقا دهید و مرزهای تازه‌ای را در پژوهش زوال عقل و بیماری‌های تحلیل‌برندهٔ عصبی کشف کنید.
- کارایی بالا
- فناوری روز
- قابلیت اعتماد و استحکام
- تکرارپذیری
- کنترل دقیق و قابل‌تنظیم فرایند
- برای هر حجمی
- نرم‌افزار هوشمند
- قابلیت‌های هوشمند (مانند قابلیت برنامه‌ریزی، ثبت داده‌ها و کنترل از راه دور)
- کاربری آسان و ایمن
- نیاز اندک به نگهداری
- CIP (شست‌وشو در محل)
طراحی، تولید و مشاوره – کیفیت ساخت آلمان
دستگاه‌های فراصوت Hielscher به بالاترین استانداردهای کیفیت و طراحی شهرت دارند. استحکام و کاربری آسان، ادغام روان دستگاه‌های فراصوت ما در تأسیسات صنعتی را امکان‌پذیر می‌کنند. دستگاه‌های فراصوت Hielscher به‌آسانی از عهدهٔ شرایط سخت و محیط‌های پرچالش برمی‌آیند.
Hielscher Ultrasonics شرکتی دارای گواهینامهٔ ISO است و بر دستگاه‌های فراصوت با عملکرد بالا، مجهز به فناوری روز و با کاربری آسان، تأکید ویژه دارد. البته سونیکاتورهای Hielscher با CE مطابقت دارند و الزامات UL، CSA و RoHs را برآورده می‌کنند.
جدول زیر نمایی از ظرفیت تقریبی پردازش دستگاه‌های فراصوت در مقیاس آزمایشگاهی ما ارائه می‌دهد:
| دستگاه‌های پیشنهادی | حجم هر بچ | دبی |
|---|---|---|
| UIP400MTP | پلیت‌های چندخانه‌ای / میکروتیتر | قابل‌اعمال نیست |
| CupHorn فراصوتی | CupHorn برای ویال‌ها یا بشر | قابل‌اعمال نیست |
| GDmini2 | میکرورآکتور جریان فراصوتی | قابل‌اعمال نیست |
| VialTweeter | 0٫5 تا 1٫5mL | قابل‌اعمال نیست |
| UP100H | 1 تا 500mL | 10 تا 200mL/min |
| UP200Ht, UP400St | 10 تا 2000mL | 20 تا 400mL/min |
با ما تماس بگیرید! / از ما بپرسید!
VialTweeter معمولاً برای قطعه‌قطعه‌سازی فیبریل آلفا-سینوکلئین به‌عنوان مرحله‌ای از آماده‌سازی نمونه پیش از آنالیز استفاده می‌شود
منابع علمی / مراجع
- Emil Dandanell Agerschou, Marie P. Schützmann, Nikolas Reppert, Michael M. Wördehoff, Hamed Shaykhalishahi, Alexander K. Buell, Wolfgang Hoyer (2021): β-Turn exchanges in the α-synuclein segment 44-TKEG-47 reveal high sequence fidelity requirements of amyloid fibril elongation. Biophysical Chemistry, Volume 269, 2021.
- Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G. et al. (2013): Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nature Communications 4, 2575 (2013).
- Vajhøj, Charlott; Schmid, Benjamin; Alik, Ania; Melki, Ronald; Fog, Karina; Holst, Bjørn; Stummann, Tina (2021): Establishment of a human induced pluripotent stem cell neuronal model for identification of modulators of A53T α-synuclein levels and aggregation. PLOS ONE 16, 2021.
- Dieriks B.V.; Highet B.; Alik A.; Bellande T.; Stevenson T.J.; Low V.; Park T.I.; Correia J.; Schweder P.; Faull R.L.M.; Melki R.; Curtis M.A.; Dragunow M. (2022): Human pericytes degrade diverse α-synuclein aggregates. PLoS One, Nov 18;17(11), 2022.
- Amulya Nidhi Shrivastava, Luc Bousset, Marianne Renner, Virginie Redeker, Jimmy Savistchenko, Antoine Triller, Ronald Melki (2020): Differential Membrane Binding and Seeding of Distinct α-Synuclein Fibrillar Polymorphs. Biophysical Journal, Volume 118, Issue 6, 2020. 1301-1320.
- Negrini M, Tomasello G, Davidsson M, Fenyi A, Adant C, Hauser S, Espa E, Gubinelli F, Manfredsson FP, Melki R, Heuer A. (2022): Sequential or Simultaneous Injection of Preformed Fibrils and AAV Overexpression of Alpha-Synuclein Are Equipotent in Producing Relevant Pathology and Behavioral Deficits. Journal of Parkinsons Disease 12(4), 2022. 1133-1153.
