Proizvodnja hitina i hitozana iz gljiva

Ultrazvuk je visoko efikasna metoda za oslobađanje hitina i hitozana iz gljivičnih izvora kao što su gljive. Hitin i hitozan moraju biti depolimerizirani i deacetilirani u daljnjoj preradi kako bi se dobio biopolimer visokog kvaliteta. Ultrazvučno potpomognuta depolimerizacija i deacetilacija je vrlo efikasna, jednostavna i brza tehnika, koja rezultira visokokvalitetnim hitozanima visoke molekularne težine i superiorne bioraspoloživosti.

Hitin i hitozan dobijeni iz gljiva putem ultrazvuka

Jestive i ljekovite gljive kao što su Lentinus edodes (shiitake), Ganoderma lucidum (Lingzhi ili reishi), Inonotus obliquus (chaga), Agaricus bisporus (šampinjoni), Hericium erinaceus (lavlja griva), Cordyceps sinensis (gusjenica griva folija) kokoš od drveta), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, puran rep) i mnoge druge vrste gljiva se široko koriste kao hrana i za ekstrakciju bioaktivnih jedinjenja. Ove gljive, kao i ostaci prerade (otpad gljiva) mogu se koristiti za proizvodnju hitozana. Ultrazvučna obrada ne samo da potiče oslobađanje hitina iz strukture ćelijskog zida gljivice, već također pokreće pretvaranje hitina u vrijedan hitozan putem depolimerizacije i deacetilacije potpomognute ultrazvukom.

Depolimerizacija i deacetilacija hitina u hitozan se promoviše ultrazvukom

Intenzivna ultrazvučna obrada pomoću ultrazvučnog sistema sonde je tehnika koja se koristi za promicanje depolimerizacije i deacetilacije hitina, što dovodi do stvaranja hitozana. Hitin je prirodni polisaharid koji se nalazi u egzoskeletima rakova, insekata i ćelijskim zidovima određenih gljiva. Hitozan se dobija iz hitina uklanjanjem acetilnih grupa iz molekula hitina.

Ultrazvučna procedura za gljivičnu konverziju hitina u hitozan

Kada se intenzivna ultrazvučna obrada primjenjuje za proizvodnju hitozana iz hitina, suspenzija hitina se obrađuje ultrazvučnim valovima visokog intenziteta, niske frekvencije, obično u rasponu od 20 kHz do 30 kHz. Proces stvara intenzivnu akustičnu kavitaciju, koja se odnosi na formiranje, rast i kolaps mikroskopskih vakuumskih mjehurića u tekućini. Kavitacija stvara lokalizovane ekstremno velike sile smicanja, visoke temperature (do nekoliko hiljada stepeni Celzijusa) i pritiske (do nekoliko stotina atmosfera) u tečnosti koja okružuje kavitacione mehuriće. Ovi ekstremni uslovi doprinose razgradnji hitin polimera i naknadnoj deacetilaciji.
 

SEM slike hitina i hitozana iz dvije vrste gljiva: a) Hitin iz L. vellereus; b) hitin iz P. ribis; c) Hitozan iz L.vellereus; d) hitozan iz P. ribis.slika i studija: © Erdoğan et al., 2017

Ultrazvučna depolimerizacija hitina

Depolimerizacija hitina se dešava kombinovanim efektima mehaničkih sila, kao što su mikrostrujanje i mlaz tečnosti, kao i ultrazvučno pokrenutim hemijskim reakcijama izazvanim slobodnim radikalima i drugim reaktivnim vrstama koje nastaju tokom kavitacije. Talasi visokog pritiska koji nastaju tokom kavitacije uzrokuju da hitinski lanci budu podvrgnuti naprezanju smicanja, što rezultira cijepanjem polimera na manje fragmente.

Ultrazvučna deacetilacija hitina

Osim depolimerizacije, intenzivna ultrazvučna obrada također potiče deacetilaciju hitina. Deacetilacija uključuje uklanjanje acetilnih grupa iz molekula hitina, što dovodi do stvaranja hitozana. Intenzivna ultrazvučna energija, posebno visoke temperature i pritisci nastali tokom kavitacije, ubrzavaju reakciju deacetilacije. Reaktivni uslovi stvoreni kavitacijom pomažu u razbijanju acetilnih veza u hitinu, što rezultira oslobađanjem octene kiseline i pretvaranjem hitina u hitozan.
Sveukupno, intenzivna ultrazvučna obrada poboljšava i procese depolimerizacije i deacetilacije osiguravajući potrebnu mehaničku i kemijsku energiju za razgradnju hitinskog polimera i olakšavanje konverzije u hitozan. Ova tehnika nudi brzu i efikasnu metodu za proizvodnju hitozana iz hitina, s brojnim primjenama u raznim industrijama, uključujući farmaceutsku, poljoprivrednu i biomedicinsko inženjerstvo.

