Proizvodnja hitina i hitozana iz gljiva

Ultrazvučna obrada (sonikacija) je vrlo efikasna metoda za oslobađanje hitina i hitozana iz gljivičnih izvora, kao što su gljive. Hitin i hitozan se u daljnjoj obradi moraju depolimerizirati i deacetilirati kako bi se dobio visokokvalitetan biopolimer. Ultrazvučno potpomognuta depolimerizacija i deacetilacija je vrlo djelotvorna, jednostavna i brza tehnika, čiji rezultat su visokokvalitetni hitozani visoke molekulske mase i izvrsne bioraspoloživosti.

Hitin i hitozan iz gljiva putem ultrazvučne obrade

Jestive i ljekovite gljive kao što su Lentinus edodes (šitake), Ganoderma lucidum (lingži ili reiši), Inonotus obliquus (čaga), Agaricus bisporus (šampinjon), Hericium erinaceus (ježasta kovrčasta gljiva, lion's mane), Cordyceps sinensis (gusjeničarska gljiva), Grifola frondosa (hen-of-the-wood), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, turkeytail) i mnoge druge vrste gljiva široko se koriste kao hrana i za ekstrakciju bioaktivnih spojeva. Te gljive, kao i ostaci od prerade (otpad od gljiva), mogu se koristiti za proizvodnju hitozana. Ultrazvučna obrada ne samo da potiče oslobađanje hitina iz strukture ćelijskog zida gljiva, nego i pokreće pretvorbu hitina u vrijedan hitozan putem ultrazvučno potpomognute depolimerizacije i deacetilacije.

Ovaj video demonstrira visokoefikasnu ekstrakciju gljive lavlja griva pomoću ultrazvučnog homogenizatora Hielscher UP200Ht. Ultrazvučna ekstrakcija idealna je tehnika za proizvodnju visokokvalitetnih ekstrakata punog spektra koji sadrže polisaharide poput beta-glukana, kao i hericenone i erinacine.

Intenzivna ultrazvučna obrada pomoću ultrazvučnog sistema sa sondom tehnika je koja se koristi za poticanje depolimerizacije i deacetilacije hitina, što dovodi do nastanka hitozana. Hitin je prirodni polisaharid koji se nalazi u egzoskeletima rakova i insekata te u ćelijskim zidovima određenih gljiva. Hitozan se dobiva iz hitina uklanjanjem acetilnih grupa iz molekule hitina.

Ultrazvučni postupak pretvorbe gljivičnog hitina u hitozan

Kada se intenzivna ultrazvučna obrada primjenjuje za proizvodnju hitozana iz hitina, suspenzija hitina izlaže se ultrazvučnim valovima visokog intenziteta i niske frekvencije, obično u rasponu od 20 kHz do 30 kHz. Proces stvara intenzivnu akustičnu kavitaciju, koja označava nastanak, rast i kolaps mikroskopskih vakuumskih mjehurića u tekućini. Kavitacija stvara lokalizirane izuzetno visoke smične sile, visoke temperature (do nekoliko hiljada stepeni Celzija) i pritiske (do nekoliko stotina atmosfera) u tekućini koja okružuje kavitacijske mjehuriće. Ti ekstremni uslovi doprinose razgradnji polimera hitina i naknadnoj deacetilaciji.

 

Ultrazvučna depolimerizacija hitina

Depolimerizacija hitina odvija se kombiniranim djelovanjem mehaničkih sila, kao što su mikrostrujanje i tekući mlazevi, kao i ultrazvučno pokrenutim hemijskim reakcijama koje izazivaju slobodni radikali i druge reaktivne vrste nastale tokom kavitacije. Visokotlačni valovi koji nastaju tokom kavitacije izlažu lance hitina smičnom naprezanju, što rezultira cijepanjem polimera na manje fragmente.

Ultrazvučna deacetilacija hitina

Pored depolimerizacije, intenzivna ultrazvučna obrada potiče i deacetilaciju hitina. Deacetilacija podrazumijeva uklanjanje acetilnih grupa iz molekule hitina, što dovodi do nastanka hitozana. Intenzivna ultrazvučna energija, posebno visoke temperature i pritisci koji nastaju tokom kavitacije, ubrzava reakciju deacetilacije. Reaktivni uslovi nastali kavitacijom pomažu u razgradnji acetilnih veza u hitinu, što rezultira oslobađanjem octene kiseline i pretvorbom hitina u hitozan.
Sveukupno, intenzivna ultrazvučna obrada poboljšava procese depolimerizacije i deacetilacije tako što osigurava potrebnu mehaničku i hemijsku energiju za razgradnju polimera hitina i olakšava pretvorbu u hitozan. Ova tehnika nudi brzu i efikasnu metodu proizvodnje hitozana iz hitina, s brojnim primjenama u raznim industrijama, uključujući farmaciju, poljoprivredu i biomedicinsko inženjerstvo.

Industrijska proizvodnja hitozana iz gljiva pomoću snažnog ultrazvuka

Komercijalna proizvodnja hitina i hitozana uglavnom se zasniva na otpadu iz morske industrije (tj. ribolova, prikupljanja školjkaša i sl.). Različiti izvori sirovine daju različite kvalitete hitina i hitozana, što dovodi do fluktuacija u proizvodnji i kvalitetu zbog sezonskih varijacija u ribolovu. Nadalje, hitozan dobiven iz gljivičnih izvora navodno ima bolja svojstva, poput homogene dužine polimera i veće rastvorljivosti u poređenju s hitozanom iz morskih izvora. (cf. Ghormade et al., 2017) Kako bi se osigurao ujednačen hitozan, ekstrakcija hitina iz vrsta gljiva postala je stabilna alternativna proizvodnja. Proizvodnja hitina i hitozana iz gljiva može se lako i pouzdano postići primjenom tehnologije ultrazvučne ekstrakcije i deacetilacije. Intenzivna ultrazvučna obrada razgrađuje ćelijske strukture radi oslobađanja hitina i potiče prijenos mase u vodenim otapalima, što daje bolje prinose hitina i efikasnost ekstrakcije. Naknadna ultrazvučna deacetilacija pretvara hitin u vrijedan hitozan. I ultrazvučna ekstrakcija hitina i deacetilacija u hitozan mogu se linearno skalirati na bilo koji komercijalni nivo proizvodnje.

Rezultati istraživanja ultrazvučne deacetilacije hitina i hitozana

Zhu et al. (2018) u svojoj studiji zaključuju da se ultrazvučna deacetilacija pokazala ključnim iskorakom, pretvarajući β-hitin u hitozan s 83–94% deacetilacije pri sniženim reakcijskim temperaturama. Slika lijevo prikazuje SEM snimak ultrazvučno deacetiliranog hitozana (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (slika i studija: © Zhu et al., 2018)
U njihovom protokolu otopina NaOH (20 w/v %) pripremljena je otapanjem pahuljica NaOH u DI vodi. Alkalna otopina je zatim dodana talogu GLSP (0,5 g) u omjeru čvrsto-tekuće 1:20 (g: mL) u epruvetu za centrifugu. Hitozan je dodan u NaCl (40 mL, 0,2 M) i octenu kiselinu (0,1 M) u omjeru volumena otopina 1:1. Suspenzija je zatim izložena ultrazvuku na blagoj temperaturi od 25°C tokom 60 min pomoću ultrazvučnog uređaja sa sondom (250W, 20kHz). (cf Zhu et al., 2018)

Pandit et al. (2021) su utvrdili da na brzinu razgradnje otopina hitozana rijetko utječu koncentracije kiseline korištene za otapanje polimera, a da ona uvelike ovisi o temperaturi, intenzitetu ultrazvučnih valova i ionskoj jakosti medija korištenog za otapanje polimera. (cf. Pandit et al., 2021)

U drugoj studiji Zhu et al. (2019) koristili su prahove spora Ganoderma lucidum kao gljivičnu sirovinu i istraživali ultrazvučno potpomognutu deacetilaciju te utjecaj procesnih parametara, kao što su vrijeme ultrazvučne obrade, omjer čvrste i tekuće faze, koncentracija NaOH i snaga zračenja, na stepen deacetilacije (DD) hitozana. Najveća vrijednost DD dobivena je pri sljedećim ultrazvučnim parametrima: 20 min ultrazvučne obrade pri 80W, 10% (g:ml) NaOH, 1:25 (g:ml). Morfologija površine, hemijske grupe, termička stabilnost i kristalnost ultrazvučno dobivenog hitozana ispitani su pomoću SEM, FTIR, TG i XRD. Istraživački tim izvještava o značajnom poboljšanju stepena deacetilacije (DD), dinamičke viskoznosti ([η]) i molekulske mase (Mv¯) ultrazvučno proizvedenog hitozana. Rezultati su pokazali da je ultrazvučna tehnika deacetilacije gljiva vrlo potentna metoda proizvodnje hitozana, koja je pogodna za biomedicinske primjene. (cf. Zhu et al., 2019)

Vrhunski kvalitet hitozana ultrazvučnom depolimerizacijom i deacetilacijom

Procesi ekstrakcije i depolimerizacije hitina / hitozana pokretani ultrazvukom precizno su kontrolirani, a ultrazvučni procesni parametri mogu se prilagoditi sirovinama i ciljanom kvalitetu krajnjeg proizvoda (npr. molekulska masa, stepen deacetilacije). To omogućava prilagodbu ultrazvučnog procesa vanjskim faktorima i postavljanje optimalnih parametara za vrhunski ishod i efikasnost.
Ultrazvučno deacetilirani hitozan pokazuje odličnu bioraspoloživost i biokompatibilnost. Kada se ultrazvučno pripremljeni biopolimeri hitozana uporede s termički dobivenim hitozanom u pogledu biomedicinskih svojstava, ultrazvučno proizveden hitozan pokazuje značajno poboljšanu vijabilnost fibroblasta (ćelije L929) i pojačanu antibakterijsku aktivnost i prema Escherichia coli (E. coli) i prema Staphylococcus aureus (S. aureus).
(cf. Zhu et al., 2018)

Visokoučinkovita ultrazvučna oprema za preradu hitina i hitozana

Fragmentacija hitina i deacetilacija hitina u hitozan zahtijeva snažnu i pouzdanu ultrazvučnu opremu koja može isporučiti visoke amplitude, nudi preciznu kontrolu nad procesnim parametrima i može raditi 24/7 pod velikim opterećenjem iu zahtjevnim okruženjima. Proizvodni program Hielscher Ultrasonics pouzdano ispunjava te zahtjeve. Pored izvanrednih ultrazvučnih performansi, Hielscher ultrazvučni uređaji odlikuju se visokom energetskom efikasnošću, što je značajna ekonomska prednost – naročito kada se koriste u komercijalnoj proizvodnji velikih razmjera.
Hielscher ultrazvučni uređaji su visokoučinkoviti sistemi koji se mogu opremiti dodacima kao što su sonotrode, booster-i, reaktori ili protočne ćelije kako bi se na optimalan način prilagodili potrebama vašeg procesa. Uz digitalni kolor displej, mogućnost unaprijed podešenih ciklusa ultrazvučne obrade, automatsko bilježenje podataka na integriranu SD karticu, daljinsko upravljanje putem preglednika i mnoge druge funkcije, Hielscher ultrazvučni uređaji osiguravaju najviši nivo kontrole procesa i jednostavnost korištenja. U kombinaciji s robusnošću i velikim kapacitetom opterećenja, Hielscher ultrazvučni sistemi su vaš pouzdani radni konj u proizvodnji. Fragmentacija i deacetilacija hitina zahtijevaju snažan ultrazvuk kako bi se postigla ciljana pretvorba i konačni proizvod hitozana visokog kvaliteta. Posebno za fragmentaciju pahuljica hitina te korake depolimerizacije / deacetilacije presudne su visoke amplitude i povišeni pritisci. Hielscher Ultrasonics industrijski ultrazvučni procesori s lakoćom isporučuju vrlo visoke amplitude. Amplitude do 200µm mogu se kontinuirano održavati u radu 24/7. Za još više amplitude dostupne su prilagođene ultrazvučne sonotrode. Snaga Hielscher ultrazvučnih sistema omogućava efikasnu i brzu depolimerizaciju i deacetilaciju u sigurnom procesu prilagođenom korisniku.

Tabela u nastavku daje okvirnu informaciju o približnom kapacitetu obrade naših ultrazvučnih uređaja:

---

---

Sinergijska obrada hitina poboljšana ultrazvučnom obradom

Kako bi se prevladali nedostaci (tj. niska efikasnost, visoki troškovi energije, dugo vrijeme obrade, toksična otapala) tradicionalne hemijske i enzimske deacetilacije hitina, ultrazvuk visokog intenziteta integriran je u preradu hitina i hitozana. Ultrazvučna obrada visokog intenziteta i posljedični efekti akustične kavitacije dovode do brzog cijepanja polimernih lanaca i smanjuju polidisperznost, čime potiču sintezu hitozana. Nadalje, ultrazvučne smične sile intenziviraju prijenos mase u otopini, tako da se hemijske, hidrolitičke ili enzimske reakcije pojačavaju. Ultrazvučna obrada hitina može se kombinirati s već postojećim tehnikama prerade hitina, kao što su hemijske metode, hidroliza ili enzimski postupci.

Ultrazvučno potpomognuta hemijska deacetilacija i depolimerizacija

Budući da je hitin nereaktivan i netopiv biopolimer, mora proći korake procesa demineralizacije, deproteinizacije i depolimerizacije / deacetilacije kako bi se dobio topiv i bioraspoloživ hitozan. Ovi koraci procesa uključuju tretmane jakim kiselinama kao što je HCl i jakim bazama kao što su NaOH i KOH. Pošto su ovi konvencionalni koraci procesa neefikasni, spori i zahtijevaju velike količine energije, intenzifikacija procesa ultrazvučnom obradom značajno poboljšava proizvodnju hitozana. Primjena snažnog ultrazvuka povećava prinose i kvalitet hitozana, skraćuje proces s nekoliko dana na nekoliko sati, omogućava blaža otapala i čini cijeli proces energetski efikasnijim.

Ultrazvučno poboljšana deproteinizacija hitina

Vallejo-Dominguez et al. (2021) su u svom istraživanju deproteinizacije hitina utvrdili da je “primjena ultrazvuka za proizvodnju biopolimera smanjila sadržaj proteina kao i veličinu čestica hitina. Hitozan visokog stepena deacetilacije i srednje molekulske mase proizveden je uz pomoć ultrazvuka.”

Ultrazvučna hidroliza za depolimerizaciju hitina

Za hemijsku hidrolizu koriste se ili kiseline ili lužine za deacetilaciju hitina, međutim, češće se koristi alkalna deacetilacija (npr. natrijum hidroksid NaOH). Kisela hidroliza je alternativna metoda tradicionalnoj hemijskoj deacetilaciji, pri kojoj se otopine organskih kiselina koriste za depolimerizaciju hitina i hitozana. Metoda kisele hidrolize najčešće se koristi kada molekulska masa hitina i hitozana mora biti homogena. Ovaj konvencionalni proces hidrolize poznat je kao spor i intenzivan u pogledu energije i troškova. Potreba za jakim kiselinama, visokim temperaturama i pritiscima su faktori koji hidrolitički proces proizvodnje hitozana čine vrlo skupim i dugotrajnim postupkom. Korištene kiseline zahtijevaju daljnje procese kao što su neutralizacija i odsoljavanje.
Integracijom snažnog ultrazvuka u proces hidrolize, zahtjevi za temperaturom i pritiskom za hidrolitičko cijepanje hitina i hitozana mogu se značajno sniziti. Nadalje, ultrazvučna obrada omogućava niže koncentracije kiselina ili upotrebu blažih kiselina. Time proces postaje održiviji, efikasniji, isplativiji i ekološki prihvatljiviji.

Ultrazvučno potpomognuta hemijska deacetilacija

Hemijska dezintegracija i deacetilacija hitina i hitozana uglavnom se postiže tretiranjem hitina ili hitozana mineralnim kiselinama (npr. hlorovodoničnom kiselinom HCl), natrijum nitritom (NaNO₂), ili vodikovim peroksidom (H₂O₂). Ultrazvuk poboljšava brzinu deacetilacije, čime se skraćuje reakcijsko vrijeme potrebno za postizanje ciljanog stepena deacetilacije. To znači da ultrazvučna obrada skraćuje potrebno vrijeme obrade s 12-24 sata na nekoliko sati. Nadalje, ultrazvučna obrada omogućava znatno niže koncentracije hemikalija, na primjer 40% (w/w) natrijum hidroksida uz ultrazvučnu obradu, dok je bez primjene ultrazvuka potrebno 65% (w/w).

Ultrazvučno-enzimska deacetilacija

Iako je enzimska deacetilacija blag, ekološki neškodljiv oblik obrade, njena efikasnost i troškovi su neekonomični. Zbog složene, radno intenzivne i skupe daljnje izolacije i prečišćavanja enzima iz krajnjeg proizvoda, enzimska deacetilacija hitina ne primjenjuje se u komercijalnoj proizvodnji, nego se koristi samo u naučnim istraživačkim laboratorijama.
Ultrazvučni predtretman prije enzimske deacetilacije fragmentira molekule hitina, čime se povećava površina i omogućava da veća površina bude dostupna enzimima. Visokoučinkovita ultrazvučna obrada pomaže u poboljšanju enzimske deacetilacije i čini proces ekonomičnijim.