تشکیل فیبریل آمیلوئید با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP
فیبریل های آمیلوئید، بسیار شبیه به کریستال ها، از طریق فرآیند هسته زایی و رشد بعدی تشکیل می شوند. با این حال، به دلیل سد انرژی آزاد بالای هسته زایی، تشکیل فیبریل آمیلوئید خود به خودی تنها پس از یک مرحله تاخیر طولانی رخ می دهد. امواج فراصوت به عنوان یک ابزار قدرتمند برای القای هسته آمیلوئید ظاهر شده است، در نتیجه به طور قابل توجهی تسریع تشکیل فیبریل است. هنگامی که با یک میکروپلیت خوان با استفاده از فلورسانس تیوفلاوین T (ThT) ترکیب می شود، امواج فراصوت تشخیص با توان بالا از فیبریل های آمیلوئید در چندین نمونه به طور همزمان را امکان پذیر می کند.
تشکیل فیبریل آمیلوئید ناشی از التراسونیک با سونیکاتور Microplate UIP400MTP
با UIP400MTP چند به خوبی صفحه ماصوت، فیبریل های آمیلوئید با همان کیفیت در مقادیر زیاد را می توان به سرعت برای اهداف تحقیقاتی سنتز کرد. این رویکرد کارآمد امکان مطالعه آمیلوئیدزایی پروتئین را فراهم می کند. این روش فیبریلاسیون آمیلوئید سریع و تکرارپذیر را تسهیل می کند، همانطور که با β2-میکروگلوبولین (β2-m)، یک پروتئین آمیلوئیدوژنیک مرتبط با آمیلوئیدوز مرتبط با دیالیز نشان داده شده است.
رویکرد تجربی ساده: فیبریلاسیون آمیلوئید ناشی از التراسونیک
برای القای تشکیل فیبریل، یک میکروپلیت 96 چاه در مرکز UIP400MTP چند چاه سونیکاتور صفحه قرار داده شد، که قرار گرفتن در معرض اولتراسونیک یکنواخت را در تمام چاه ها تضمین می کند. شرایط آزمایشگاهی به شرح زیر بود:
- هر چاه حاوی 2/0 میلی لیتر محلول β2-میکروگلوبولین (3/0 میلی گرم بر میلی لیتر، pH 5/2) حاوی 5 میکرومولار ThT بود.
- صفحه تحت چرخه های سونوگرافی قرار گرفت, مانند سونوگرافی 1 دقیقه ای و به دنبال آن 9 دقیقه مکث.
- پس از فراصوت ، فلورسانس ThT با استفاده از خواننده میکروپلیت اندازه گیری شد.
(رجوع کنید به سو و همکاران، 2011)
UIP400MTP یک حمام اولتراسونیک نیست. این یک شاخ فنجان با شدت بالا برای فراصوت متمرکز است. این فراصوت قدرتمند بدون تماس ارائه فراصوت یکنواخت در سراسر تمام چاه های استاندارد خود را به خوبی بشقاب. شما کنترل دقیقی بر دامنه، توان و ضربان دارید. یک تایمر داخلی و پروب دما نتایج ثابتی را تضمین می کند. سونیکاتور صفحه UIP400MTP نمونه ها را با حمام آب خنک می کند (چیلر خارجی اختیاری).
مقایسه با تحریک معمولی
در مقایسه با روش های تحریک سنتی، امواج فراصوت به شدت فاز تاخیر تشکیل فیبریل را کاهش می دهد. در شرایط لرزش میکروپلیت معمولی، تنها 1 چاه از هر 10 چاه افزایش فلورسانس ThT پس از 20 ساعت را نشان داد. در مقابل، با استفاده از فراصوت چرخه ای (15 دقیقه فراصوت و به دنبال آن 5 دقیقه سکونس)، افزایش فلورسانس ThT قابل توجهی بلافاصله پس از اولین درمان فراصوت تشخیص داده شد.
