Výroba chitinu a chitosanu z hub

Sonikace je vysoce účinná metoda uvolňování chitinu a chitosanu z houbových zdrojů, jako jsou houby. Chitin a chitosan musí být při následném zpracování depolymerizovány a deacetylovány, aby se získal vysoce kvalitní biopolymer. Ultrazvukem asistovaná depolymerizace a deacetylace je vysoce účinná, jednoduchá a rychlá technika, jejímž výsledkem jsou vysoce kvalitní chitosany s vysokou molekulovou hmotností a vynikající biologickou dostupností.

Chitin a chitosan z hub pomocí sonikace

Jedlé a léčivé houby, jako jsou Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (lingzhi nebo reishi), Inonotus obliquus (čaga), Agaricus bisporus (žampion dvouvýtrusý), Hericium erinaceus (korálovec ježovitý, lví hříva), Cordyceps sinensis (housenice čínská), Grifola frondosa (trsnatec lupenitý), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, outkovka pestrá) a mnoho dalších druhů hub, se široce používají jako potravina a k extrakci bioaktivních látek. Tyto houby i zbytky ze zpracování (houbový odpad) lze využít k výrobě chitosanu. Sonikace nejen podporuje uvolňování chitinu ze struktury buněčné stěny hub, ale také pohání přeměnu chitinu na cenný chitosan prostřednictvím ultrazvukem asistované depolymerizace a deacetylace.

Toto video předvádí vysoce účinnou extrakci korálovce ježatého pomocí ultrazvukového homogenizátoru Hielscher UP200Ht. Ultrazvuková extrakce je ideální technikou pro výrobu vysoce kvalitních plnospektrálních extraktů obsahujících polysacharidy, jako jsou beta-glukany, a také hericenony a erinaciny.

Intenzivní sonikace pomocí ultrazvukového systému sondového typu je technika používaná k podpoře depolymerizace a deacetylace chitinu, která vede ke vzniku chitosanu. Chitin je přirozeně se vyskytující polysacharid, který se nachází v exoskeletech korýšů a hmyzu a v buněčných stěnách některých hub. Chitosan se získává z chitinu odstraněním acetylových skupin z molekuly chitinu.

Ultrazvukový postup přeměny houbového chitinu na chitosan

Při použití intenzivní sonikace k výrobě chitosanu z chitinu se suspenze chitinu sonikuje vysoce intenzivními nízkofrekvenčními ultrazvukovými vlnami, typicky v rozsahu 20 kHz až 30 kHz. Tento proces vytváří intenzivní akustickou kavitaci, což označuje vznik, růst a kolaps mikroskopických vakuových bublin v kapalině. Kavitace vytváří v kapalině obklopující kavitační bubliny lokálně extrémně vysoké smykové síly, vysoké teploty (až několik tisíc stupňů Celsia) a tlaky (až několik set atmosfér). Tyto extrémní podmínky přispívají k rozkladu chitinového polymeru a následné deacetylaci.

 

Ultrazvuková depolymerizace chitinu

Depolymerizace chitinu probíhá díky kombinovanému působení mechanických sil, jako je mikroproudění a tvorba kapalinových mikroproudů (jetů), a také díky ultrazvukem iniciovaným chemickým reakcím vyvolaným volnými radikály a dalšími reaktivními částicemi vznikajícími při kavitaci. Vysokotlaké vlny generované při kavitaci vystavují chitinové řetězce smykovému napětí, což vede ke štěpení polymeru na menší fragmenty.

Ultrazvuková deacetylace chitinu

Kromě depolymerizace podporuje intenzivní sonikace také deacetylaci chitinu. Deacetylace zahrnuje odstranění acetylových skupin z molekuly chitinu, což vede ke vzniku chitosanu. Intenzivní ultrazvuková energie, zejména vysoké teploty a tlaky vznikající při kavitaci, urychluje deacetylační reakci. Reaktivní podmínky vytvořené kavitací pomáhají štěpit acetylové vazby v chitinu, což vede k uvolnění kyseliny octové a přeměně chitinu na chitosan.
Celkově intenzivní sonikace zlepšuje procesy depolymerizace i deacetylace tím, že dodává potřebnou mechanickou a chemickou energii k rozkladu chitinového polymeru a usnadňuje přeměnu na chitosan. Tato technika nabízí rychlou a účinnou metodu výroby chitosanu z chitinu s řadou aplikací v různých odvětvích, včetně farmacie, zemědělství a biomedicínského inženýrství.

