Sonicación de microplacas en proteómica shotgun – Nota de aplicación

La proteómica shotgun depende de una preparación de muestras eficiente y reproducible para convertir material biológico complejo en péptidos listos para LC-MS/MS. El sonicador de microplacas UIP400MTP facilita este proceso al permitir la sonicación estandarizada y en paralelo de muestras de pequeño volumen, lo que ayuda a los laboratorios a mejorar la ruptura, la extracción y la resolubilización en flujos de trabajo basados en microplacas. Esta nota de aplicación describe cómo integrar el UIP400MTP en la preparación de muestras para proteómica, utilizando como ejemplo probado en laboratorio un flujo de trabajo publicado para vesículas extracelulares de estudios sobre PLA2G12A/Th17.

Sonicación de microplacas para una proteómica shotgun más reproducible

Para los investigadores en proteómica, una preparación de muestras reproducible es fundamental para obtener datos de LC-MS/MS de alta calidad. El sonicador de microplacas UIP400MTP permite la sonicación estandarizada y en paralelo en flujos de trabajo basados en placas y de pequeño volumen/alto rendimiento.

Resulta especialmente útil para laboratorios que trabajan con:

• Grandes conjuntos de muestras que requieren un procesamiento uniforme en numerosos pocillos
• Material disponible en cantidades limitadas, en el que deben minimizarse la pérdida de muestra y la variabilidad
• Muestras ricas en lípidos, como las vesículas extracelulares
• Preparaciones biológicas complejas que requieren una ruptura, extracción o resolubilización eficientes
• Proteómica shotgun comparativa, en la que la reproducibilidad entre condiciones y réplicas es esencial

Al integrar la sonicación de microplacas antes de la digestión, los investigadores pueden mejorar la preparación de las muestras para:

• Extracción y resolubilización de proteínas
• Digestión con tripsina/Lys-C
• Adquisición mediante Nano-LC/MS/MS
• Análisis proteómico cuantitativo posterior

La sonicación de microplacas puede beneficiar a:

• Servicios centrales de proteómica
• Laboratorios de investigación en EV
• Laboratorios de inmunología y biología celular
• Grupos de investigación traslacional
• Equipos de ciencias de la vida que pasan de la preparación de muestras individuales a flujos de trabajo con mayor capacidad de procesamiento

Preparación de muestras de alto rendimiento para el análisis del proteoma de vesículas extracelulares

¿Qué es la proteómica shotgun?

La proteómica shotgun se ha convertido en una estrategia analítica fundamental para caracterizar muestras biológicas complejas, desde lisados de células completas y extractos de tejidos hasta orgánulos purificados, vesículas extracelulares y muestras clínicas disponibles en cantidades reducidas. Su principal fortaleza reside en la combinación de la digestión de proteínas, la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem de alta resolución y la inferencia computacional de proteínas a partir de péptidos. Sin embargo, la calidad del conjunto final de datos del proteoma se determina mucho antes de que la muestra llegue al espectrómetro de masas. Una ruptura eficiente de las muestras, la solubilización de proteínas, la eliminación de sustancias interferentes, una digestión enzimática reproducible y una recuperación robusta de péptidos son factores decisivos para la profundidad de cobertura y la fiabilidad cuantitativa.
Para los investigadores en proteómica y los laboratorios de ciencias de la vida que trabajan con muestras limitadas o valiosas, la preparación de muestras suele ser el cuello de botella.