Industrijska proizvodnja hitozana iz gljiva uz pomoć ultrazvuka

Komercijalna proizvodnja hitina i hitozana uglavnom se zasniva na otpadu morske industrije (npr. ribolov, ulov školjaka itd.). Različiti izvori sirovina rezultiraju različitim kvalitetima hitina i hitozana, što rezultira fluktuacijama u proizvodnji i kvaliteti zbog sezonskih varijacija u ribolovu. Nadalje, hitozan dobijen iz gljivičnih izvora nudi navodno superiorna svojstva poput homogene dužine polimera i veće rastvorljivosti u poređenju sa hitozanom iz morskih izvora. (usp. Ghormade et al., 2017.) Kako bi se obezbijedio uniforman hitozan, ekstrakcija hitina iz gljivičnih vrsta postala je stabilna alternativna proizvodnja. Proizvodnja hitina i citiosana iz gljiva može se lako i pouzdano postići upotrebom ultrazvučne tehnologije ekstrakcije i deacetilacije. Intenzivna sonikacija remeti ćelijske strukture kako bi se oslobodio hitin i promovira prijenos mase u vodenim rastvaračima za superiorne prinose hitina i efikasnost ekstrakcije. Naknadna ultrazvučna deacetilacija pretvara hitin u vrijedan hitozan. I ultrazvučna ekstrakcija hitina i deacetilacija u hitozan mogu se linearno skalirati na bilo koji nivo komercijalne proizvodnje.

Sonikacija intenzivira proizvodnju gljivičnog hitozana i čini proizvodnju efikasnijom i ekonomičnijom.(slika i studija: © Zhu et al., 2019)

Rezultati istraživanja za ultrazvučnu deacetilaciju hitina i hitozana

Zhu et al. (2018) zaključuju u svojoj studiji da se ultrazvučna deacetilacija pokazala kao ključni proboj, pretvarajući β-hitin u hitozan uz 83-94% deacetilacije na smanjenim temperaturama reakcije. Slika lijevo prikazuje SEM sliku ultrazvučno deacetiliranog hitozana (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (slika i studija: © Zhu et al., 2018)
U njihovom protokolu, rastvor NaOH (20 w/v %) pripremljen je otapanjem NaOH pahuljica u DI vodi. Alkalni rastvor je zatim dodat u GLSP sediment (0,5 g) u omjeru čvrsta i tečnost od 1:20 (g: mL) u epruvetu za centrifugiranje. Hitosan je dodat u NaCl (40 mL, 0,2 M) i sirćetnu kiselinu (0,1 M) u volumnom odnosu rastvora 1:1. Suspenzija je zatim podvrgnuta ultrazvuku na blagoj temperaturi od 25°C u trajanju od 60 minuta koristeći ultrasonikator tipa sonde (250W, 20kHz). (usp. Zhu et al., 2018.)
 
Pandit et al. (2021) su otkrili da na brzinu razgradnje za otopine hitozana rijetko utječu koncentracije kiseline koja se koristi za solubilizaciju polimera i u velikoj mjeri ovisi o temperaturi, intenzitetu ultrazvučnih valova i ionskoj snazi medija koji se koristi za otapanje polimera. (up. Pandit et al., 2021.)
 
U drugoj studiji, Zhu et al. (2019) koristili su prahove spora Ganoderma lucidum kao gljivičnu sirovinu i istraživali ultrazvučno potpomognutu deacetilaciju i efekte parametara obrade kao što su vrijeme sonikacije, omjer čvrstoće i tekućine, koncentracija NaOH i snaga zračenja na stupanj deacetilacije (DD) hitozana. Najveća vrijednost DD dobijena je pri sljedećim ultrazvučnim parametrima: 20 min ultrazvučne obrade pri 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Morfologija površine, hemijske grupe, termička stabilnost i kristalnost ultrazvučno dobijenog hitozana ispitani su pomoću SEM, FTIR, TG i XRD. Istraživački tim izvještava o značajnom poboljšanju stepena deacetilacije (DD), dinamičkog viskoziteta ([η]) i molekularne težine (Mv¯) ultrazvučno proizvedenog hitozana. Rezultati su naglasili ultrazvučnu tehniku deacetilacije gljiva kao veoma moćnu metodu proizvodnje hitozana, koja je pogodna za biomedicinske primjene. (usp. Zhu et al., 2019.)

