Παραγωγή β-γλυκανών σχιζοφυλλάνης υψηλής καθαρότητας με υπερήχους

Η σχιζοφυλλάνη είναι μια μυκητιακή β-γλυκάνη με ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες. Για ιδιαίτερα ισχυρή φαρμακευτική δράση, η σχιζοφυλλάνη πρέπει να έχει χαμηλό μοριακό βάρος ώστε να παρουσιάζει βελτιωμένη βιοδιαθεσιμότητα. Έχει αποδειχθεί ότι η κατεργασία με υπερήχους μειώνει το μοριακό βάρος της σχιζοφυλλάνης. Ως αξιόπιστη και αποτελεσματική μέθοδος, η κατεργασία με υπερήχους μπορεί να εφαρμοστεί εύκολα για την παραγωγή σχιζοφυλλάνης χαμηλού μοριακού βάρους.

Μανιτάρια Schizophyllum και εκχύλιση β-γλυκανών με υπερήχους

Τα είδη μανιταριών του γένους Schizophyllum αναπτύσσονται στη φύση σε δέντρα που αποσυντίθενται μετά τις περιόδους βροχών. Τα καρποσώματα συλλέγονται κατά την επόμενη ξηρή περίοδο. Τα είδη Schizophyllum είναι πλούσια σε βιοχημικές ενώσεις, όπως οι γλυκάνες, και επομένως καταναλώνονται, ιδιαίτερα στις τροπικές χώρες, ως τροφή και φάρμακο. Λόγω των ανοσοτροποποιητικών, αντιμυκητιακών, αντινεοπλασματικών και αντιιικών ιδιοτήτων του, το Schizophyllum commune, γνωστό και ως μανιτάρι με σχισμένα ελάσματα, έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον εταιρειών βιοτεχνολογίας και φαρμακευτικών εταιρειών.
Ο πολυσακχαρίτης σχιζοφυλλάνη, γνωστός και ως sizofiran, sonifilan ή sizofilan, είναι η κύρια β-γλυκάνη που απαντά στα μανιτάρια Schizophyllum, τα οποία παρέχουν την ιδιαίτερα αποτελεσματική βιοδραστική β-γλυκάνη σχιζοφυλλάνη.
Τα μανιτάρια Schizophyllum commune αναπτύσσονται στη φύση πάνω σε δέντρα, ενώ το μυκήλιο μπορεί επίσης να καλλιεργηθεί σε ζωμό ζύμωσης. Για φαρμακευτικές και καλλυντικές εφαρμογές, η σχιζοφυλλάνη χαμηλού μοριακού βάρους είναι πολύ πιο αποτελεσματική από τη σχιζοφυλλάνη υψηλού μοριακού βάρους. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η σχιζοφυλλάνη χαμηλού μοριακού βάρους παρουσιάζει σημαντικά καλύτερη βιοδιαθεσιμότητα και υψηλότερους ρυθμούς απορρόφησης. Επιπλέον, η σχιζοφυλλάνη υψηλού μοριακού βάρους είναι συχνά προβληματική στις εφαρμογές, καθώς προκαλεί υψηλό ιξώδες στα υδατικά διαλύματά της.
Η μείωση του μεγέθους με υπερήχους είναι μια ιδιαίτερα αποτελεσματική και αξιόπιστη τεχνική για τη μείωση του μοριακού βάρους της σχιζοφυλλάνης, βελτιώνοντας έτσι την ποιότητα του μορίου της β-γλυκάνης.

Πρωτόκολλο για την παραγωγή σχιζοφυλλάνης χαμηλού μοριακού βάρους

Δεδομένου ότι η σχιζοφυλλάνη μοριακού βάρους παρουσιάζει δραστικά καλύτερη βιοδιαθεσιμότητα και ιδιότητες εφαρμογής, η ερευνητική ομάδα του Smirnou διερεύνησε την κατεργασία με υπερήχους για τη διάσπαση και τη μείωση του μεγέθους του μορίου της β-γλυκάνης σχιζοφυλλάνης.

Κατεργασία σχιζοφυλλάνης με υπερήχους

Η β-1.3(1.6)-γλυκάνη σχιζοφυλλάνη (SPG) παρήχθη με βυθισμένη καλλιέργεια του μύκητα S. commune σε βιοαντιδραστήρα, με χρήση σακχαρόζης ως υποστρώματος.
Μετά το τέλος της καλλιέργειας, ο ζωμός καλλιέργειας αραιώθηκε με απιονισμένο νερό έως συγκέντρωση σχιζοφυλλάνης 2 g/L και υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους με τον Επεξεργαστή υπερήχων UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Γερμανία) σε λειτουργία ανακυκλοφορίας με τις ακόλουθες παραμέτρους και συνθήκες: παροχή μέσου 50 mL/s, συχνότητα 20 kHz, ισχύς εξόδου 2000 W, ηχοτρόδιο τύπου BS2d22, ενισχυτής πλάτους τύπου B2-1.4 και πλάτος 100%. Η θερμοκρασία του ζωμού καλλιέργειας στην αρχή της κατεργασίας με υπερήχους ήταν 25°C. Ο ζωμός καλλιέργειας που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους (ειδική εισροή ενέργειας 100 Ws/mL) διηθήθηκε μέσω φίλτρου βάθους Seitz HS800 υπό πίεση 1,5 bar στους 40°C. Η σχιζοφυλλάνη που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους (uSPG) για χημικό χαρακτηρισμό καταβυθίστηκε από το διήθημα με τριπλάσια ποσότητα ισοπροπυλικής αλκοόλης σε θερμοκρασία εργαστηρίου και ξηράνθηκε στους 60°C για 12h. Τα διαλύματα uSPG για ανοσολογικές μελέτες παρασκευάστηκαν ως εξής: (1) το διήθημα του ζωμού καλλιέργειας που είχε υποβληθεί σε κατεργασία με υπερήχους υποβλήθηκε σε διαδιήθηση μέσω κασέτας PES Pall Centramate T-series 0,1m2 (όριο αποκοπής 100 kDa) στα 0,8 bar και η διαδιήθηση συνεχίστηκε έως ότου η αγωγιμότητα του κατακρατούμενου υγρού έφτασε τα 20 μS/cm· (2) το διάλυμα συμπυκνώθηκε με διαδιήθηση έως συγκέντρωση uSPG 1 g/L και αποστειρώθηκε σε αυτόκλειστο στους 120°C/20 min. Η μετουσιωμένη uSPG παρασκευάστηκε με παρόμοιο τρόπο, με τη διαφορά ότι προστέθηκε NaOH στο διήθημα του ζωμού καλλιέργειας σε συγκέντρωση 0,2 M και το αλκαλοποιημένο διάλυμα επωάστηκε για 30 min σε θερμοκρασία εργαστηρίου πριν από τη διαδιήθηση.

Αναλυτικές μέθοδοι

Η απόδοση σε μυκήλιο εκτιμήθηκε σταθμικά: ο ζωμός καλλιέργειας αραιώθηκε με νερό σε αναλογία 1:4 και φυγοκεντρήθηκε στα 10.000 × g, στους 25°C για 20 min. Το ίζημα εκπλύθηκε με τριπλάσια ποσότητα νερού, ξηράνθηκε στους 60°C και ζυγίστηκε. Η σχιζοφυλλάνη κατακρημνίστηκε από το υπερκείμενο υγρό με τριπλάσια ποσότητα ισοπροπυλικής αλκοόλης, ξηράνθηκε στους 60°C για 24h και η απόδοσή της προσδιορίστηκε σταθμικά. Η pO2 στον ζωμό καλλιέργειας μετρήθηκε με τον οπτικό αισθητήρα Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Ελβετία).
Το δυναμικό ιξώδες του ζωμού καλλιέργειας μετρήθηκε με το HAAKE Visco Tester 6L, με ατράκτους 1L και 2L, στους 4°C και με ταχύτητα περιστροφής 30 rpm. Η ταχύτητα διήθησης υπολογίστηκε από τον χρόνο διήθησης 500 mL ζωμού καλλιέργειας μέσω φίλτρου βάθους Seitz HS800 (Pall, ΗΠΑ), διαστάσεων 200 × 200 mm, υπό πίεση 1,5 bar και στους 40°C.
Το μοριακό βάρος της uSPG μετρήθηκε με SEC-MALLS σε σύστημα HPLC Alliance (Waters), με στήλες PL aquagel OH60 και PL aquagel OH40 συνδεδεμένες σε σειρά, και ο ανιχνευτής miniDAWN TREOS (Wyatt) συμπυκνώθηκε με διαδιήθηση μέχρι συγκέντρωση uSPG 1 g/L και αποστειρώθηκε σε αυτόκαυστο στους 120°C/20 min. Η μετουσιωμένη uSPG παρασκευάστηκε με παρόμοιο τρόπο, με τη διαφορά ότι στο διήθημα του ζωμού καλλιέργειας προστέθηκε NaOH σε συγκέντρωση 0,2 M και το αλκαλοποιημένο διάλυμα επωάστηκε για 30 min σε θερμοκρασία εργαστηρίου πριν από τη διαδιήθηση.

