Ultrazvučna deacetilacija hitina u hitozan

Hitozan je biopolimer dobijen iz hitina koji ima brojne primjene u farmaciji, prehrambenoj industriji, poljoprivredi i industriji. Ultrazvučna deacetilacija hitina u hitozan znatno intenzivira obradu – što dovodi do efikasnog i brzog procesa s visokim prinosom hitozana vrhunskog kvaliteta.

Ultrazvučna proizvodnja hitozana

Hitozan se dobija N-deacetilacijom hitina. Pri konvencionalnoj deacetilaciji hitin se močи u vodenim alkalnim rastvorima (obično 40 do 50% (w/w) NaOH). Proces močenja zahtijeva visoke temperature od 100 do 120ºC, veoma je dugotrajan, a prinos hitozana dobijen po koraku močenja je nizak. Primjena ultrazvuka velike snage znatno intenzivira proces deacetilacije hitina i rezultira visokim prinosom hitozana niske molekulske mase u brzoj obradi na nižoj temperaturi. Ultrazvučna deacetilacija daje hitozan vrhunskog kvaliteta koji se koristi kao sastojak hrane i farmaceutskih proizvoda, kao đubrivo i u mnogim drugim industrijskim primjenama.
Ultrazvučna obrada rezultira izuzetnim stepenom acetilacije (DA) hitina, pri čemu se stepen acetilacije snižava s DA≥90 kod hitina na DA≤10 kod hitozana.
Mnoge istraživačke studije potvrđuju efikasnost ultrazvučne deacetilacije hitina u hitozan. Weiss J. et al. (2008) utvrdili su da sonikacija drastično poboljšava konverziju hitina u hitozan. Ultrazvučna obrada hitina donosi znatne uštede vremena, jer se potrebno vrijeme procesa smanjuje s 12-24 sata na nekoliko sati. Osim toga, za postizanje potpune konverzije potrebno je manje rastvarača, što smanjuje uticaj na okoliš koji nastaje odbacivanjem i zbrinjavanjem istrošenog ili nereagovanog rastvarača, tj. koncentrovanog NaOH.

Ultrazvučna deacetilacija hitina u hitozan

Deacetilacija hitina u hitozan potpomognuta je sonikacijom

Ultrazvučni uređaj velike snage UIP4000hdT za industrijske primjene

UIP4000hdT – ultrazvučni sistem velike snage od 4kW

Princip rada ultrazvučne obrade hitozana

Ultrazvučna obrada velike snage i niske frekvencije (∼20-26kHz) stvara akustičnu kavitaciju u tečnostima i suspenzijama. Ultrazvuk velike snage potiče konverziju hitina u hitozan jer se rastvarač (npr. NaOH) fragmentira i prodire u čvrste čestice hitina, čime se povećava površina i poboljšava prijenos mase između čvrste i tečne faze. Nadalje, velike smične sile ultrazvučne kavitacije stvaraju slobodne radikale koji povećavaju reaktivnost reagensa (tj. NaOH) tokom hidrolize. Kao netermička tehnika obrade, sonikacija sprječava termičku razgradnju i tako daje hitozan visokog kvaliteta. Ultrazvuk skraćuje vrijeme obrade potrebno za ekstrakciju hitina iz rakova, a u poređenju s tradicionalnim uslovima obrade daje i hitin (a time i naknadno hitozan) veće čistoće. Za proizvodnju hitina i hitozana ultrazvuk stoga ima potencijal da smanji troškove proizvodnje, skrati vrijeme obrade, omogući bolju kontrolu proizvodnog procesa i smanji uticaj otpada iz procesa na okoliš.

Prednosti ultrazvučne proizvodnje hitozana

Veći prinos hitozana
Vrhunski kvalitet
Kraće vrijeme
Niža temperatura procesa
Povećana efikasnost
Jednostavan & siguran rad
Ekološki prihvatljivo

