PMCA برای تشخیص پریون ها با توان عملیاتی بالا با استفاده از UIP400MTP Sonicator

UIP400MTP چند چاه صفحه فراصوت ارائه می دهد یک راه حل قدرتمند برای آماده سازی نمونه با توان بالا در پروتئین نادرست تاشو چرخه ای تقویت (PMCA). با ارائه توزیع یکنواخت انرژی در چاه های متعدد و حفظ پارامترهای فراصوت دقیق، این سیستم پردازش همزمان نمونه های متعدد را با تکرارپذیری استثنایی امکان پذیر می کند. این قابلیت ها برای بهینه سازی PMCA برای تشخیص پریون ها در غلظت های پایین در نمونه های بیولوژیکی چالش برانگیز، مانند بزاق، که در آن مهارکننده های سنجش می توانند نتایج را مبهم کنند، بسیار مهم هستند.

بیماری های پریون مانند بیماری لاغری مزمن (CWD) در دهانه رحم و بیماری کروتزفلد-جاکوب (CJD) در انسان، اختلالات تخریب عصبی هستند که توسط پروتئین های پریون تا شده اشتباه (PrP ) ایجاد می شوند^Sc). این بیماری ها اغلب شامل سطوح پایین پریون های عفونی در مایعات بدن مانند بزاق، خون و ادرار است که تشخیص و تحقیقات را پیچیده می کند. انتقال افقی CWD از طریق پریون های ریخته شده در ماتریس های محیطی پیامدهای قابل توجهی برای مدیریت حیات وحش و سلامت اکولوژیکی دارد. به طور مشابه، در بیماری هایی مانند بیماری کروتزفلد-جاکوب، تقویت قابل اعتماد پروتئین های پریون نادرست از نمونه های انسانی برای پیشبرد تشخیص و درک پیشرفت بیماری بسیار مهم است.

استفاده از یک پروتکل PMCA اصلاح شده اجازه می دهد تا مهارکننده های سنجش رایج (به عنوان مثال، موسین های موجود در بزاق) را دور بزنید و با استفاده از تکنیک هایی مانند تبدیل ناشی از لرزش در زمان واقعی (RT-QuIC) به حساسیت بالایی در تشخیص پریون هایی دست یابیم که در غیر این صورت غیرقابل تشخیص یا مبهم هستند. این پیشرفت ها تشخیص پریون را برای بیماری های مختلف افزایش می دهد و PMCA را به ابزاری ضروری برای تحقیقات و تشخیص پریون تبدیل می کند. UIP400MTP چند چاه سونیکاتور صفحه فراصوت PMCA با توان بالا را تسهیل می کند و نمونه های متعددی را در میکروپلیت ها (به عنوان مثال صفحات 6، 24 یا 96 چاه) یا ویال ها در یک قفسه لوله فراهم می کند.

پروتکل تقویت چرخه ای تا نادرست پروتئین با توان عملیاتی بالا (PMCA)

پروتکل زیر امکان پردازش کارآمد تعداد نمونه بالا را در شرایط دقیقا یکسان برای نتایج تحقیقات قوی فراهم می کند.

آماده سازی نمونه

مواد اولیه:
نمونه ها را توسط:

• تعلیق گلوله های استخراج سارکوزیل در بستر PMCA.
• به طور مستقیم همگن مغز یا نمونه های خون با دانه های پریون است.

بستر:

• از یک همگن مغزی 10٪ (wt/vol) تهیه شده از موش های تراریخته که PrP بیش از حد بیان می کنند استفاده کنید^C (به عنوان مثال، موش های Tg).
• بافت مغز را در موارد زیر همگن کنید:
  – 1× PBS.
  – 150 میلی مولار NaCl.
  – 1٪ تریتون X-100.
• بستر را تا زمان استفاده در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری کنید.

راه اندازی نمونه در میکروپلیت یا لوله ها:
لوله:

• اضافه کردن 90 میکرولیتر از بستر همگن مغز و بذر با 10 میکرولیتر نمونه (به عنوان مثال، خون، همگن مغز، یا پلت سارکوسیل).
• 3 مهره تفلون (قطر 1.59 میلی متر یا 2.38 میلی متر) را در هر لوله 0.2 میلی لیتری قرار دهید.
• لوله ها را در یک قفسه سازگار با UIP400MTP صوتی نصب کنید.

6-میکروپلیت چاه:

• 5 میلی لیتر بستر همگن مغز و بذر را با 500 میکرولیتر نمونه در هر چاه اضافه کنید.
• به هر چاه 3 دانه تفلون اضافه کنید.

روش PMCA

قرار دادن:
قفسه لوله یا میکروپلیت 6 چاهی را طبق دستورالعمل سازنده در سونیکاتور UIP400MTP قرار دهید.

برنامه دوچرخه سواری:
144 چرخه PMCA را به شرح زیر انجام دهید:

• جوجه کشی: 29 دقیقه و 30 ثانیه در دمای 37 درجه سانتیگراد.
• فراصوت: 30 ثانیه در دامنه 60٪.
• دما را کنترل کنید: از سنسور دمای قابل اتصال برای نظارت بر دمای نمونه استفاده کنید و UIP400MTP را روی حداکثر برنامه ریزی کنید.دمای 48-50 درجه سانتیگراد.

دورهای بعدی:
پس از اتمام دور اول از 144 چرخه ، یک مقدار از مواد تقویت شده را منتقل کنید:

• 10 برابر را به بستر همگن مغز موش تراریخته تازه رقیق کنید.
• انجام 96 چرخه PMCA برای دورهای بعدی، حفظ همان پارامترهای فراصوت.
• برای تعداد گلوله های مورد نظر (معمولا تا 5) ادامه دهید.

تشخیص PrP^Sc

1. پروتئیناز K هضم:
   – نمونه ها را با پروتئیناز K (50 میکروگرم در میلی لیتر) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت درمان کنید.
   – هضم را با افزودن بافر نمونه SDS و جوشاندن به مدت 10 دقیقه خاتمه دهید.
2. تجزیه و تحلیل وسترن بلات:
   – نمونه های هضم شده را با استفاده از:
   – آنتی بادی های ضد PrP 6H4 یا PRC1.
   – SDS-PAGE را انجام دهید و برای تشخیص به غشاهای PVDF منتقل کنید.

 

 

نمونه های بیشتری را برای نتایج قوی تر پردازش کنید

UIP400MTP چند چاه صفحه فراصوت به طور قابل توجهی افزایش بهره وری و مقیاس پذیری پروتئین نادرست تاشو تکثیر چرخه ای (PMCA), رسیدگی به ماهیت سنتی وقت گیر از روش. با اجازه دادن به پردازش همزمان تا 96 نمونه در یک صفحه 96 چاهی، این سیستم گردش کار PMCA را ساده می کند و در عین حال شرایط فراصوت دقیق و یکنواخت را در تمام چاه ها حفظ می کند. این قابلیت با توان عملیاتی بالا، جابجایی دستی را به حداقل می رساند، مراحل کار فشرده را کاهش می دهد و تکرارپذیری را تضمین می کند و آن را به ابزاری ضروری برای تحقیقات پریون تبدیل می کند. این UIP400MTP چه در مورد بیماری لاغری مزمن یا بیماری کروتزفلد-یاکوب، مطالعات در مقیاس بزرگ را با کارایی بیشتر تسهیل می کند و محققان را قادر می سازد تا نیازهای کاربردهای تشخیصی و علمی مدرن را برآورده کنند.

---

---

ادبیات / منابع

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.