Vrhunski kvalitet hitozana sa ultrazvučnom depolimerizacijom i deacetilacijom

Ultrazvučno vođeni procesi ekstrakcije i depolimerizacije hitina/hitozana su precizno kontrolisani, a ultrazvučni parametri procesa se mogu prilagoditi sirovinama i ciljanom kvalitetu krajnjeg proizvoda (npr. molekulska težina, stepen deacetilacije). Ovo omogućava prilagođavanje ultrazvučnog procesa vanjskim faktorima i postavljanje optimalnih parametara za vrhunski rezultat i efikasnost.
Ultrazvučno deacetilirani hitozan pokazuje odličnu bioraspoloživost i biokompatibilnost. Kada se ultrazvučno pripremljeni biopolimeri hitozana uporede sa termički dobijenim hitozanom u pogledu biomedicinskih svojstava, ultrazvučno proizveden hitozan pokazuje značajno poboljšanu vitalnost fibroblasta (L929 ćelija) i poboljšanu antibakterijsku aktivnost za Escherichia coli (E. coli) i Staphylococcus aureus (S.coli).
(up. Zhu et al., 2018.)
 

Slike skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM) u uvećanju od 100× a) gladius, b) gladius tretiran ultrazvukom, c) β-hitin, d) β-hitin tretiran ultrazvukom, i e) hitosan (izvor: Preto et al. 2017)

Ultrazvučna oprema visokih performansi za obradu hitina i hitozana

Fragmentacija hitina i decetilacija hitina u hitozan zahtijeva moćnu i pouzdanu ultrazvučnu opremu koja može isporučiti visoke amplitude, nudi preciznu kontrolu nad parametrima procesa i može raditi 24/7 pod velikim opterećenjem i u zahtjevnim okruženjima. Hielscher Ultrasonics asortiman proizvoda pouzdano ispunjava ove zahtjeve. Osim izvanrednih ultrazvučnih performansi, Hielscher ultrasonikatori se mogu pohvaliti visokom energetskom učinkovitošću, što je značajna ekonomska prednost – posebno kada se koristi u komercijalnoj proizvodnji velikih razmjera.
Hielscher ultrasonicatori su sistemi visokih performansi koji mogu biti opremljeni dodacima kao što su sonotrode, pojačivači, reaktori ili protočne ćelije kako bi na optimalan način odgovarali vašim potrebama procesa. Sa digitalnim displejom u boji, mogućnošću unapred podešenih izvođenja sonikacije, automatskim snimanjem podataka na integrisanu SD karticu, daljinskom kontrolom pretraživača i mnogim drugim funkcijama, Hielscher ultrasonikatori obezbeđuju najveću kontrolu procesa i jednostavnost za korišćenje. Upareni sa robusnošću i velikim kapacitetom nosivosti, Hielscher ultrazvučni sistemi su vaš pouzdan radni konj u proizvodnji. Fragmentacija i deacetilacija hitina zahtijeva snažan ultrazvuk za postizanje ciljane konverzije i finalnog hitozana visokog kvaliteta. Posebno za fragmentaciju hitinskih pahuljica i korake depolimerizacije/deacetilacije, velike amplitude i povišeni pritisci su ključni. Hielscher Ultrasonics industrijski ultrazvučni procesori lako isporučuju vrlo visoke amplitude. Amplitude do 200 µm mogu se kontinuirano izvoditi u radu 24/7. Za još veće amplitude, dostupne su prilagođene ultrazvučne sonotrode. Kapacitet snage Hielscher ultrazvučnih sistema omogućava efikasnu i brzu depolimerizaciju i deacetilaciju u sigurnom i korisniku prilagođenom procesu.
 

Sinergistički tretman hitinom poboljšan ultrazvukom

Kako bi se prevazišli nedostaci (tj. niska efikasnost, visoka cijena energije, dugo vrijeme obrade, toksični rastvarači) tradicionalne hemijske i enzimske deacelitacije hitina, ultrazvuk visokog intenziteta je integriran u obradu hitina i hitozana. Sonikacija visokog intenziteta i rezultirajući efekti akustične kavitacije dovode do brzog cijepanja polimernih lanaca i smanjuju polidisperznost, čime se promovira sinteza hitozana. Nadalje, ultrazvučne sile smicanja intenziviraju prijenos mase u otopini tako da se pojačavaju kemijska, hidrolitička ili enzimska reakcija. Ultrazvučni tretman hitinom može se kombinovati sa već postojećim tehnikama obrade hitinom kao što su hemijske metode, hidroliza ili enzimske procedure.