Ultrazvučna deacetilacija hitina u hitozan – protokol

1) Priprema hitina:
Ako se kao izvorni materijal koriste oklopi rakova, oklope treba temeljito oprati kako bi se uklonile sve rastvorljive organske tvari i prianjajuće nečistoće, uključujući zemlju i protein. Nakon toga materijal oklopa mora se potpuno osušiti (npr. na 60ºC tokom 24h u pećnici). Osušeni oklopi se zatim melju (npr. čekićarem), deproteiniziraju u alkalnom mediju (npr. NaOH koncentracije 0,125 do 5,0 M) i demineraliziraju u kiselini (npr. razrijeđenoj hlorovodoničnoj kiselini).
2) Ultrazvučna deacetilacija
Za izvođenje tipične reakcije ultrazvučne deacetilacije čestice beta-hitina (0,125 mm < d < 0,250 mm) suspenduju se u 40% (w/w) vodenom rastvoru NaOH u omjeru beta-hitin/vodeni rastvor NaOH od 1/10(g mL^-1), suspenzija se prenosi u staklenu čašu s dvostrukim zidom i sonicira pomoću uređaja Hielscher UP400St ultrazvučnog homogenizatora. Sljedeći parametri (usp. Fiamingo et al. 2016) održavaju se konstantnim pri izvođenju reakcije ultrazvučne deacetilacije hitina: (i) ultrazvučna sonda (sonotroda Hielscher S24d22D, prečnik vrha = 22 mm); (ii) pulsni režim sonikacije (IP = 0,5sec); (iii) ultrazvučni površinski intenzitet
(I = 52,6 W cm^-2), (iv) temperatura reakcije (60ºC ±1ºC), (v) vrijeme reakcije (50 min), (vi) omjer mase beta-hitina i zapremine 40% (w/w) vodenog rastvora natrijum-hidroksida (BCHt/NaOH = 1/10 g mL^-1); (vii) zapremina suspenzije beta-hitina (50mL).
Prva reakcija traje 50min uz stalno magnetno miješanje, a zatim se prekida brzim hlađenjem suspenzije na 0ºC. Nakon toga se dodaje razrijeđena hlorovodonična kiselina do postizanja pH 8,5, a uzorak CHs1 izdvaja se filtracijom, temeljito ispire dejonizovanom vodom i suši na ambijentalnim uslovima. Kada se ista ultrazvučna deacetilacija ponovi kao drugi korak na CHs1, dobija se uzorak CHs2.

Snimci skenirajućom elektronskom mikroskopijom (SEM) pri uvećanju od 100× za a) gladijus, b) gladijus obrađen ultrazvukom, c) β-hitin, d) β-hitin obrađen ultrazvukom i e) hitozan (izvor: Preto et al. 2017)

Fiamingo i saradnici utvrdili su da ultrazvučna deacetilacija beta-hitina efikasno daje hitozan visoke molekulske mase s niskim stepenom acetilacije, bez upotrebe aditiva, inertne atmosfere ili dugog trajanja reakcije. Pritom se reakcija ultrazvučne deacetilacije provodi u blažim uslovima – tj. na niskoj temperaturi reakcije u poređenju s većinom termohemijskih deacetilacija. Ultrazvučna deacetilacija beta-hitina omogućava pripremu nasumično deacetilovanog hitozana promjenljivog stepena acetilacije (4% ≤ DA ≤ 37%), visoke masene prosječne molekulske mase (900.000 g mol^-1 ≤ M_w ≤ 1.200.000 g mol^-1 ) i niske disperznosti (1,3 ≤ Ð ≤ 1,4) provođenjem tri uzastopne reakcije (50 min/korak) na 60ºC.

Hielscher Ultrasonics proizvodi ultrazvučne uređaje visokih performansi za sonohemijske primjene.

Ultrazvučni procesori velike snage od laboratorijske preko pilot do industrijske skale.

Ultrazvučni sistemi visokih performansi za proizvodnju hitozana

Fragmentacija hitina i deacetilacija hitina u hitozan zahtijevaju snažnu i pouzdanu ultrazvučnu opremu koja može isporučiti visoke amplitude, nudi preciznu kontrolu nad parametrima procesa i može raditi 24/7 pod velikim opterećenjem i u zahtjevnim okruženjima. Proizvodni program kompanije Hielscher Ultrasonics pokriva vas i zahtjeve vašeg procesa. Hielscher ultrazvučni uređaji (ultrasonicators) su sistemi visokih performansi koji se mogu opremiti dodacima kao što su sonotrode, booster-i, reaktori ili protočne ćelije kako bi se na optimalan način prilagodili potrebama vašeg procesa.
Zahvaljujući digitalnom ekranu u boji, mogućnosti unaprijed postavljenih ciklusa sonikacije, automatskom snimanju podataka na integrisanu SD karticu, daljinskom upravljanju putem preglednika i mnogim drugim funkcijama osigurani su najviša kontrola procesa i jednostavnost korištenja. Zahvaljujući robusnosti i velikom kapacitetu opterećenja, Hielscher ultrazvučni sistemi su vaš pouzdani radni konj u proizvodnji.
Fragmentacija i deacetilacija hitina zahtijevaju snažan ultrazvuk kako bi se postigla ciljana konverzija i konačni proizvod hitozan visokog kvaliteta. Posebno su za fragmentaciju pahuljica hitina presudni visoke amplitude i povišeni pritisci. Industrijski ultrazvučni procesori kompanije Hielscher Ultrasonics lako isporučuju veoma visoke amplitude. Amplitude do 200µm mogu se kontinuirano održavati u radu 24/7. Za još više amplitude dostupne su prilagođene ultrazvučne sonotrode. Kapacitet snage Hielscher ultrazvučnih sistema omogućava efikasnu i brzu deacetilaciju u sigurnom procesu jednostavnom za korištenje.