Αποτελέσματα:
Η κατεργασία με υπερήχους εφαρμόστηκε απευθείας σε ζωμό καλλιέργειας S. commune διάρκειας 144 ωρών, ο οποίος περιείχε μυκήλιο, για να διευκολυνθούν τα μεταγενέστερα στάδια επεξεργασίας της SPG.
 
Χαρακτηριστικά της σχιζοφυλλάνης που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους: Η σχιζοφυλλάνη που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους (uSPG) κατακρημνίστηκε από το διήθημα του ζωμού καλλιέργειας με αλκοόλη και χαρακτηρίστηκε. Με SEC-MALLS εκτιμήθηκε ότι το Mw της uSPG ήταν περίπου 1 MDa. Το μέσο μοριακό βάρος της σχιζοφυλλάνης από υγρή ζύμωση είναι περίπου 5 MDa, ενώ σε καλλιέργεια στερεάς κατάστασης μπορεί να φτάσει έως και τα 10 MDa. Συγκρίνοντας το μοριακό βάρος της σχιζοφυλλάνης που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους με τα μοριακά βάρη της φυσικής, μη επεξεργασμένης σχιζοφυλλάνης, μπορεί να παρατηρηθεί μείωση του μοριακού βάρους κατά 5 έως 10 φορές λόγω της κατεργασίας με υπερήχους.
Ο πολυσακχαρίτης uSPG που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους περιείχε 0,7%w/w πρωτεΐνη και 1,0%w/w υπόλειμμα μετά από πύρωση. Το υδρόλυμα της uSPG αποτελούνταν από γλυκόζη σε ποσοστό άνω του 99%. Τα αναλυτικά αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η κατεργασία με υπερήχους διασπά τυχαία τον κύριο σκελετό της β-γλυκάνης και ότι οι πλευρικές διακλαδώσεις παραμένουν άθικτες, μειώνοντας έτσι το μέγεθος και το μοριακό βάρος της σχιζοφυλλάνης. Ανοσολογικές μελέτες σε uSPG ουσιαστικά απαλλαγμένη από πρωτεΐνες και ενδοτοξίνες έδειξαν ότι η σχιζοφυλλάνη χαμηλού Mw που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους έχει έντονη ανοσοτροποποιητική δράση.

 
Μειωμένο ιξώδες: Η κατεργασία με υπερήχους οδήγησε σε σημαντική μείωση του ιξώδους του ζωμού καλλιέργειας. Κατά την κατεργασία με υπερήχους, το ιξώδες του ζωμού καλλιέργειας μεταβαλλόταν μη γραμμικά: η μείωση του ιξώδους ήταν ταχεία στην αρχή της κατεργασίας με υπερήχους, αλλά στη συνέχεια επιβραδύνθηκε. Ειδική εισροή ενέργειας 100 Ws/mL ήταν επαρκής για να μειώσει το ιξώδες του ζωμού καλλιέργειας σχεδόν κατά 7 φορές.

Βελτιωμένη διήθηση: Ο ζωμός καλλιέργειας που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους διήλθε από το φίλτρο ταχύτερα από τον μη επεξεργασμένο ζωμό καλλιέργειας (ειδική εισροή ενέργειας 0 Ws/mL) με SPG υψηλού μοριακού βάρους. Επιπλέον, η κατεργασία με υπερήχους μείωσε σημαντικά την απώλεια προϊόντος κατά τη διήθηση. Το διήθημα του μη επεξεργασμένου ζωμού καλλιέργειας με SPG υψηλού μοριακού βάρους (ειδική εισροή ενέργειας 0 Ws/mL) περιείχε 0,3 ± 0,07 g/L SPG, ενώ η συγκέντρωση της SPG πριν από τη διήθηση βάθους ήταν 2 g/L. Αντίθετα, το διήθημα του ζωμού καλλιέργειας που υποβλήθηκε σε κατεργασία με υπερήχους στα 100 Ws/mL περιείχε SPG σε συγκέντρωση 2,2 ± 0,2 g/L, η οποία αντιστοιχεί σε σχεδόν μηδενική απώλεια προϊόντος.

Συμπέρασμα: Στο συμπέρασμά της, η ερευνητική ομάδα συνοψίζει ότι η επεξεργασία με υπερήχους αποτελεί αποδοτική τεχνολογία για την παραγωγή σχιζοφυλλάνης χαμηλού μοριακού βάρους, η οποία μπορεί στη συνέχεια να χρησιμοποιηθεί σε καλλυντικά και στην ιατρική. Η κατεργασία με υπερήχους, όταν εφαρμόζεται στον πλήρη ζωμό καλλιέργειας μαζί με το μυκήλιο, προσφέρει ορισμένα πλεονεκτήματα στην παραγωγή σχιζοφυλλάνης. Μειώνει τις απώλειες προϊόντος κατά τα επακόλουθα στάδια επεξεργασίας και καθιστά δυνατή την παραγωγή πολυσακχαρίτη υψηλής καθαρότητας χάρη στην αποδοτική χρήση της υπερδιήθησης.
Επιπλέον, οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι η επεξεργασία της σχιζοφυλλάνης με υπερήχους μπορεί εύκολα να εφαρμοστεί σε μεγαλύτερη κλίμακα. Μία μονάδα του διασπαστή υπερήχων πιλοτικής εγκατάστασης UIP2000hdT επεξεργάστηκε 1 Liter ζωμού καλλιέργειας σε 110 s σε λειτουργία ροής. Η παραγωγικότητα του συστήματος μπορεί εύκολα να αυξηθεί με τη σύνδεση πρόσθετων μονάδων υπερήχων σε σειρά.

 
Διαβάστε περισσότερα για την απλή αύξηση της κλίμακας εκχύλισης μανιταριών!
 

Εξοπλισμός υπερήχων υψηλών επιδόσεων για την επεξεργασία μυκητιακών γλυκανών

Ο κατακερματισμός πολυσακχαριτών, όπως οι γλυκάνες, καθώς και άλλων βιοδραστικών ενώσεων, όπως η χιτίνη και η χιτοζάνη, μπορεί να πραγματοποιηθεί αξιόπιστα με τον εξοπλισμό υπερήχων υψηλών επιδόσεων της Hielscher. Οι συσκευές υπερήχων μας μπορούν να παρέχουν υψηλά πλάτη ταλάντωσης, προσφέρουν ακριβή έλεγχο των παραμέτρων της διεργασίας και μπορούν να λειτουργούν 24/7 υπό μεγάλο φορτίο και σε απαιτητικά περιβάλλοντα. Η σειρά εξοπλισμού της Hielscher Ultrasonics καλύπτει αξιόπιστα αυτές τις απαιτήσεις. Εκτός από τις εξαιρετικές επιδόσεις υπερήχων, οι συσκευές υπερήχων της Hielscher διαθέτουν υψηλή ενεργειακή απόδοση, η οποία αποτελεί σημαντικό οικονομικό πλεονέκτημα – ιδίως όταν χρησιμοποιούνται σε εμπορική παραγωγή μεγάλης κλίμακας.
Οι συσκευές υπερήχων της Hielscher είναι συστήματα υψηλών επιδόσεων που μπορούν να εξοπλιστούν με παρελκόμενα, όπως ηχοτρόδια, ενισχυτές, αντιδραστήρες ή κυψελίδες ροής, ώστε να ανταποκρίνονται με τον βέλτιστο τρόπο στις ανάγκες της διεργασίας σας.
Με την ψηφιακή έγχρωμη οθόνη, τη δυνατότητα προκαθορισμού κύκλων κατεργασίας με υπερήχους, την αυτόματη καταγραφή δεδομένων σε ενσωματωμένη κάρτα SD, τον απομακρυσμένο έλεγχο μέσω προγράμματος περιήγησης και πολλές ακόμη λειτουργίες, εξασφαλίζονται ο μέγιστος έλεγχος της διεργασίας και η μέγιστη ευχρηστία. Σε συνδυασμό με την ανθεκτικότητα και την ικανότητα αντοχής σε μεγάλα φορτία, τα συστήματα υπερήχων της Hielscher αποτελούν τον αξιόπιστο στυλοβάτη της παραγωγής σας.
Η μείωση του μοριακού βάρους των β-γλυκανών, όπως η σχιζοφυλλάνη, απαιτεί ισχυρούς υπερήχους για την επίτευξη της στοχευμένης διάσπασης και ενός τελικού προϊόντος σχιζοφυλλάνης υψηλής ποιότητας, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε φαρμακευτικές εφαρμογές.
 
Βρείτε εδώ περισσότερες πληροφορίες για την εκχύλιση β-γλυκανών από μανιτάρια με υπερήχους, συμπεριλαμβανομένων οδηγιών βήμα προς βήμα!
 
Ο παρακάτω πίνακας παρέχει μια ένδειξη της κατά προσέγγιση δυναμικότητας επεξεργασίας των συσκευών υπερήχων μας: