Sonikering til forbedring af celleopbrydning og ekstraktion fra alger

Alger, både makro- og mikroalger, indeholder mange værdifulde forbindelser, der anvendes som næringsrige fødevarer, fødevaretilsætningsstoffer eller som brændstof eller råmateriale til brændstof. For at frigøre målstofferne fra algecellen kræves en kraftfuld og effektiv celleopbrydningsteknik. Ultralydsekstraktorer er yderst effektive og pålidelige til ekstraktion af bioaktive forbindelser fra plantemateriale, alger og svampe. Hielscher ultralydsekstraktorer fås til laboratorie-, bord- og industriskala og er veletablerede til fremstilling af cellebaserede ekstrakter inden for fødevare-, lægemiddel- og biobrændstofproduktion.

Alger som en værdifuld ressource til ernæring og brændstof

Algeceller er en alsidig kilde til bioaktive og energirige forbindelser såsom proteiner, kulhydrater, lipider og andre bioaktive stoffer samt alkaner. Dette gør alger til en kilde til fødevarer og næringsstoffer samt brændstoffer.
Mikroalger er en værdsat kilde til lipider, der anvendes til ernæring og som råmateriale til biobrændstoffer (f.eks. biodiesel). Stammer af det marine fytoplankton Dicrateria, såsom Dicrateria rotunda, er kendt som benzinproducerende alger, der kan syntetisere en række mættede kulbrinter (n-alkaner) fra C₁₀H₂₂ til C₃₈H₇₈, der kategoriseres som benzin (C10–C15), dieselolier (C16–C20) og brændselsolier (C21–C38).
På grund af deres næringsværdi anvendes alger som “funktionelle fødevarer” eller “nutraceutika”. Vigtige mikronæringsstoffer, der ekstraheres fra alger, omfatter carotenoiderne astaxanthin, fucoxanthin og zeaxanthin samt fucoidan, laminari og andre glucaner, som sammen med adskillige andre bioaktive stoffer anvendes som kosttilskud og lægemidler. Carrageenan, alginat og andre hydrokolloider anvendes som fødevaretilsætningsstoffer. Algelipider anvendes som en vegansk omega-3-kilde og desuden som brændstof eller som råmateriale til produktion af biodiesel.

Celleopbrydning og ekstraktion fra alger med effektultralyd

Ultralydsekstraktorer, eller blot ultralydsapparater, anvendes til at ekstrahere værdifulde forbindelser fra små prøver i laboratoriet samt til produktion i stor kommerciel skala.
Algeceller er beskyttet af komplekse cellevægsmatricer, der består af lipider, cellulose, proteiner, glycoproteiner og polysaccharider. Grundlaget for de fleste algecellevægge består af et mikrofibrillært netværk i en gelagtig proteinmatrix; nogle mikroalger har dog en uorganisk, stiv væg bestående af kiselskaller af opalin silica eller calciumcarbonat. For at udvinde bioaktive forbindelser fra algebiomasse kræves en effektiv celleopbrydningsteknik. Ud over de teknologiske ekstraktionsfaktorer (dvs. ekstraktionsmetode og udstyr) påvirkes effektiviteten af celleopbrydning og ekstraktion fra alger også i høj grad af forskellige algeafhængige faktorer såsom cellevæggens sammensætning, placeringen af det ønskede biomolekyle i mikroalgecellerne og mikroalgernes vækststadium ved høst.

Hvordan fungerer celleopbrydning og ekstraktion fra alger med ultralyd?