Tabela u nastavku daje vam orijentacijski prikaz približnog kapaciteta obrade naših ultrazvučnih uređaja:

Zapremina šarže	Protok	Preporučeni uređaji
1 do 500mL	10 do 200mL/min	UP100H
10 do 2000mL	20 do 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 do 20L	0,2 do 4L/min	UIP2000hdT
10 do 100L	2 do 10L/min	UIP4000hdT
n.a.	10 do 100L/min	UIP16000
n.a.	veći	klaster uređaja UIP16000

Kontaktirajte nas! / Pitajte nas!

Literatura/reference

Butnaru E., Stoleru E., Brebu M.A., Darie-Nita R.N., Bargan A., Vasile C. (2019): Chitosan-Based Bionanocomposite Films Prepared by Emulsion Technique for Food Preservation. Materials 2019, 12(3), 373.
Fiamingo A., de Moura Delezuk J.A., Trombotto St. David L., Campana-Filho S.P. (2016): Extensively deacetylated high molecular weight chitosan from the multistep ultrasound-assisted deacetylation of beta-chitin. Ultrasonics Sonochemistry 32, 2016. 79–85.
Kjartansson, G., Wu, T., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Sonochemically-Assisted Conversion of Chitin to Chitosan, USDA National Research Initiative Principal Investigators Meeting, New Orleans, LA, June 28th.
Kjartansson, G., Kristbergsson, K. Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Influence of temperature during deacetylation of chitin to chitosan with high-intensity ultrasound as a pre-treatment, Annual Meeting of the Institute of Food Technologists, New Orleans, LA, June 30th, 95-18.
Kjartansson, G., Kristbergsson, K., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): Influence of high-intensity ultrasound to accelerate the conversion of chitin to chitosan, Annual Meeting of the Institute of Food Technologists, New Orleans, LA, June 30th, 95-17.
Preto M.F., Campana-Filho S.P., Fiamingo A., Cosentino I.C., Tessari-Zampieri M.C., Abessa D.M.S., Romero A.F., Bordon I.C. (2017): Gladius and its derivatives as potential biosorbents for marine diesel oil. Environmental Science and Pollution Research (2017) 24:22932–22939.
Wijesena R.N., Tissera N., Kannangara Y.Y., Lin Y., Amaratunga G.A.J., de Silva K.M.N. (2015): A method for top down preparation of chitosan nanoparticles and nanofibers. Carbohydrate Polymers 117, 2015. 731–738.
Wu, T., Zivanovic, S., Hayes, D.G., Weiss, J. (2008). Efficient reduction of chitosan molecular weight by high-intensity ultrasound: Underlying mechanism and effect of processing parameters. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(13):5112-5119.
Yadav M.; Goswami P.; Paritosh K.; Kumar M.; Pareek N.; Vivekanand V. (2019): Seafood waste: a source for preparation of commercially employable chitin/chitosan materials. Bioresources and Bioprocessing 6/8, 2019.

Povezane teme

Činjenice vrijedne znanja

Kako funkcioniše ultrazvučna deacetilacija hitina?

