Sonicación de microplacas en proteómica «shotgun» – Nota de aplicación

La proteómica de tipo «shotgun» depende de una preparación de muestras eficiente y reproducible para convertir material biológico complejo en péptidos listos para su análisis mediante LC-MS/MS. El sonicador de microplacas UIP400MTP facilita este proceso al permitir la sonicación estandarizada y en paralelo de muestras de pequeño volumen, lo que ayuda a los laboratorios a mejorar la disrupción, la extracción y la resolubilización en flujos de trabajo basados en microplacas. Esta nota de aplicación describe cómo se puede integrar el UIP400MTP en la preparación de muestras proteómicas, utilizando como ejemplo probado en laboratorio un flujo de trabajo con vesículas extracelulares publicado a partir de estudios sobre PLA2G12A/Th17.

Sonicación en microplacas para una proteómica «shotgun» más reproducible

Para los investigadores en proteómica, una preparación reproducible de las muestras es fundamental para obtener datos de LC-MS/MS de alta calidad. El sonicador de microplacas UIP400MTP permite realizar una sonicación estandarizada y en paralelo en flujos de trabajo basados en placas y de pequeño volumen y alto rendimiento.

Resulta especialmente útil para los laboratorios que trabajan con:

• Conjuntos de muestras de gran tamaño que requieren un procesamiento uniforme en numerosos pocillos
• Material con cantidad limitada de entrada, en el que es necesario minimizar la pérdida de muestra y la variabilidad
• Muestras ricas en lípidos, como las vesículas extracelulares
• Preparados biológicos complejos que requieren una lisis, extracción o resolubilización eficaces
• Proteómica comparativa de tipo «shotgun», en la que la reproducibilidad entre condiciones y réplicas es esencial

Al integrar la sonicación en microplacas antes de la digestión, los investigadores pueden mejorar la preparación de las muestras para:

• Extracción y resolubilización de proteínas
• Digestión con tripsina/Lys-C
• Adquisición de datos mediante nano-LC/MS/MS
• Análisis proteómico cuantitativo en la fase posterior

 

¡Amplía la preparación de tus muestras proteómicas con total confianza!
Descubre cómo la sonicación de microplacas ayuda a reducir la variabilidad manual, mejorar la disrupción de las muestras y preparar muestras biológicas complejas para un análisis fiable mediante LC-MS/MS.

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La sonicación de microplacas puede resultar beneficiosa para:

• Instalaciones centrales de proteómica
• Laboratorios de investigación sobre vehículos eléctricos
• Laboratorios de inmunología y biología celular
• Grupos de investigación traslacional
• Equipos del ámbito de las ciencias de la vida que pasan de la preparación de muestras individuales a flujos de trabajo de mayor rendimiento

Preparación de muestras de alto rendimiento para el análisis del proteoma de las vesículas extracelulares

¿Qué es la proteómica «shotgun»?

La proteómica de tipo «shotgun» se ha convertido en una estrategia analítica fundamental para caracterizar muestras biológicas complejas, desde lisados de células completas y extractos de tejidos hasta orgánulos purificados, vesículas extracelulares y muestras clínicas de bajo rendimiento. Su principal ventaja radica en la combinación de la digestión de proteínas, la cromatografía líquida de alta resolución acoplada a la espectrometría de masas en tándem y la inferencia computacional de péptidos a proteínas. Sin embargo, la calidad del conjunto de datos proteómicos final se determina mucho antes de que la muestra llegue al espectrómetro de masas. La disrupción eficaz de la muestra, la solubilización de las proteínas, la eliminación de sustancias interferentes, la digestión enzimática reproducible y la recuperación robusta de péptidos son factores decisivos para la profundidad de cobertura y la fiabilidad cuantitativa.
Para los investigadores en proteómica y los laboratorios de ciencias de la vida que trabajan con muestras limitadas o valiosas, la preparación de las muestras suele ser el cuello de botella.

El reto que plantean las vesículas extracelulares en la proteómica

Las vesículas extracelulares (EV), por ejemplo, constituyen una clase de muestras especialmente exigentes. Se trata de partículas a escala nanométrica, rodeadas de una membrana y ricas en lípidos, con un rendimiento proteico relativamente bajo y un alto potencial de contaminación cruzada por lípidos, sales, detergentes, proteínas séricas y otros componentes de la matriz. Estas características pueden interferir en la eficiencia de la digestión, el rendimiento cromatográfico, la estabilidad en electrospray y la identificación de péptidos. Por lo tanto, un flujo de trabajo de preparación para la proteómica de las VE debe ser lo suficientemente potente como para romper las estructuras de las vesículas y solubilizar la carga proteica, sin dejar de ser compatible con la digestión enzimática posterior y el análisis por LC-MS/MS.
En este contexto, la sonicación compatible con microplacas ofrece un enfoque práctico para el procesamiento reproducible y en paralelo de las muestras. Los modelos de sonicadores para microplacas de Hielscher UIP400MTP (400 W) y UIP550MTP (550 W) están diseñados para la sonicación de muestras en placas multipocillo y recipientes de pequeño volumen, lo que permite flujos de trabajo de mayor rendimiento que los sonicadores convencionales de una sola sonda. Para los laboratorios de proteómica, este formato resulta atractivo porque permite reducir la variabilidad debida a la intervención manual, mejorar el tratamiento en paralelo de múltiples muestras e integrarse de forma más natural en los procesos de preparación de muestras basados en placas.

Flujo de trabajo ejemplar

Un flujo de trabajo reciente de proteómica de vesículas extracelulares en la biología de las células Th17 reguladas por PLA2G12A ofrece un ejemplo útil y contrastado en el laboratorio de cómo se puede incorporar el sonicador para microplacas UIP400MTP a la preparación de muestras para la proteómica de tipo «shotgun». En esa serie de estudios, las muestras de vesículas extracelulares (EV) se procesaron para el análisis proteómico mediante tratamiento con metanol, sonicación con el UIP400MTP, centrifugación, secado, digestión con tripsina/Lys-C y cromatografía líquida de nanoflujo (LC) acoplada a espectrometría de masas en tándem de alta resolución. Este mismo trabajo biológico se publicó inicialmente como preimpresión en bioRxiv y, posteriormente, en la revista *Cell Reports*, donde el análisis proteómico ayudó a caracterizar cómo la PLA2G12A altera las proteínas de carga de las EV en el contexto de las respuestas patógenas de las células T.

Sonicador de placas de pocillos múltiples UIP400MTP

¿Por qué utilizar la sonicación en microplacas?
El UIP400MTP permite la sonicación estandarizada y en paralelo de muestras de pequeño volumen. Esto resulta útil cuando son importantes la reproducibilidad, el uso de pequeñas cantidades de muestra y el rendimiento con múltiples muestras.

Lista de comprobación de control de calidad

• Comprueba que la cantidad de proteína EV equivalente introducida sea la misma en todas las muestras.
• Utiliza esquemas de procesamiento de muestras aleatorios o equilibrados.
• Mantén constantes el volumen de metanol, el tiempo de sonicación, el tiempo de secado y el volumen de digestión.
• Controla el rendimiento de péptidos y el número total de proteínas identificadas.
• Comprueba la tasa de escisión fallida y la distribución de la longitud de los péptidos.
• Comprueba la forma de los picos cromatográficos y la reproducibilidad del tiempo de retención.
• Incluye espacios en blanco para controlar el arrastre.
• Utiliza muestras de control de calidad agrupadas para estudios de mayor envergadura.
• Evaluar el coeficiente de variación de las réplicas.
• Utiliza el análisis de componentes principales (PCA) o métodos similares para identificar efectos de lote o muestras atípicas.

Recomendaciones sobre la elaboración de actas

Al publicar o documentar este flujo de trabajo, indique la cantidad de EV introducida, el formato de la placa, el volumen de metanol, la amplitud y el tiempo de sonicación del UIP400MTP, las condiciones de centrifugación, el método de secado, el tampón de digestión, la concentración enzimática, el tiempo de digestión, las condiciones de acidificación, la plataforma de LC-MS/MS, el modo de adquisición, la versión del software, la base de datos, el umbral de FDR, el método de normalización y el flujo de trabajo estadístico.
Todos los sonicadores para microplacas de Hielscher registran automáticamente parámetros importantes del proceso, como la amplitud, la duración de la sonicación y la temperatura, con indicación de fecha y hora, en un archivo CSV almacenado en la tarjeta SD integrada. ¡El registro de datos para garantizar la reproducibilidad y el control de calidad nunca ha sido tan fácil!