Når ultralydsbølger med høj intensitet indkobles i en væske eller suspension via en ultralydssonde (også kendt som et ultralydshorn eller en sonotrode), bevæger lydbølgerne sig gennem væsken og skaber skiftende højtryks-/lavtrykscyklusser. Under disse højtryks-/lavtrykscyklusser opstår der meget små vakuumbobler eller hulrum. Kavitationsbobler opstår, når det lokale tryk under lavtrykscyklusserne falder tilstrækkeligt langt under det mættede damptryk, en værdi bestemt af væskens trækstyrke ved en bestemt temperatur. Disse bobler vokser over flere cyklusser. Når vakuumboblerne når en størrelse, hvor de ikke kan absorbere mere energi, imploderer boblen voldsomt under en højtrykscyklus. Kavitationsboblernes implosion er en voldsom, energitæt proces, der genererer intense chokbølger, turbulens og mikrostråler i væsken. Derudover opstår der lokalt meget høje tryk og meget høje temperaturer. Disse ekstreme forhold kan uden videre opbryde cellevægge og membraner og frigøre intracellulære forbindelser på en effektiv, virkningsfuld og hurtig måde. Intracellulære forbindelser såsom proteiner, polysaccharider, lipider, vitaminer, mineraler og antioxidanter kan således ekstraheres effektivt ved hjælp af effektultralyd.

Ultralydskavitation til celleopbrydning og ekstraktion

Ved eksponering for intens ultralydsenergi opbrydes væggen eller membranen i enhver type celle (herunder plante-, pattedyrs-, alge-, svampe- og bakterieceller osv.), og cellen rives i mindre fragmenter af de mekaniske kræfter fra energitæt ultralydskavitation. Når cellevæggen brydes, frigøres de cellulære metabolitter såsom protein, lipid, nukleinsyre og klorofyl fra både cellevægsmatricen og cellens indre og overføres til det omgivende dyrkningsmedium eller opløsningsmiddel.
Den ovenfor beskrevne mekanisme ved ultralydskavitation / akustisk kavitation medfører omfattende opbrydning af hele algeceller eller gas- og væskevakuoler inde i cellerne. Ultralydskavitationen, vibrationerne, turbulensen og mikrostrømningen fremmer stoftransporten mellem cellens indre og det omgivende opløsningsmiddel, så biomolekylerne (dvs. metabolitterne) frigøres effektivt og hurtigt. Sonikering er en rent mekanisk behandling, der ikke kræver aggressive, giftige og/eller dyre kemikalier.
Ultralyd med høj intensitet og lav frekvens skaber ekstreme, energitætte forhold med høje tryk, temperaturer og store forskydningskræfter. Disse fysiske kræfter fremmer opbrydningen af cellestrukturer for at frigøre intracellulære forbindelser til mediet. Derfor anvendes lavfrekvent ultralyd i vid udstrækning til ekstraktion af bioaktive stoffer og brændstoffer fra alger. Sammenlignet med konventionelle ekstraktionsmetoder såsom opløsningsmiddelekstraktion, kuglemaling eller højtrykshomogenisering udmærker ultralydsekstraktion sig ved at frigøre størstedelen af de bioaktive forbindelser (såsom lipider, proteiner, polysaccharider og mikronæringsstoffer) fra den sonoporerede og opbrudte celle. Under de rette procesbetingelser giver ultralydsekstraktion overlegne ekstraktionsudbytter på meget kort procestid. For eksempel giver højtydende ultralydsekstraktorer fremragende ekstraktionsresultater fra alger, når de anvendes med et egnet opløsningsmiddel. I et surt eller alkalisk medium bliver algecellevæggen porøs og rynket, hvilket medfører øgede udbytter ved lav temperatur (under 60°C) og kort sonikeringstid (mindre end 3 timer). Den korte ekstraktionstid ved milde temperaturer forhindrer nedbrydning af fucoidan, så der opnås et meget bioaktivt polysaccharid.
Sonikering er også en metode til at omdanne fucoidan med høj molekylvægt til fucoidan med lav molekylvægt, som er væsentligt mere bioaktivt på grund af sin afgrenede struktur. Med sin høje bioaktivitet og biotilgængelighed fra materialet er fucoidan med lav molekylvægt en interessant forbindelse til lægemidler og lægemiddelleveringssystemer.

Casestudier: Ultralydsekstraktion af forbindelser fra alger

Effektiviteten af ultralydsekstraktion og optimeringen af ultralydsekstraktionsparametre er blevet undersøgt grundigt. Nedenfor finder du eksempler på ekstraktionsresultater opnået ved sonikering af forskellige algearter.