El reto de las vesículas extracelulares en proteómica

Las vesículas extracelulares (EV), por ejemplo, constituyen una clase de muestras particularmente exigente. Son partículas de escala nanométrica delimitadas por una membrana, ricas en lípidos, con un rendimiento proteico relativamente bajo y un elevado potencial de arrastre de lípidos, sales, detergentes, proteínas séricas y otros componentes de la matriz. Estas características pueden interferir en la eficiencia de la digestión, el rendimiento cromatográfico, la estabilidad de la electropulverización y la identificación de péptidos. Por tanto, un flujo de trabajo de preparación para la proteómica de EV debe ser suficientemente eficaz para romper las estructuras vesiculares y solubilizar su contenido proteico, sin dejar de ser compatible con la digestión enzimática y el análisis por LC-MS/MS posteriores.
En este contexto, la ultrasonicación compatible con microplacas ofrece un enfoque práctico para procesar muestras de forma reproducible y en paralelo. Los modelos de sonicadores de microplacas Hielscher UIP400MTP (400 W) y UIP550MTP (550 W) están diseñados para la sonicación de muestras en placas multipocillo y recipientes de pequeño volumen, y permiten flujos de trabajo con mayor capacidad de procesamiento que los sonicadores convencionales de una sola sonda. Para los laboratorios de proteómica, este formato resulta atractivo porque puede reducir la variabilidad de la manipulación manual, mejorar el tratamiento en paralelo de múltiples muestras e integrarse de forma más natural en los procesos de preparación de muestras basados en placas.

Ejemplo de flujo de trabajo

Un flujo de trabajo reciente de proteómica de vesículas extracelulares en el estudio de la biología de las células Th17 mediada por PLA2G12A ofrece un ejemplo útil y probado en laboratorio de cómo incorporar el sonicador de microplacas UIP400MTP a la preparación de muestras para proteómica shotgun. En esa serie de estudios, las muestras de EV se procesaron para el análisis del proteoma mediante tratamiento con metanol, sonicación con UIP400MTP, centrifugación, secado, digestión con tripsina/Lys-C y LC de nanoflujo acoplada a MS en tándem de alta resolución. Mochizuki-Ono y colaboradores publicaron el trabajo biológico en 2026; el análisis proteómico ayudó a caracterizar cómo PLA2G12A altera las proteínas contenidas en las EV en el contexto de las respuestas patógenas de los linfocitos T.

Sonicador de placas multipocillo UIP400MTP

¿Por qué utilizar la sonicación de microplacas?
El UIP400MTP permite la sonicación estandarizada y en paralelo de muestras de pequeño volumen. Esto resulta útil cuando son importantes la reproducibilidad, una cantidad inicial reducida de muestra y la capacidad de procesamiento de múltiples muestras.


Lista de comprobación del control de calidad

• Confirme que todas las muestras tengan una cantidad inicial de EV equivalente en términos de proteína.
• Utilice distribuciones de muestras aleatorizadas o equilibradas para el procesamiento.
• Mantenga constantes el volumen de metanol, el tiempo de sonicación, el tiempo de secado y el volumen de digestión.
• Supervise el rendimiento de péptidos y el número total de proteínas identificadas.
• Compruebe la tasa de sitios de corte no escindidos y la distribución de longitudes de los péptidos.
• Inspeccione la forma de los picos cromatográficos y la reproducibilidad de los tiempos de retención.
• Incluya blancos para supervisar el arrastre.
• Utilice muestras de control de calidad (QC) agrupadas en los estudios de mayor tamaño.
• Evalúe el coeficiente de variación entre réplicas.
• Utilice PCA o métodos relacionados para identificar efectos de lote o muestras atípicas.

Recomendaciones para el registro de datos

Al publicar o documentar este flujo de trabajo, indique la cantidad inicial de EV, el formato de placa, el volumen de metanol, la amplitud y el tiempo de sonicación del UIP400MTP, las condiciones de centrifugación, el método de secado, el tampón de digestión, la concentración enzimática, el tiempo de digestión, las condiciones de acidificación, la plataforma de LC-MS/MS, el modo de adquisición, la versión del software, la base de datos, el umbral de FDR, el método de normalización y el flujo de trabajo estadístico.
Todos los sonicadores de microplacas Hielscher registran automáticamente parámetros importantes del proceso, como la amplitud, la duración de la sonicación y la temperatura, con fecha y hora, en un archivo CVS en la tarjeta SD integrada. ¡El registro de datos para la reproducibilidad y el control de calidad nunca había sido tan fácil!