El estudio en detalle: Proteómica de EV Shotgun en el estudio sobre PLA2G12A

El estudio sobre la PLA2G12A ofrece un ejemplo concreto del uso del UIP400MTP en un flujo de trabajo de proteómica de tipo «shotgun». La cuestión biológica era cómo la fosfolipasa secretada PLA2G12A modifica las vesículas extracelulares derivadas de las células Th17 y, por lo tanto, influye en la diferenciación de las células T patógenas. Los autores demostraron que la PLA2G12A actúa sobre las membranas de las vesículas extracelulares (EV) para producir lisofosfolípidos, entre ellos la 1-oleoil-lisofosfatidiletanolamina, y que la señalización posterior del ácido lisofosfatídico a través de la LPA2 contribuye a la diferenciación de las células Th17. Más allá de la señalización lipídica, los estudios también examinaron la carga de las vesículas extracelulares, incluido su contenido de ARN y proteínas, lo que convirtió a la proteómica de tipo «shotgun» en un componente importante de la estrategia de caracterización.
En el proceso de preparación de los EV, las células Th17 se cultivaron en un medio que contenía suero fetal bovino desprovisto de exosomas. Los sobrenadantes de cultivo se centrifugaron primero para eliminar las células, se filtraron a través de un filtro de 0,22 µm, se concentraron mediante ultrafiltración/ultracentrifugación, se lavaron, se resuspendieron en PBS y se cuantificaron mediante el ensayo de proteínas BCA. Esta preparación previa de las EV garantizó que se pudiera incorporar al flujo de trabajo proteómico una cantidad definida de material de EV, equivalente en proteínas.
Para el análisis proteómico de tipo «shotgun», los autores utilizaron muestras de EV equivalentes a 5 µg de proteína. Estas muestras se secaron en tubos de PCR y se les añadieron 25 µL de metanol. A continuación, las muestras se sometieron a sonicación durante 3 minutos utilizando el sonicador de microplacas UIP400MTP. Tras la sonicación, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 20 minutos a 19 000 × g. Tras retirar 20 µL de sobrenadante, las muestras se centrifugaron hasta secarlas por completo. A continuación, las proteínas se disolvieron mediante sonicación en 4 µL de solución de tripsina/Lys-C a 100 ng/µL en bicarbonato de amonio 50 mM. La digestión se llevó a cabo durante 2 horas a 37 °C con agitación a 300 rpm. El producto de la digestión se acidificó con 1 µL de ácido trifluoroacético al 1,25 % y se sometió a cromatografía de líquidos de nanoflujo (LC) acoplada a espectrometría de masas en tándem de alta resolución.
Este flujo de trabajo pone de relieve varios principios útiles para la proteómica de vesículas extracelulares (EV) con bajo volumen de muestra. En primer lugar, la muestra se normalizó por equivalente proteico, lo cual es importante a la hora de comparar EV de diferentes genotipos o tratamientos. En segundo lugar, se utilizó metanol antes de la sonicación, lo que favorece la ruptura y la extracción, al tiempo que evita el uso de sistemas detergentes que podrían complicar el análisis por LC-MS/MS. En tercer lugar, la etapa de sonicación fue breve y estandarizada, lo que es compatible con el procesamiento paralelo de muestras. En cuarto lugar, la digestión con tripsina/Lys-C se llevó a cabo en un volumen muy pequeño, lo que redujo la dilución y favoreció la recuperación de péptidos a partir de muestras de bajo rendimiento. Por último, la transición directa de la digestión a la acidificación y al LC-MS/MS minimizó los pasos de manipulación innecesarios.
El método LC-MS/MS posterior utilizó una separación en fase inversa de nanoflujo acoplada a un espectrómetro de masas Orbitrap Q-Exactive HF. Las muestras se retuvieron en una precolumna C18 y, a continuación, se separaron en una columna analítica de 50 µm de diámetro interior a un caudal de 200 nL/min y a 40 °C. El gradiente pasó de un disolvente con bajo contenido en orgánico al 35 % de disolvente B en 60 minutos, seguido de un lavado con alto contenido en orgánico y un reequilibrio. La adquisición de datos de MS se realizó en modo de iones positivos utilizando la adquisición independiente de datos con disociación colisional de alta energía. Los archivos sin procesar de DIA se analizaron utilizando DIA-NN 1.8 con una biblioteca de espectros predichos in silico.