تشکیل فیبریل‌های آمیلوئیدی با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP
فیبریل‌های آمیلوئیدی، درست مانند بلورها، طی فرایند هسته‌زایی و رشد متعاقب آن تشکیل می‌شوند. بااین‌حال، به‌دلیل سد بالای انرژی آزاد هسته‌زایی، تشکیل خودبه‌خودی فیبریل‌های آمیلوئیدی تنها پس از یک مرحلهٔ تأخیر طولانی رخ می‌دهد. فراصوت‌دهی به‌عنوان ابزاری قدرتمند برای القای هسته‌زایی آمیلوئید مطرح شده است و از این طریق، تشکیل فیبریل‌ها را به‌طور چشمگیری تسریع می‌کند. ترکیب فراصوت‌دهی با دستگاه خوانش میکروپلیت مبتنی بر فلورسانس تیوفلاوین T (ThT)، آشکارسازی هم‌زمان فیبریل‌های آمیلوئیدی را در تعداد زیادی نمونه با ظرفیت پردازش بالا امکان‌پذیر می‌کند.
تشکیل فیبریل‌های آمیلوئیدی القاشده با فراصوت با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP
با سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP می‌توان فیبریل‌های آمیلوئیدی را با کیفیت یکسان، در مقادیر زیاد و به‌سرعت برای مقاصد پژوهشی سنتز کرد. این رویکرد کارآمد، مطالعهٔ قابلیت آمیلوئیدزایی پروتئین‌ها را امکان‌پذیر می‌کند. این روش، فیبریل‌زایی آمیلوئیدی سریع و تکرارپذیر را تسهیل می‌کند؛ همان‌گونه که برای β2-میکروگلوبولین (β2-m)، پروتئینی آمیلوئیدزا و مرتبط با آمیلوئیدوز ناشی از دیالیز، نشان داده شده است.
رویکرد آزمایشی ساده: فیبریل‌زایی آمیلوئیدی القاشده با فراصوت
برای القای تشکیل فیبریل‌ها، یک میکروپلیت 96 خانه‌ای در مرکز سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP قرار داده شد؛ این دستگاه قرارگیری یکنواخت همهٔ خانه‌ها در معرض فراصوت را تضمین می‌کند. شرایط آزمایش به شرح زیر بود:
- هر خانه حاوی 0٫2 ml محلول β2-میکروگلوبولین (0٫3 mg/ml، pH 2٫5) بود که 5 μM از ThT به آن افزوده شده بود.
- پلیت تحت چرخه‌های فراصوت‌دهی، مانند 1 دقیقه فراصوت‌دهی و سپس 9 دقیقه وقفه، قرار گرفت.
- پس از فراصوت‌دهی، فلورسانس ThT با استفاده از دستگاه خوانش میکروپلیت اندازه‌گیری شد.
(رجوع کنید به So et al., 2011)
مقایسه با روش‌های متداول تکان‌دهی
در مقایسه با روش‌های سنتی تکان‌دهی، فراصوت‌دهی مرحلهٔ تأخیر تشکیل فیبریل‌ها را به‌شدت کاهش داد. در شرایط متداول تکان‌دهی میکروپلیت، پس از 20 ساعت تنها 1 خانه از 10 خانه افزایش فلورسانس ThT را نشان داد. در مقابل، با استفاده از فراصوت‌دهی چرخه‌ای (15 دقیقه فراصوت‌دهی و سپس 5 دقیقه سکون)، افزایش قابل‌توجه فلورسانس ThT بلافاصله پس از نخستین تیمار فراصوتی آشکار شد.
تسریع چشمگیر سینتیک فیبریل‌زایی
نتایج به‌دست‌آمده از So et al. (2011) نشان داد که با فراصوت‌دهی می‌توان تشکیل خودبه‌خودی فیبریل‌های β2-میکروگلوبولین را در pH 2٫5 از چند ساعت به تنها 10–15 دقیقه تسریع کرد.
تصاویر میکروسکوپی نیروی اتمی (AFM) تأیید کردند که فیبریل‌های تولیدشده با 10 دقیقه فراصوت‌دهی در هر 15 دقیقه، از نظر ریخت‌شناسی از فیبریل‌های تشکیل‌شده با 1 دقیقه فراصوت‌دهی در هر 10 دقیقه قابل‌تمایز نبودند. این امر تکرارپذیری و استواری روش فیبریل‌زایی آمیلوئیدی القاشده با فراصوت را برجسته می‌کند.
تصاویر AFM از فیبریل‌های آمیلوئیدی تولیدشده با فراصوت‌دهی به‌مدت 1 min در هر 10 min (i)، با فراصوت‌دهی به‌مدت 10 min در هر 15 min (ii)، و با واکنش بذردهی بدون فراصوت‌دهی (iii). خط مقیاس سفید نشان‌دهندهٔ 1 μm است.
مطالعه و تصاویر: ©So et al., 2011
فیبریل‌زایی در شرایط pH خنثی
حتی در شرایط pH خنثی نیز تشکیل فیبریل‌ها پس از زمان تأخیر 1٫5 ساعت محقق شد؛ این امر نشان می‌دهد که فراصوت‌دهی سد انرژی هسته‌زایی و رشد را به‌طور چشمگیری کاهش می‌دهد. این یافته همچنین از این فرضیه پشتیبانی می‌کند که فیبریل‌زایی آمیلوئیدی عمدتاً یک واکنش فیزیکی است که تا حد زیادی با سد انرژی هسته‌زایی محدود می‌شود؛ سدی که فراصوت‌دهی به‌طور مؤثر آن را کاهش می‌دهد.
تأثیر بر پژوهش‌های بیماری‌های مرتبط با آمیلوئید
تشکیل آسان و قابل‌اعتماد فیبریل‌های آمیلوئیدی با استفاده از سونیکاتور میکروپلیت UIP400MTP پیامدهای مهمی برای پژوهش دربارهٔ بیماری آلزایمر (AD) و سایر اختلالات مرتبط با آمیلوئید، مانند بیماری پارکینسون، دیابت نوع II و آمیلوئیدوزهای سیستمیک دارد. در AD، تجمع آمیلوئید-β (Aβ) یکی از نشانه‌های اصلی آسیب‌شناختی است؛ بااین‌حال، مطالعهٔ سینتیک فیبریل‌زایی آن به‌دلیل مراحل تأخیر طولانی و تغییرپذیری روش‌های متداول همچنان چالش‌برانگیز است. تشکیل فیبریل‌ها به‌کمک فراصوت‌دهی، هسته‌زایی را تسریع می‌کند و تکرارپذیری بالا و کاهش تغییرپذیری را تضمین می‌کند؛ این ویژگی‌ها برای غربالگری مهارکننده‌های بالقوه و درک سازوکارهای آمیلوئیدزایی ضروری‌اند. افزون بر این، ظرفیت پردازش بالای UIP400MTP بررسی‌های گسترده دربارهٔ بدتاخوردگی و تجمع پروتئین‌ها را امکان‌پذیر می‌کند و کشف عوامل درمانی‌ای را تسهیل می‌کند که می‌توانند تشکیل فیبریل‌ها را تعدیل کنند و به‌طور بالقوه پیشرفت تخریب عصبی را کاهش دهند.
UIP400MTP آماده‌سازی قابل‌اعتماد نمونه‌ها و ادغام آسان با گردش‌کارهای موجود آزمایشگاه را تضمین می‌کند
این مطالعه، فراصوت‌دهی با استفاده از سونیکاتور پلیت چندخانه‌ای UIP400MTP را به‌عنوان روشی بسیار کارآمد برای تسریع تشکیل فیبریل‌های آمیلوئیدی تثبیت می‌کند. مزایای اصلی این رویکرد عبارت‌اند از:
- کاهش چشمگیر زمان تأخیر فیبریل‌زایی.
- قرارگیری یکنواخت همهٔ خانه‌ها در معرض فراصوت، که تشکیل تکرارپذیر فیبریل‌ها را امکان‌پذیر می‌کند.
- قابلیت غربالگری با ظرفیت پردازش بالا، که آن را برای جست‌وجوی قابلیت آمیلوئیدزایی پروتئین‌ها در سراسر ژنوم مناسب می‌سازد.
این روش با ادغام فراصوت‌دهی و آشکارسازی فلورسانس ThT، بستری سریع، مقیاس‌پذیر و قابل‌اعتماد برای مطالعهٔ فیبریل‌زایی آمیلوئیدی فراهم می‌کند. با توجه به کارایی و ظرفیت بالقوهٔ بالای پردازش، این رویکرد می‌تواند سنتز آسان فیبریل‌های آمیلوئیدی را برای پژوهش‌های زیست‌فیزیکی و دارویی تسهیل کند و ابزاری امیدبخش برای مطالعات مرتبط با آمیلوئید و غربالگری داروها ارائه دهد.
استخراج EM با ظرفیت پردازش بالا با سونیکاتور پلیت 96 خانه‌ای UIP400MTP
منابع علمی / مراجع
- FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
- Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
- Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
- Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
- Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.
پرسش‌های متداول
هسته‌زایی اولیهٔ آمیلوئید چیست؟
هسته‌زایی اولیهٔ آمیلوئید، نخستین مرحله و مرحلهٔ محدودکنندهٔ سرعت در تشکیل فیبریل‌های آمیلوئیدی است که طی آن پروتئین‌های مونومری دچار تغییرات کنفورماسیونی می‌شوند و با خودآرایی، هسته‌ای بحرانی تشکیل می‌دهند. این هسته به‌عنوان الگویی برای تجمع بیشتر عمل می‌کند.
فیبریل در آمیلوئیدوز چگونه تشکیل می‌شود؟
در آمیلوئیدوز، پروتئین‌های بدتاخورده از طریق پلیمریزاسیون وابسته به هسته‌زایی تجمع می‌یابند. پس از تشکیل هسته، مونومرها از طریق هسته‌زایی ثانویه و رشد الگومحور به‌سرعت طویل می‌شوند و فیبریل‌های غنی از صفحات β را تشکیل می‌دهند که به ایجاد رسوبات آمیلوئیدی منجر می‌شود.
چندریختی فیبریل‌های آمیلوئیدی چیست؟
چندریختی فیبریل‌های آمیلوئیدی به تفاوت‌های ساختاری در فیبریل‌هایی اشاره دارد که از یک پروتئین یکسان تشکیل شده‌اند. تفاوت در ریخت‌شناسی فیبریل‌ها، آرایش پروتوفیلامنت‌ها و نحوهٔ بسته‌بندی مولکولی بر اثر شرایط محیطی، جهش‌ها یا مسیرهای متفاوت تجمع پدید می‌آید.
تفاوت فیبریل‌های آمیلوئیدی و پلاک‌ها چیست؟
فیبریل‌های آمیلوئیدی تجمعات پروتئینی خطی و غنی از صفحات β هستند، درحالی‌که پلاک‌های آمیلوئیدی رسوبات خارج‌سلولی فیبریل‌های تجمع‌یافته‌اند که اغلب با لیپیدها، فلزات و بقایای سلولی آمیخته‌اند؛ همان‌گونه که در بیماری‌های تخریب‌کنندهٔ عصبی مانند آلزایمر دیده می‌شود.
تفاوت آلفا-سینوکلئین و آمیلوئید چیست؟
آلفا-سینوکلئین پروتئینی نورونی است که در عملکرد سیناپسی نقش دارد، اما در شرایط بیماری‌زا دچار بدتاخوردگی می‌شود و فیبریل‌های شبه‌آمیلوئیدی تشکیل می‌دهد. «آمیلوئید» اصطلاحی کلی برای تجمعات پروتئینی بدتاخورده و فیبریلی است، درحالی‌که فیبریل‌های آلفا-سینوکلئین مختص بیماری‌هایی مانند پارکینسون هستند.
فیبریل پروتئینی چیست؟
فیبریل پروتئینی تجمعی رشته‌ای، بسیار منظم و غنی از صفحات β است که از پروتئین‌های بدتاخورده یا تاحدی بازشده تشکیل می‌شود. این فیبریل‌ها معمولاً نامحلول‌اند و از طریق پلیمریزاسیون وابسته به هسته‌زایی پدید می‌آیند. آن‌ها با شرایط بیماری‌زای گوناگون، از جمله آمیلوئیدوزها و بیماری‌های تخریب‌کنندهٔ عصبی (مانند آلزایمر و پارکینسون) مرتبط‌اند. بااین‌حال، برخی فیبریل‌های پروتئینی دارای عملکرد زیستی نیز در سامانه‌های زیستی وجود دارند، مانند الیاف کورلی در باکتری‌ها و فیبریل‌های ابریشم در عنکبوت‌ها.
Hielscher Ultrasonics هموژنایزرهای فراصوتی با عملکرد بالا را در اندازه‌های مختلف، از آزمایشگاهی تا صنعتی، تولید می‌کند.