- Limorenko G, Tatli M, Kolla R, Nazarov S, Weil MT, Schöndorf DC, Geist D, Reinhardt P, Ehrnhoefer DE, Stahlberg H, Gasparini L, Lashuel HA (2023): Fully co-factor-free ClearTau platform produces seeding-competent Tau fibrils for reconstructing pathological Tau aggregates. Nature Communications 4;14(1), July 2023.
پرسش‌های متداول
آیا آلفا-سینوکلئین یک آمیلوئید است؟
بله، آلفا-سینوکلئین می‌تواند فیبریل‌های شبه‌آمیلوئیدی تشکیل دهد. این پروتئین یکی از اجزای اصلی اجسام لویی است که شاخص آسیب‌شناختی بیماری پارکینسون و سایر سینوکلئینوپاتی‌ها هستند. تجمع آن از فرایند پلیمریزاسیون وابسته به هسته‌زایی، مشابه آمیلوئیدهای کلاسیک، پیروی می‌کند.
تفاوت آمیلوئید بتا و آلفا-سینوکلئین چیست؟
آمیلوئید بتا (Aβ) و آلفا-سینوکلئین (α-syn) پروتئین‌های متمایزی هستند که در بیماری‌های تحلیل‌برندهٔ عصبی تجمعات پاتولوژیک تشکیل می‌دهند. Aβ که از پروتئین پیش‌ساز آمیلوئید (APP) مشتق می‌شود، عمدتاً با بیماری آلزایمر مرتبط است و پلاک‌های خارج‌سلولی تشکیل می‌دهد. در مقابل، α-syn یک پروتئین نورونی پیش‌سیناپسی است که در بیماری پارکینسون و اختلالات مرتبط، درون سلول تجمع می‌یابد. هرچند هر دو ساختارهای آمیلوئیدی غنی از صفحات β دارند، از نظر توالی، مسیرهای تجمع و آسیب‌شناسی اختصاصی بیماری با یکدیگر تفاوت دارند.
آمیلوئید چه نوع پروتئینی است؟
آمیلوئید پروتئینی بدتاخورده و فیبریلی است که ساختار صفحات β متقاطع به خود می‌گیرد و به‌صورت فیبریل‌های نامحلول تجمع می‌یابد. این پروتئین‌ها معمولاً از پیش‌سازهایی مشتق می‌شوند که در حالت عادی محلول هستند و دچار تغییرات کنفورماسیونی می‌شوند؛ این تغییرات به خودآرایی و رسوب‌گذاری منجر می‌شوند. آمیلوئیدها با بیماری‌های گوناگون تحلیل‌برندهٔ عصبی و سیستمیک مرتبط هستند و تجمع آن‌ها در سمیت سلولی و آسیب بافتی نقش دارد. بیاموزید چگونه سونیکاتور پلیت 96 خانه‌ای UIP400MTP به تشکیل سریع فیبریل‌های آمیلوئیدی استانداردشده برای اهداف پژوهشی کمک می‌کند!
آمیلوئیدها باعث چه بیماری‌هایی می‌شوند؟
آمیلوئیدها در بیماری‌های متعددی نقش دارند که در مجموع آمیلوئیدوزها نامیده می‌شوند. این بیماری‌ها عبارت‌اند از:
- بیماری‌های تحلیل‌برندهٔ عصبی: بیماری آلزایمر (Aβ)، بیماری پارکینسون (α-syn)، بیماری هانتینگتون (هانتینگتین جهش‌یافته) و بیماری‌های پریونی (PrPSc). (دربارهٔ PMCA به‌کمک فراصوت‌دهی برای تشخیص پریون با ظرفیت پردازش بالا بیشتر بخوانید!)
- آمیلوئیدوزهای سیستمیک: آمیلوئیدوز زنجیرهٔ سبک (AL)، آمیلوئیدوز ترانس‌تیرتین (ATTR) و آمیلوئیدوز ثانویه (AA).
- آمیلوئیدوزهای موضعی: پلی‌پپتید آمیلوئیدی جزایر پانکراس (IAPP) در دیابت نوع 2.
هر بیماری مرتبط با آمیلوئید با بدتاخوردگی، تجمع و رسوب‌گذاری پروتئین مشخص می‌شود که به اختلال عملکرد سلولی و سمیت منجر می‌شوند.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در مقیاس‌های آزمایشگاهی تا صنعتی تولید می‌کند.