El estudio en detalle: proteómica shotgun de EV en el estudio de PLA2G12A

El estudio de PLA2G12A ofrece un ejemplo concreto del uso del UIP400MTP en un flujo de trabajo de proteómica shotgun. La pregunta biológica era cómo la fosfolipasa secretada PLA2G12A modifica las vesículas extracelulares derivadas de las células Th17 y, de este modo, influye en la diferenciación de linfocitos T patógenos. Los autores demostraron que PLA2G12A actúa sobre las membranas de las EV para producir lisofosfolípidos, incluida la 1-oleoil-lisofosfatidiletanolamina, y que la señalización posterior del ácido lisofosfatídico a través de LPA2 contribuye a la diferenciación de Th17. Además de la señalización lipídica, los estudios también examinaron el contenido de las EV, incluidos el RNA y las proteínas, lo que convirtió la proteómica shotgun en un componente importante de la estrategia de caracterización.
En el flujo de trabajo de preparación de EV, las células Th17 se cultivaron en un medio con suero fetal bovino deplecionado de exosomas. Los sobrenadantes de cultivo se centrifugaron primero para eliminar las células, se filtraron a través de un filtro de 0,22 µm, se concentraron mediante ultrafiltración/ultracentrifugación, se lavaron, se resuspendieron en PBS y se cuantificaron mediante un ensayo de proteínas BCA. Esta preparación previa de las EV garantizó que pudiera incorporarse al flujo de trabajo de proteómica una cantidad definida de material de EV equivalente en términos de proteína.
Para el análisis proteómico shotgun, los autores utilizaron muestras de EV correspondientes a cantidades equivalentes a 5 µg de proteína. Estas muestras se secaron en tubos de PCR y se añadieron 25 µL de metanol. A continuación, las muestras se sonicaron durante 3 minutos con el sonicador de microplacas UIP400MTP. Tras la sonicación, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 20 minutos a 19.000 × g. Después de retirar 20 µL de sobrenadante, las muestras se centrifugaron hasta sequedad. A continuación, las proteínas se disolvieron mediante sonicación en 4 µL de solución de tripsina/Lys-C a 100 ng/µL en bicarbonato de amonio 50 mM. La digestión se realizó durante 2 horas a 37 °C con agitación a 300 rpm. El digerido se acidificó con 1 µL de ácido trifluoroacético al 1,25% y se sometió a cromatografía líquida de nanoflujo acoplada a espectrometría de masas en tándem de alta resolución.
Este flujo de trabajo pone de relieve varios principios útiles para la proteómica de EV con cantidades iniciales reducidas. En primer lugar, la cantidad inicial se normalizó en términos de proteína equivalente, lo que es importante al comparar EV de distintos genotipos o tratamientos. En segundo lugar, se utilizó metanol antes de la sonicación para favorecer la ruptura y la extracción, evitando a la vez sistemas con detergentes que pueden complicar la LC-MS/MS. En tercer lugar, el paso de sonicación fue breve y estandarizado, lo que es compatible con el procesamiento de muestras en paralelo. En cuarto lugar, la digestión con tripsina/Lys-C se realizó en un volumen muy pequeño, reduciendo la dilución y favoreciendo la recuperación de péptidos a partir de cantidades iniciales reducidas. Por último, el paso directo de la digestión a la acidificación y la LC-MS/MS minimizó las etapas de manipulación innecesarias.
El método posterior de LC-MS/MS utilizó una separación de fase inversa de nanoflujo acoplada a un espectrómetro de masas Q-Exactive HF Orbitrap. Las muestras se retuvieron en una precolumna C18 y, a continuación, se separaron en una columna analítica de 50 µm de diámetro interno a 200 nL/min y 40 °C. El gradiente pasó de una proporción baja de disolvente orgánico a un 35% de disolvente B durante 60 minutos, seguido de un lavado con una proporción elevada de disolvente orgánico y un reequilibrado. La adquisición de MS se realizó en modo de iones positivos mediante adquisición independiente de datos con disociación por colisión de mayor energía. Los archivos de datos brutos DIA se analizaron con DIA-NN 1.8 utilizando una biblioteca espectral predicha in silico.