Průmyslová výroba chitosanu z hub pomocí výkonového ultrazvuku

Komerční výroba chitinu a chitosanu je založena především na odpadu z mořského průmyslu (tj. rybolovu, sběru měkkýšů a korýšů atd.). Různé zdroje suroviny vedou k různé kvalitě chitinu a chitosanu, což má za následek kolísání produkce a kvality v důsledku sezónních výkyvů rybolovu. Chitosan získaný z houbových zdrojů navíc údajně nabízí ve srovnání s chitosanem z mořských zdrojů lepší vlastnosti, jako je homogenní délka polymeru a vyšší rozpustnost. (srov. Ghormade et al., 2017) Pro dodávky jednotného chitosanu se extrakce chitinu z druhů hub stala stabilní alternativní výrobou. Výrobu chitinu a chitosanu z hub lze snadno a spolehlivě zajistit pomocí technologie ultrazvukové extrakce a deacetylace. Intenzivní sonikace narušuje buněčné struktury, čímž uvolňuje chitin, a podporuje přenos hmoty ve vodných rozpouštědlech, což zajišťuje vynikající výtěžky chitinu a účinnost extrakce. Následná ultrazvuková deacetylace přeměňuje chitin na cenný chitosan. Ultrazvukovou extrakci chitinu i deacetylaci na chitosan lze lineárně škálovat na jakoukoli komerční úroveň výroby.

Výsledky výzkumu ultrazvukové deacetylace chitinu a chitosanu

Zhu et al. (2018) ve své studii dospěli k závěru, že ultrazvuková deacetylace se ukázala jako zásadní průlom, neboť přeměňuje β-chitin na chitosan se stupněm deacetylace 83–94% při snížených reakčních teplotách. Obrázek vlevo ukazuje SEM snímek ultrazvukově deacetylovaného chitosanu (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (obrázek a studie: © Zhu et al., 2018)
V jejich protokolu byl roztok NaOH (20 w/v %) připraven rozpuštěním šupinek NaOH v DI vodě. Alkalický roztok byl poté přidán k sedimentu GLSP (0,5 g) v poměru pevné a kapalné fáze 1:20 (g: mL) do centrifugační zkumavky. Chitosan byl přidán k NaCl (40 mL, 0,2 M) a kyselině octové (0,1 M) v objemovém poměru roztoků 1:1. Suspenze byla poté vystavena ultrazvuku při mírné teplotě 25°C po dobu 60 min pomocí ultrazvukového přístroje sondového typu (250W, 20kHz). (srov. Zhu et al., 2018)

Pandit et al. (2021) zjistili, že rychlost degradace roztoků chitosanu je jen zřídka ovlivněna koncentracemi kyseliny použité k rozpuštění polymeru a do značné míry závisí na teplotě, intenzitě ultrazvukových vln a iontové síle média použitého k rozpuštění polymeru. (srov. Pandit et al., 2021)

V jiné studii použili Zhu et al. (2019) jako houbovou surovinu prášek ze spor Ganoderma lucidum a zkoumali ultrazvukem asistovanou deacetylaci a vliv procesních parametrů, jako je doba sonikace, poměr pevné a kapalné fáze, koncentrace NaOH a výkon ozařování, na stupeň deacetylace (DD) chitosanu. Nejvyšší hodnota DD byla dosažena při následujících ultrazvukových parametrech: 20 min sonikace při 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Povrchová morfologie, chemické skupiny, tepelná stabilita a krystalinita ultrazvukově získaného chitosanu byly zkoumány pomocí SEM, FTIR, TG a XRD. Výzkumný tým uvádí významné zvýšení stupně deacetylace (DD), dynamické viskozity ([η]) a molekulové hmotnosti (Mv¯) ultrazvukově vyrobeného chitosanu. Výsledky potvrdily, že technika ultrazvukové deacetylace hub je vysoce účinnou metodou výroby chitosanu, který je vhodný pro biomedicínské aplikace. (srov. Zhu et al., 2019)