Ultrazvučno potpomognuta hemijska deacetilacija i depolimerizacija

Kako je hitin nereaktivan i nerastvorljiv biopolimer, on mora proći procesne korake demineralizacije, deproteinizacije i depolimerizacije/deacetilacije kako bi se dobio topiv i biopristupačan hitozan. Ovi koraci procesa uključuju tretmane jakim kiselinama kao što je HCl i jakim bazama kao što su NaOH i KOH. Kako su ovi konvencionalni procesni koraci neefikasni, spori i zahtijevaju veliku energiju, intenziviranje procesa ultrazvukom značajno poboljšava proizvodnju hitozana. Primjena ultrazvuka povećava prinose i kvalitet hitozana, skraćuje proces sa dana na nekoliko sati, omogućava blaža otapala i čini cijeli proces energetski efikasnijim.

Ultrazvučno poboljšana deproteinizacija hitina

Vallejo-Dominguez et al. (2021) otkrili su u svom istraživanju deproteinizacije hitina da “primjena ultrazvuka za proizvodnju biopolimera smanjila je sadržaj proteina kao i veličinu čestica hitina. Hitozan visokog stepena deacetilacije i srednje molekularne mase proizveden je uz pomoć ultrazvuka.”

Ultrazvučna hidroliza za depolimerizaciju hitina

Za hemijsku hidrolizu, za deacetilaciju hitina koriste se ili kiseline ili alkalije, međutim alkalna deacetilacija (npr. natrijum hidroksid NaOH) se više koristi. Kisela hidroliza je alternativni metod tradicionalnoj hemijskoj deacetilaciji, gde se rastvori organske kiseline koriste za depolimerizaciju hitina i hitozana. Metoda kisele hidrolize se najčešće koristi kada molekulska masa hitina i hitozana mora biti homogena. Ovaj konvencionalni proces hidrolize poznat je kao spor i energetski i troškovno intenzivan. Potreba za jakim kiselinama, visokim temperaturama i pritiscima su faktori koji pretvaraju proces hidrolitičkog hitozana u veoma skupu i dugotrajnu proceduru. Korištene kiseline zahtijevaju nizvodne procese kao što su neutralizacija i odsoljavanje.
Integracijom ultrazvuka velike snage u proces hidrolize, zahtjevi za temperaturom i pritiskom za hidrolitičko cijepanje hitina i hitozana mogu se značajno smanjiti. Nadalje, sonikacija omogućava niže koncentracije kiselina ili korištenje blažih kiselina. Ovo čini proces održivijim, efikasnijim, isplativijim i ekološki prihvatljivijim.

Ultrazvučno potpomognuta hemijska deacetilacija

Hemijska dezintegracija i deakteilacija hitina i hitozana uglavnom se postiže tretiranjem hitina ili hitozana mineralnim kiselinama (npr. hlorovodonična kiselina HCl), natrijum nitritom (NaNO₂), ili vodikov peroksid (H₂O₂). Ultrazvuk poboljšava brzinu deacetilacije i na taj način skraćuje vrijeme reakcije potrebno za postizanje ciljanog stepena deacetilacije. To znači da ultrazvuk smanjuje potrebno vrijeme obrade od 12-24 sata na nekoliko sati. Nadalje, ultrazvuk omogućava znatno niže kemijske koncentracije, na primjer 40% (w/w) natrijum hidroksida pomoću ultrazvuka, dok je 65% (w/w) potrebno bez upotrebe ultrazvuka.

Ultrazvučno-enzimska deacetilacija

Dok je enzimska deacetilacija blag, ekološki benigni oblik obrade, njegova efikasnost i troškovi su neekonomični. Zbog složene, radno intenzivne i skupe nizvodne izolacije i prečišćavanja enzima iz krajnjeg proizvoda, enzimska deacetilacija hitina se ne primjenjuje u komercijalnoj proizvodnji, već se koristi samo u naučnoistraživačkoj laboratoriji.
Ultrazvučni predtretman prije enzimske deacelitacije fragmentira molekule hitina čime se povećava površina i čini više površine dostupnom za enzime. Sonikacija visokih performansi pomaže u poboljšanju enzimske deacetilacije i čini proces ekonomičnijim.