Proteinekstraktion fra spirulina ved hjælp af mano-termo-sonikering

Prof. Chemats forskningsgruppe (Avignons Universitet) undersøgte virkningerne af manotermosonikering (MTS) på ekstraktion af proteiner (såsom phycocyanin) fra tørre Arthrospira platensis-cyanobakterier (også kendt som spirulina). Mano-termo-sonikering (MTS) er anvendelsen af ultralyd kombineret med forhøjede tryk og temperaturer for at intensivere ultralydsekstraktionsprocessen.
“Ifølge forsøgsresultaterne fremmede MTS stoftransporten (høj effektiv diffusivitet, De) og gjorde det muligt at udvinde 229% mere protein (28,42 ± 1,15 g/100 g DW) end ved den konventionelle proces uden ultralyd (8,63 ± 1,15 g/100 g DW). Med 28,42 g protein pr. 100 g tør spirulinabiomasse i ekstraktet blev der opnået en proteingenvindingsgrad på 50% på 6 effektive minutter med en kontinuerlig MTS-proces. Mikroskopiske observationer viste, at akustisk kavitation påvirkede spirulinafilamenter gennem forskellige mekanismer såsom fragmentering, sonoporation og nedbrydning af teksturen. Disse forskellige fænomener letter ekstraktion, frigørelse og solubilisering af bioaktive forbindelser fra spirulina.” [Vernès et al., 2019]

Lysmikroskopibilleder af hele spirulinafilamenter, der over tid er blevet udsat for MTS-behandling. Målestok (billede A) = 50 μm for alle billeder.
billede og undersøgelse: ©Vernès et al. 2019

Ultralydsekstraktion af fucoidan og glucaner fra Laminaria digitata

Dr. Tiwaris forskningsgruppe ved TEAGASC undersøgte ekstraktion af polysaccharider, dvs. fucoidan, laminarin og samlede glucaner, fra makroalgen Laminaria digitata ved hjælp af ultralydsapparatet UIP500hdT. De undersøgte parametre for ultralydsassisteret ekstraktion (UAE) havde betydelig indflydelse på niveauerne af fucose, FRAP og DPPH. Der blev opnået niveauer på henholdsvis 1060,75 mg/100 g ds, 968,57 mg/100 g ds, 8,70 μM trolox/mg fde og 11,02% for fucose, samlede glucaner, FRAP og DPPH under optimerede betingelser med hensyn til temperatur (76◦C), tid (10 min) og ultralydsamplitude (100%) med 0,1 M HCl som opløsningsmiddel. De beskrevne UAE-betingelser blev derefter med succes anvendt på andre økonomisk relevante brune makroalger (L. hyperborea og A. nodosum) for at opnå polysaccharidrige ekstrakter. Denne undersøgelse demonstrerer anvendeligheden af UAE til at forbedre ekstraktionen af bioaktive polysaccharider fra forskellige makroalgearter.

Ultralydsekstraktion af fytokemiske stoffer fra F. vesiculosus og P. canaliculata