Vynikající kvalita chitosanu díky ultrazvukové depolymerizaci a deacetylaci

Ultrazvukem řízené procesy extrakce a depolymerizace chitinu / chitosanu jsou přesně kontrolovatelné a parametry ultrazvukového procesu lze přizpůsobit surovinám a cílové kvalitě konečného produktu (např. molekulové hmotnosti, stupni deacetylace). To umožňuje přizpůsobit ultrazvukový proces vnějším faktorům a nastavit optimální parametry pro vynikající výsledek a účinnost.
Ultrazvukově deacetylovaný chitosan vykazuje vynikající biologickou dostupnost a biokompatibilitu. Při porovnání biomedicínských vlastností ultrazvukově připravených chitosanových biopolymerů s tepelně získaným chitosanem vykazuje ultrazvukově vyrobený chitosan výrazně lepší viabilitu fibroblastů (buněk L929) a zvýšenou antibakteriální aktivitu vůči Escherichia coli (E. coli) i Staphylococcus aureus (S. aureus).
(srov. Zhu et al., 2018)

Vysoce výkonné ultrazvukové zařízení pro zpracování chitinu a chitosanu

Fragmentace chitinu a deacetylace chitinu na chitosan vyžaduje výkonné a spolehlivé ultrazvukové zařízení, které dokáže dodávat vysoké amplitudy, nabízí přesnou kontrolu nad procesními parametry a může být provozováno 24/7 při vysokém zatížení a v náročných prostředích. Produktová řada Hielscher Ultrasonics tyto požadavky spolehlivě splňuje. Kromě vynikajícího ultrazvukového výkonu se ultrazvukové přístroje Hielscher vyznačují vysokou energetickou účinností, což je významná ekonomická výhoda – zejména při nasazení v komerční velkovýrobě.
Ultrazvukové přístroje Hielscher jsou vysoce výkonné systémy, které lze vybavit příslušenstvím, jako jsou sonotrody, boostery, reaktory nebo průtokové cely, aby optimálně odpovídaly potřebám vašeho procesu. Díky digitálnímu barevnému displeji, možnosti přednastavení průběhů sonikace, automatickému záznamu dat na integrovanou SD kartu, vzdálenému ovládání přes prohlížeč a mnoha dalším funkcím zajišťují ultrazvukové přístroje Hielscher nejvyšší kontrolu procesu a uživatelskou přívětivost. Ve spojení s robustností a vysokou zatížitelností jsou ultrazvukové systémy Hielscher vaším spolehlivým tahounem ve výrobě. Fragmentace a deacetylace chitinu vyžaduje výkonný ultrazvuk, aby se dosáhlo cílové přeměny a vysoce kvalitního konečného chitosanového produktu. Zejména pro fragmentaci chitinových vloček a kroky depolymerizace / deacetylace jsou zásadní vysoké amplitudy a zvýšené tlaky. Průmyslové ultrazvukové procesory Hielscher Ultrasonics snadno dodávají velmi vysoké amplitudy. Amplitudy až 200µm lze nepřetržitě provozovat v režimu 24/7. Pro ještě vyšší amplitudy jsou k dispozici zakázkové ultrazvukové sonotrody. Výkonová kapacita ultrazvukových systémů Hielscher umožňuje účinnou a rychlou depolymerizaci a deacetylaci v bezpečném a uživatelsky přívětivém procesu.

Níže uvedená tabulka vám poskytne představu o přibližné kapacitě zpracování našich ultrazvukových přístrojů:

---

---

Synergické zpracování chitinu zlepšené sonikací

Aby se překonaly nevýhody (tj. nízká účinnost, vysoké náklady na energii, dlouhá doba zpracování, toxická rozpouštědla) tradiční chemické a enzymatické deacetylace chitinu, byl do zpracování chitinu a chitosanu začleněn vysoce intenzivní ultrazvuk. Vysoce intenzivní sonikace a z ní vyplývající účinky akustické kavitace vedou k rychlému štěpení polymerních řetězců a snižují polydisperzitu, čímž podporují syntézu chitosanu. Ultrazvukové smykové síly navíc intenzifikují přenos hmoty v roztoku, takže se zesilují chemické, hydrolytické nebo enzymatické reakce. Ultrazvukové zpracování chitinu lze kombinovat s již existujícími technikami zpracování chitinu, jako jsou chemické metody, hydrolýza nebo enzymatické postupy.

Ultrazvukem asistovaná chemická deacetylace a depolymerizace

Protože chitin je nereaktivní a nerozpustný biopolymer, musí projít procesními kroky demineralizace, deproteinizace a depolymerizace / deacetylace, aby se získal rozpustný a biologicky dostupný chitosan. Tyto procesní kroky zahrnují ošetření silnými kyselinami, jako je HCl, a silnými zásadami, jako jsou NaOH a KOH. Protože jsou tyto konvenční procesní kroky neefektivní, pomalé a energeticky náročné, intenzifikace procesu sonikací výrazně zlepšuje výrobu chitosanu. Použití výkonového ultrazvuku zvyšuje výtěžky a kvalitu chitosanu, zkracuje proces ze dnů na několik hodin, umožňuje použití mírnějších rozpouštědel a činí celý proces energeticky účinnějším.

Ultrazvukem zlepšená deproteinizace chitinu

Vallejo-Dominguez et al. (2021) ve svém výzkumu deproteinizace chitinu zjistili, že „použití ultrazvuku při výrobě biopolymerů snížilo obsah bílkovin i velikost částic chitinu. S pomocí ultrazvuku byl vyroben chitosan s vysokým stupněm deacetylace a střední molekulovou hmotností.“

Ultrazvuková hydrolýza pro depolymerizaci chitinu

Při chemické hydrolýze se k deacetylaci chitinu používají buď kyseliny, nebo zásady, přičemž alkalická deacetylace (např. hydroxidem sodným NaOH) je rozšířenější. Kyselá hydrolýza je alternativní metodou k tradiční chemické deacetylaci, při níž se k depolymerizaci chitinu a chitosanu používají roztoky organických kyselin. Metoda kyselé hydrolýzy se většinou používá tehdy, když musí být molekulová hmotnost chitinu a chitosanu homogenní. Tento konvenční hydrolytický proces je známý jako pomalý a energeticky i nákladově náročný. Potřeba silných kyselin, vysokých teplot a tlaků jsou faktory, které z hydrolytického procesu výroby chitosanu činí velmi nákladný a časově náročný postup. Použité kyseliny vyžadují následné procesy, jako je neutralizace a odsolování.
Začleněním vysoce výkonného ultrazvuku do hydrolytického procesu lze výrazně snížit teplotní a tlakové nároky na hydrolytické štěpení chitinu a chitosanu. Sonikace navíc umožňuje nižší koncentrace kyselin nebo použití mírnějších kyselin. Díky tomu je proces udržitelnější, účinnější, nákladově efektivnější a šetrnější k životnímu prostředí.

Ultrazvukem asistovaná chemická deacetylace

Chemického rozkladu a deacetylace chitinu a chitosanu se dosahuje především ošetřením chitinu nebo chitosanu minerálními kyselinami (např. kyselinou chlorovodíkovou HCl), dusitanem sodným (NaNO₂) nebo peroxidem vodíku (H₂O₂). Ultrazvuk zvyšuje rychlost deacetylace, a tím zkracuje reakční dobu potřebnou k dosažení cílového stupně deacetylace. To znamená, že sonikace zkracuje potřebnou dobu zpracování 12–24 hodin na několik hodin. Sonikace navíc umožňuje výrazně nižší koncentrace chemikálií, například 40% (w/w) hydroxid sodný při použití sonikace, zatímco bez použití ultrazvuku je zapotřebí 65% (w/w).

Ultrazvukovo-enzymatická deacetylace

Přestože je enzymatická deacetylace mírnou formou zpracování šetrnou k životnímu prostředí, její účinnost a náklady jsou neekonomické. Kvůli složité, pracné a nákladné následné izolaci a purifikaci enzymů z konečného produktu není enzymatická deacetylace chitinu zavedena v komerční výrobě, ale používá se pouze ve vědeckých výzkumných laboratořích.
Ultrazvuková předúprava před enzymatickou deacetylací fragmentuje molekuly chitinu, čímž zvětšuje povrchovou plochu a zpřístupňuje enzymům větší povrch. Vysoce výkonná sonikace pomáhá zlepšit enzymatickou deacetylaci a činí proces hospodárnějším.