شتاب سریع سینتیک فیبریلاسیون
نتایج به دست آمده از So و همکاران (2011) نشان داد که تشکیل فیبریل خود به خودی β2-میکروگلوبولین در pH 2.5 را می توان از چند ساعت به فقط 10-15 دقیقه با امواج فراصوت تسریع کرد.
میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) تصاویر تایید کرد که فیبریل های تولید شده از طریق سونوگرافی 10 دقیقه ای هر 15 دقیقه از نظر مورفولوژیکی از آنهایی که با استفاده از سونوگرافی 1 دقیقه ای هر 10 دقیقه تشکیل می شوند، قابل تشخیص نیستند. این برجسته تکرارپذیری و استحکام فیبریلاسیون آمیلوئید ناشی از اولتراسونیک.
تصاویر AFM از فیبریل های آمیلوئید تولید شده توسط سونوگرافی 1 دقیقه هر 10 دقیقه (من)، توسط 10 دقیقه فراصوت هر 15 دقیقه (دوم)، و توسط واکنش بذر بدون سونوگرافی (III). نوار مقیاس سفید نشان دهنده 1 میکرومتر است.
مطالعه و تصاویر: ©سو و همکاران، 2011
فیبریلاسیون در شرایط pH خنثی
حتی در شرایط pH خنثی، تشکیل فیبریل پس از یک زمان تاخیر 1.5 ساعت به دست آمد، نشان می دهد که امواج فراصوت به طور قابل توجهی سد انرژی هسته ای و رشد را کاهش می دهد. این بیشتر پشتیبانی از این فرضیه است که فیبریلاسیون آمیلوئید در درجه اول یک واکنش فیزیکی, تا حد زیادی توسط مانع انرژی هسته محدود, که سونوگرافی به طور موثر کاهش می دهد.
تاثیر بر تحقیقات بیماری های مرتبط با آمیلوئید
تشکیل آسان و قابل اعتماد فیبریل های آمیلوئید با استفاده از ماسونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP دارای پیامدهای قابل توجهی برای بیماری آلزایمر (AD) تحقیقات و سایر اختلالات مربوط به آمیلوئید, مانند بیماری پارکینسون, دیابت نوع دوم, و آمیلوئیدوزهای سیستمیک. در AD، تجمع آمیلوئید-β (Aβ) یک مشخصه کلیدی پاتولوژیک است، اما مطالعه سینتیک فیبریلاسیون آن به دلیل مراحل تاخیر طولانی و تنوع در روش های مرسوم، همچنان چالش برانگیز است. تشکیل فیبریل مبتنی بر اولتراسونیک باعث تسریع هسته ای می شود و از تکرارپذیری بالا و کاهش تنوع اطمینان حاصل می کند که برای غربالگری مهارکننده های بالقوه و درک مکانیسم های آمیلوئیدوژنیک بسیار مهم است. علاوه بر این، قابلیت توان عملیاتی بالا UIP400MTP امکان تحقیقات در مقیاس بزرگ در مورد تا شدن و تجمع نادرست پروتئین را فراهم می کند و کشف عوامل درمانی را تسهیل می کند که می توانند تشکیل فیبریل را تعدیل کنند و به طور بالقوه پیشرفت تخریب عصبی را کاهش دهند.
این UIP400MTP آماده سازی نمونه قابل اعتماد و ادغام آسان با گردش کار آزمایشگاه موجود را تضمین می کند
این مطالعه ایجاد امواج فراصوت با استفاده از UIP400MTP چند چاه صفحه ماسونیک به عنوان یک روش بسیار کارآمد برای تسریع تشکیل فیبریل آمیلوئید. مزایای کلیدی این رویکرد عبارتند از:
- کاهش چشمگیر زمان تاخیر برای فیبریلاسیون.
- قرار گرفتن در معرض سونوگرافی یکنواخت در تمام چاه ها، امکان تشکیل فیبریل قابل تکرار را فراهم می کند.
- قابلیت غربالگری با توان عملیاتی بالا، که آن را برای جستجوهای گسترده ژنوم آمیلوئیدوژنیک پروتئین مناسب می کند.
با ادغام اولتراسونیک با تشخیص فلورسانس ThT، این روش یک پلت فرم سریع، مقیاس پذیر و قابل اعتماد برای مطالعه فیبریلاسیون آمیلوئید فراهم می کند. با توجه به کارایی و پتانسیل توان عملیاتی بالا، این رویکرد ممکن است سنتز آسان فیبریل های آمیلوئید را برای تحقیقات بیوفیزیکی و دارویی تسهیل کند و ابزاری امیدوارکننده برای مطالعات مرتبط با آمیلوئید و غربالگری دارو ارائه دهد.
استخراج EM با توان بالا با سونیکاتور صفحه 96 چاه UIP400MTP
ادبیات / منابع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
پرسش و پاسخهای متداول
هسته اولیه آمیلوئید چیست؟
هسته اولیه آمیلوئید مرحله اولیه و محدود کننده سرعت در تشکیل فیبریل آمیلوئید است، جایی که پروتئین های مونومر تحت تغییرات ساختاری قرار می گیرند و خود را به یک هسته بحرانی تبدیل می کنند. این هسته به عنوان الگویی برای تجمع بیشتر عمل می کند.
فیبریل در آمیلوئیدوز چگونه تشکیل می شود؟
در آمیلوئیدوز ، پروتئین های نادرست از طریق پلیمریزاسیون وابسته به هسته جمع می شوند. هنگامی که یک هسته تشکیل می شود، مونومرها به سرعت از طریق هسته زایی ثانویه و رشد الگوبرداری شده به فیبریل های غنی از β ورق کشیده می شوند که منجر به رسوبات آمیلوئید می شود.
پلی مورفیسم فیبریل آمیلوئید چیست؟
پلی مورفیسم فیبریل آمیلوئید به تغییرات ساختاری در فیبریل های تشکیل شده توسط همان پروتئین اشاره دارد. تفاوت در مورفولوژی فیبریل، آرایش پروتوفیلامنت و بسته بندی مولکولی به دلیل شرایط محیطی، جهش ها یا مسیرهای مختلف تجمع ایجاد می شود.
تفاوت بین فیبریل های آمیلوئید و پلاک ها چیست؟
فیبریل های آمیلوئید توده های پروتئینی خطی و غنی از β ورق هستند، در حالی که پلاک های آمیلوئید رسوبات خارج سلولی فیبریل های جمع شده هستند که اغلب با لیپیدها، فلزات و بقایای سلولی مخلوط می شوند، همانطور که در بیماری های تخریب عصبی مانند آلزایمر دیده می شود.
تفاوت بین آلفا سینوکلئین و آمیلوئید چیست؟
آلفا سینوکلئین یک پروتئین عصبی است که در عملکرد سیناپسی نقش دارد، اما در شرایط پاتولوژیک، به اشتباه تا می شود و فیبریل های شبه آمیلوئید را تشکیل می دهد. “آمیلوئید” یک اصطلاح کلی برای توده های پروتئینی فیبریلار تا شده است، در حالی که فیبریل های آلفا سینوکلئین مختص بیماری هایی مانند پارکینسون هستند.
پروتئین فیبریل چیست؟
فیبریل پروتئینی یک سنگدانه رشته ای بسیار منظم ، غنی از ورق β است که توسط پروتئین های نادرست یا نیمه باز شده تشکیل می شود. این فیبریل ها معمولا نامحلول هستند و از طریق پلیمریزاسیون وابسته به هسته بوجود می آیند. آنها با شرایط پاتولوژیک مختلفی از جمله آمیلوئیدوزها و بیماری های تخریب عصبی (به عنوان مثال، آلزایمر، پارکینسون) همراه هستند. با این حال، برخی از فیبریل های پروتئینی عملکردی در سیستم های بیولوژیکی وجود دارد، مانند الیاف کرلی در باکتری ها و فیبریل های ابریشم در عنکبوت ها.
Hielscher مافوق صوت تولید کننده هموژنایزرهای مافوق صوت با کارایی بالا از ازمایشگاه ها تا اندازه صنعتی.