Kada se ultrazvuk velike snage i niske frekvencije (npr. 20-26kHz) uvodi u tečnost ili suspenziju, na tečnost se primjenjuju naizmjenični ciklusi visokog i niskog pritiska koji stvaraju kompresiju i razrjeđenje. Tokom tih naizmjeničnih ciklusa visokog i niskog pritiska stvaraju se mali vakuumski mjehurići koji rastu tokom nekoliko ciklusa pritiska. U trenutku kada vakuumski mjehurići ne mogu apsorbovati više energije, silovito kolabiraju. Tokom ove implozije mjehurića lokalno nastaju veoma intenzivni uslovi: visoke temperature do 5000K, pritisci do 2000atm, veoma velike brzine zagrijavanja/hlađenja i razlike pritisaka. Pošto je dinamika kolapsa mjehurića brža od prijenosa mase i toplote, energija u kolabirajućoj šupljini zadržava se u veoma maloj zoni, koja se naziva i „vruća tačka“. Implozija kavitacijskog mjehurića rezultira i mikroturbulencijama, mlazevima tečnosti brzine do 280m/s i posljedičnim smičnim silama. Ova pojava poznata je kao ultrazvučna ili akustična kavitacija.
Kapljice i čestice u sonicirenoj tečnosti izložene su djelovanju tih kavitacijskih sila, a kada se ubrzane čestice međusobno sudare, razbijaju se međučestičnim sudarom. Akustična kavitacija je princip rada ultrazvučnog mljevenja, dispergiranja, emulgiranja i sonohemije.
Pri deacetilaciji hitina ultrazvuk visokog intenziteta povećava površinu aktiviranjem površine i potiče prijenos mase između čestica i reagensa.

Hitozan

Hitozan je modifikovani, katjonski, netoksični ugljikohidratni polimer složene hemijske strukture koju kao glavnu komponentu (>80%) čine β-(1,4) jedinice glukozamina i N-acetilglukozamina (<20%), nasumično raspoređene duž lanca. Hitozan se dobija iz hitina hemijskom ili enzimskom deacetilacijom. Stepen deacetilacije (DA) određuje sadržaj slobodnih amino grupa u strukturi i koristi se za razlikovanje hitina i hitozana. Hitozan pokazuje dobru rastvorljivost u umjerenim rastvaračima kao što je razrijeđena sirćetna kiselina i nudi nekoliko slobodnih aminskih grupa kao aktivnih mjesta. Zbog toga je hitozan u mnogim hemijskim reakcijama povoljniji od hitina.
Hitozan je cijenjen zbog izvrsne biokompatibilnosti i biorazgradivosti, netoksičnosti, dobre antimikrobne aktivnosti (protiv bakterija i gljivica), nepropusnosti za kisik i svojstava stvaranja filma. Za razliku od hitina, hitozan ima prednost da je rastvorljiv u vodi, pa se lakše rukuje njime i koristi u formulacijama.
Budući da je drugi najzastupljeniji polisaharid nakon celuloze, velika zastupljenost hitina čini ga jeftinom i održivom sirovinom.

Proizvodnja hitozana

Hitozan se proizvodi u procesu od dva koraka. U prvom koraku sirovina, kao što su oklopi rakova (npr. škampi, rakovi, jastozi), deproteinizira se, demineralizira i prečišćava kako bi se dobio hitin. U drugom koraku hitin se tretira jakom bazom (npr. NaOH) radi uklanjanja acetilnih bočnih lanaca kako bi se dobio hitozan. Poznato je da je proces konvencionalne proizvodnje hitozana veoma dugotrajan i skup.

Hitin

Hitin (C₈H₁₃O₅N)_n je linearni polimer β-1,4-N-acetilglukozamina i klasifikuje se na α-, β- i γ-hitin. Kao derivat glukoze, hitin je glavna komponenta egzoskeleta artropoda, kao što su rakovi i insekti, radula mekušaca, kljunova glavonožaca te ljusaka riba i lisamfibija, a može se naći i u ćelijskim zidovima gljivica. Struktura hitina uporediva je s celulozom, pri čemu stvara kristalne nanofibrile ili viskere. Celuloza je najzastupljeniji polisaharid na svijetu, a slijedi je hitin kao drugi najzastupljeniji polisaharid.

Glukozamin

Glukozamin (C₆H₁₃NO₅) je aminošećer i važan prekursor u biohemijskoj sintezi glikoziliranih proteina i lipida. Glukozamin je prirodno obilno prisutno jedinjenje koje je dio strukture oba polisaharida, hitozana i hitina, zbog čega je glukozamin jedan od najzastupljenijih monosaharida. Većina komercijalno dostupnog glukozamina proizvodi se hidrolizom egzoskeleta rakova, tj. oklopa rakova i jastoga.
Glukozamin se uglavnom koristi kao dodatak prehrani, i to u obliku glukozamin-sulfata, glukozamin-hidrohlorida ili N-acetilglukozamina. Dodaci prehrani s glukozamin-sulfatom primjenjuju se oralno za liječenje bolnog stanja uzrokovanog upalom, razgradnjom i konačnim gubitkom hrskavice (osteoartritis).