PMCA برای تشخیص پریون‌ها با ظرفیت پردازش بالا با استفاده از سونیکاتور UIP400MTP

سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP راهکاری قدرتمند برای آماده‌سازی نمونه‌ها با ظرفیت پردازش بالا در تکثیر چرخه‌ای بدتاخوردگی پروتئین (PMCA) ارائه می‌دهد. این سامانه با توزیع یکنواخت انرژی در چاهک‌های متعدد و حفظ پارامترهای دقیق فراصوت‌دهی، پردازش هم‌زمان تعداد زیادی نمونه را با تکرارپذیری فوق‌العاده امکان‌پذیر می‌کند. این قابلیت‌ها برای بهینه‌سازی PMCA به‌منظور تشخیص پریون‌ها در غلظت‌های پایین در نمونه‌های زیستی چالش‌برانگیز، مانند بزاق، ضروری هستند؛ نمونه‌هایی که در آن‌ها مهارکننده‌های آزمون می‌توانند نتایج را مبهم کنند.

بیماری‌های پریونی، مانند بیماری تحلیل‌برندهٔ مزمن (CWD) در گوزن‌سانان و بیماری کروتزفلد–یاکوب (CJD) در انسان، اختلالات تخریب‌کنندهٔ دستگاه عصبی هستند که بر اثر پروتئین‌های پریونی بدتاخورده (PrP^Sc) ایجاد می‌شوند. این بیماری‌ها اغلب با مقادیر پایین پریون‌های عفونی در مایعات بدن، مانند بزاق، خون و ادرار، همراه هستند که تشخیص و پژوهش را دشوار می‌کند. انتقال افقی CWD از طریق پریون‌های دفع‌شده در بسترهای محیطی، پیامدهای بسیار مهمی برای مدیریت حیات‌وحش و سلامت بوم‌شناختی دارد. به همین ترتیب، در بیماری‌هایی مانند کروتزفلد–یاکوب، تکثیر قابل‌اعتماد پروتئین‌های پریونی بدتاخورده از نمونه‌های انسانی برای پیشبرد روش‌های تشخیصی و درک روند پیشرفت بیماری ضروری است.

به‌کارگیری پروتکل اصلاح‌شدهٔ PMCA امکان غلبه بر مهارکننده‌های رایج آزمون (مانند موسین‌های بزاق) و دستیابی به حساسیت بالا در تشخیص پریون‌هایی را فراهم می‌کند که در غیر این صورت، با روش‌هایی مانند تبدیل القاشده با تکان‌دهی در زمان واقعی (RT-QuIC)، قابل‌شناسایی نیستند یا نتایج مبهمی می‌دهند. این پیشرفت‌ها تشخیص پریون‌ها را در بیماری‌های مختلف بهبود می‌بخشند و PMCA را به ابزاری ضروری برای پژوهش و تشخیص پریون‌ها تبدیل می‌کنند. سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP با فراصوت‌دهی تعداد زیادی نمونه در میکروپلیت‌ها (مانند پلیت‌های 6، 24 یا 96 چاهکی) یا ویال‌های قرارگرفته در رک لوله، انجام PMCA با ظرفیت پردازش بالا را تسهیل می‌کند.

پروتکل تکثیر چرخه‌ای بدتاخوردگی پروتئین (PMCA) با ظرفیت پردازش بالا

پروتکل زیر پردازش کارآمد تعداد زیادی نمونه را در شرایط کاملاً یکسان برای دستیابی به نتایج پژوهشی مستحکم امکان‌پذیر می‌کند.

آماده‌سازی نمونه

مادهٔ اولیه:
نمونه‌ها را به روش‌های زیر آماده کنید:

• معلق‌سازی مجدد رسوبات حاصل از استخراج با سارکوزیل در سوبسترای PMCA.
• افزودن مستقیم بذرهای پریونی به هموژنات‌های مغز یا نمونه‌های خون.

سوبسترا:

• از هموژنات مغز 10% (wt/vol) تهیه‌شده از موش‌های تراریخته با بیان بیش‌ازحد PrP^C استفاده کنید (مانند موش‌های Tg).
• بافت مغز را در ترکیبات زیر هموژن کنید:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• سوبسترا را تا زمان استفاده در دمای -80ºC نگهداری کنید.

چیدمان نمونه‌ها در میکروپلیت یا لوله‌ها:
لوله‌ها:

• مقدار 90 μL سوبسترای هموژنات مغز اضافه کنید و با 10 μL نمونه (مانند خون، هموژنات مغز یا رسوب سارکوزیل) بذردهی کنید.
• در هر لولهٔ 0٫2 mL، تعداد 3 مهرهٔ تفلونی (با قطر 1٫59-mm یا 2٫38-mm) قرار دهید.
• لوله‌ها را در رکی سازگار با سونیکاتور UIP400MTP مستقر کنید.

میکروپلیت 6 چاهکی:

• به هر چاهک 5 mL سوبسترای هموژنات مغز اضافه کنید و با 500 μL نمونه بذردهی کنید.
• به هر چاهک 3 مهرهٔ تفلونی اضافه کنید.

روش انجام PMCA

جای‌گذاری:
رک لوله یا میکروپلیت 6 چاهکی را طبق دستورالعمل سازنده در سونیکاتور UIP400MTP قرار دهید.

برنامهٔ چرخه‌ها:
تعداد 144 چرخهٔ PMCA را به‌صورت زیر اجرا کنید:

• انکوباسیون: 29 دقیقه و 30 ثانیه در دمای 37°C.
• فراصوت‌دهی: 30 ثانیه با دامنهٔ 60%.
• دما را پایش کنید: از حسگر دمای قابل‌اتصال برای پایش دمای نمونه استفاده کنید و UIP400MTP را برای حداکثر دمای 48–50°C برنامه‌ریزی کنید.

دورهای بعدی:
پس از تکمیل دور نخست شامل 144 چرخه، بخشی از مادهٔ تکثیرشده را منتقل کنید:

• آن را در سوبسترای تازهٔ هموژنات مغز موش تراریخته، 10 برابر رقیق کنید.
• برای دورهای بعدی، 96 چرخهٔ PMCA را با حفظ همان پارامترهای فراصوت‌دهی اجرا کنید.
• این فرایند را تا تعداد دورهای موردنظر (معمولاً تا 5 دور) ادامه دهید.

تشخیص PrP^Sc

1. هضم با پروتئیناز K:
   – نمونه‌ها را با پروتئیناز K با غلظت (50 μg/mL) در دمای 37°C به‌مدت 1 ساعت تیمار کنید.
   – با افزودن بافر نمونهٔ SDS و جوشاندن به‌مدت 10 دقیقه، هضم را متوقف کنید.
2. آنالیز وسترن بلات:
   – نمونه‌های هضم‌شده را با استفاده از موارد زیر آنالیز کنید:
   – آنتی‌بادی‌های ضد PrP از نوع 6H4 یا PRC1.
   – برای آشکارسازی، SDS-PAGE را انجام دهید و انتقال به غشاهای PVDF را اجرا کنید.

 

Hielscher UIP400MTP انعطاف‌پذیرترین سونیکاتور برای پلیت‌های چندچاهکی، پلیت‌های PCR یا لوله‌های نمونه شماست. این دستگاه با توان خروجی 400 وات در فراصوت‌دهی پیوسته، برای کاربردهایی مانند لیز سلولی، امولسیون‌سازی، استخراج پروتئین، قطعه‌قطعه‌سازی DNA / RNA، کلوخه‌زدایی، استخراج از FFPE، جداسازی سلول‌ها و زیست‌لایه‌ها از سطح یا امولسیون‌سازی ساخته شده است. UIP400MTP حمام فراصوتی نیست، بلکه یک هورن فنجانی با شدت بالا برای فراصوت‌دهی متمرکز است. این سونیکاتور قدرتمند و غیرتماسی، فراصوت‌دهی یکنواختی را در تمام چاهک‌های پلیت استاندارد شما فراهم می‌کند. دامنه، توان و عملکرد پالسی را می‌توانید به‌دقت کنترل کنید. زمان‌سنج داخلی و پروب دما، دستیابی به نتایج یکسان را تضمین می‌کنند. سونیکاتور پلیت UIP400MTP نمونه‌ها را با حمام آب خنک می‌کند و چیلر خارجی به‌صورت اختیاری قابل استفاده است.

 

برای دستیابی به نتایج مستحکم‌تر، نمونه‌های بیشتری پردازش کنید

سونیکاتور پلیت چندچاهکی UIP400MTP کارایی و مقیاس‌پذیری تکثیر چرخه‌ای بدتاخوردگی پروتئین (PMCA) را به‌طور چشمگیری افزایش می‌دهد و مشکل زمان‌بر بودن این روش در شیوه‌های مرسوم را برطرف می‌کند. این سامانه با فراهم‌کردن امکان پردازش هم‌زمان حداکثر 96 نمونه در یک پلیت 96 چاهکی، روندهای کاری PMCA را تسهیل می‌کند و در عین حال شرایط دقیق و یکنواخت فراصوت‌دهی را در همهٔ چاهک‌ها حفظ می‌کند. این قابلیت پردازش بالا، کار با نمونه‌ها به‌صورت دستی را به حداقل می‌رساند، مراحل نیازمند کار زیاد را کاهش می‌دهد و تکرارپذیری را تضمین می‌کند؛ ازاین‌رو ابزاری ضروری برای پژوهش‌های پریونی است. چه در بررسی بیماری تحلیل‌برندهٔ مزمن و چه در بررسی بیماری کروتزفلد–یاکوب، UIP400MTP مطالعات در مقیاس بزرگ را با کارایی بیشتر تسهیل می‌کند و به پژوهشگران امکان می‌دهد نیازهای کاربردهای نوین تشخیصی و علمی را برآورده کنند.

---

---

منابع علمی / مراجع

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.