García-Vaqueros forskerhold sammenlignede forskellige nye ekstraktionsteknikker, herunder højtydende ultralydsekstraktion, ultralyds-mikrobølgeekstraktion, mikrobølgeekstraktion, hydrotermisk assisteret ekstraktion og højtryksassisteret ekstraktion, for at vurdere ekstraktionseffektiviteten fra de brune mikroalgearter Fucus vesiculosus og Pelvetia canaliculata. Til sonikeringen anvendte de Hielscher UIP500hdT ultralydsekstraktoren. Analysen af ekstraktionsudbytterne viste, at ultralydsekstraktion opnåede de højeste udbytter af de fleste fytokemiske stoffer fra begge F. vesiculosus. Det betyder, at de højeste udbytter af forbindelser ekstraheret fra F. vesiculosus ved hjælp af ultralydsekstraktoren UIP500hdT var: samlet indhold af phenoliske stoffer (445,0 ± 4,6 mg gallussyreækvivalenter/g), samlet phlorotanninindhold (362,9 ± 3,7 mg phloroglucinolækvivalenter/g), samlet flavonoidindhold (286,3 ± 7,8 mg quercetinækvivalenter/g) og samlet tanninindhold (189,1 ± 4,4 mg catechinækvivalenter/g).
I deres undersøgelse konkluderede holdet, at anvendelsen af ultralydsassisteret ekstraktion “kombineret med en 50% ethanolopløsning som ekstraktionsopløsningsmiddel kunne være en lovende strategi rettet mod ekstraktion af TPC, TPhC, TFC og TTC, samtidig med at samtidig ekstraktion af uønskede kulhydrater fra både F. vesiculosus og P. canaliculata reduceres, med lovende anvendelsesmuligheder, når disse forbindelser anvendes som lægemidler, nutraceutika og kosmeceutika.” [García-Vaquero et al., 2021]

Opskalering af mano-termo-sonikering ved Avignons Universitet ved hjælp af Hielscher ultralydsapparater: fra laboratorieudstyr UIP1000hdT (A) til udstyr i pilotskala UIP4000hdT (B, C & D). Billede D viser et skematisk tværsnit af ultralydsflowcellen FC100K.
billede og undersøgelse: ©Vernès et al. 2019

Højtydende ultralydsekstraktorer til opbrydning af alger

Hielschers avancerede ultralydsudstyr giver fuld kontrol over procesparametrene såsom amplitude, temperatur, tryk og energitilførsel.
Ved ultralydsekstraktion kan parametre såsom råmaterialets partikelstørrelse, opløsningsmiddeltype, forholdet mellem faststof og opløsningsmiddel samt ekstraktionstid varieres og optimeres for at opnå de bedste resultater.
Da ultralydsekstraktion er en ikke-termisk ekstraktionsmetode, undgås termisk nedbrydning af de bioaktive bestanddele i råmaterialet, såsom alger.
Samlet set gør fordele såsom højt udbytte, kort ekstraktionstid, lav ekstraktionstemperatur og små mængder opløsningsmiddel sonikering til den overlegne ekstraktionsmetode.

Ultralydsekstraktion: Veletableret i laboratorier og industri

Ultralydsekstraktion anvendes i vid udstrækning til ekstraktion af enhver type bioaktiv forbindelse fra plantemateriale, alger, bakterier og pattedyrsceller. Ultralydsekstraktion er veletableret som en enkel, omkostningseffektiv og yderst effektiv metode, der overgår andre traditionelle ekstraktionsteknikker med højere ekstraktionsudbytter og kortere behandlingstid.
Med let tilgængelige ultralydssystemer til laboratorie-, bord- og fuld industriskala er ultralydsekstraktion i dag en veletableret og betroet teknologi. Hielscher ultralydsekstraktorer er installeret over hele verden i industrielle produktionsanlæg, der fremstiller bioaktive forbindelser af fødevare- og lægemiddelkvalitet.

Processtandardisering med Hielscher Ultrasonics

Ekstrakter fra alger, der anvendes i fødevarer, lægemidler eller kosmetik, skal fremstilles i overensstemmelse med god fremstillingspraksis (GMP) og under standardiserede processpecifikationer. Hielscher Ultrasonics’ digitale ekstraktionssystemer leveres med intelligent software, der gør det nemt at indstille og styre sonikeringsprocessen præcist. Automatisk dataregistrering gemmer alle ultralydsprocesparametre såsom ultralydsenergi (samlet energi og nettoenergi), amplitude, temperatur og tryk (når temperatur- og tryksensorer er monteret) med dato- og tidsstempel på det indbyggede SD-kort. Dette giver dig mulighed for at gennemgå hvert ultralydsbehandlet parti. Samtidig sikres reproducerbarhed og vedvarende høj produktkvalitet.

Tabellen nedenfor giver en indikation af vores ultralydsapparaters omtrentlige behandlingskapacitet: