Genetska transformacija biljnih ćelija primjenom ultrazvuka

Transformacija posredovana bakterijom Agrobacterium uz podršku ultrazvučne obrade (SAAT) efikasna je metoda inficiranja biljnih ćelija stranim genima uz Agrobacterium kao prijenosnik. Ultrazvučna kavitacija uzrokuje sonoporaciju, koja se može opisati kao ciljano mikroranjavanje biljnog tkiva. Preko ovih ultrazvučno stvorenih mikrorana DNK i DNK vektori mogu se efikasno prenijeti u ćelijski matriks.

Sonoporacija – ultrazvučno pojačana transformacija ćelija

Kada se niskofrekventni ultrazvuk (oko 20kHz) primijeni na ćelijske suspenzije, efekti akustične kavitacije uzrokuju prolaznu permeabilizaciju membrane na ćelijskim tkivima. Ovaj ultrazvučni efekt poznat je kao sonoporacija i koristi se za prijenos gena u ćelije ili tkiva.
Prednosti ultrazvučne obrade temelje se na njenom netermičkom mehaničkom principu rada, zbog čega je sonikacija često svestranija i manje ovisna o vrsti ćelija. Svestrana primjena sonoporacije otvara mogućnost korištenja transgenih biljaka, koje imaju značajan potencijal u bioprodukciji složenih ljudskih terapijskih proteina. Takvi biljni bioreaktori mogu se lako genetski manipulirati, sprječavaju potencijalnu kontaminaciju ljudskim patogenima, ne oštećuju bakterije koje posreduju u transformaciji (npr. Agrobacterium) te su jeftina i efikasna metoda biosinteze.

Ultrazvučno potpomognuta transformacija ćelija

Ultrazvučna obrada (sonikacija) je tehnika koja primjenjuje niskofrekventne ultrazvučne valove za miješanje čestica u otopini i miješanje otopina, čime se povećava brzina prijenosa mase i otapanja. Istovremeno, sonikacija može ukloniti otopljene plinove iz tečnosti. Pri transformaciji biljaka sonikacija uzrokuje nastanak mikrorana na biljnom tkivu i pospješuje unos gole DNK u biljni protoplast.

Za genetsku transformaciju, transformacija posredovana bakterijom Agrobacterium uz podršku sonikacije (SAAT) je preferirana metoda i ima znatno veću efikasnost od sonikacije koja se koristi za direktan prijenos gole DNK i DNK vektora u protoplast. Brojne studije pokazale su da se transformacija posredovana bakterijom Agrobacterium uz podršku sonikacije (SAAT) može koristiti za izazivanje mehaničkog razaranja i nastanka rana na biljnim ćelijama djelovanjem ultrazvučnih valova i rezultirajuće akustične kavitacije. Kratka ultrazvučna obrada stvara mikrorane na površini eksplantata. Ranjene ćelije omogućavaju prodiranje bakterije Agrobacterium u dublje dijelove biljnih tkiva, čime se povećava vjerovatnoća da će biljne ćelije biti inficirane. Osim toga, izlučena fenolna jedinjenja pospješuju transformaciju. Ultrazvučno stvorene mikrorane također olakšavaju prodiranje bakterija u eksplantat. SAAT je uspješno korišten za genetsku transformaciju kod biljnih vrsta koje se smatraju posebno otpornim na Agrobacterium.
Velike prednosti metode SAAT jesu to što je veoma jednostavna i jeftina te što značajno pojačava prijenos gena posredovan bakterijom Agrobacterium. Osim uspješne primjene metode SAAT u transformaciji vrsta Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L., ovaj pristup primijenjen je i u proizvodnji rekombinantnog divljeg tipa holotoksina Escherichia coli osjetljivog na toplotu te mutantnih adjuvansa vakcine LT iz bakterije Escherichia coli u biljci Nicotiana tabacum, pri čemu su najviši sistemski titri IgG specifičnih za LT-B otkriveni kod ptica.
(usp. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka i R. Baranski, 2014)

Opći postupak prijenosa gena putem sonoporacije u biljnim ćelijama

1. Priprema genetskog materijala: Počnite pripremom genetskog materijala koji želite unijeti u biljne ćelije. To može biti plazmidna DNK, RNK ili druge nukleinske kiseline.
2. Izolacija biljnih ćelija: Izolirajte biljne ćelije koje želite ciljati. Ovisno o vašem eksperimentu, te ćelije mogu biti izolirane iz biljnih tkiva ili kultura.
3. Ćelijska suspenzija: Suspendirajte biljne ćelije u odgovarajućem mediju ili puferu. To je neophodno kako bi se osiguralo da su ćelije zdrave i u stanju pogodnom za unos gena.
4. Podešavanje sonikatora: Pripremite sonikator sa sondom tako što ćete unaprijed podesiti parametre sonikacije kao što su amplituda, vrijeme, energija i temperatura. Uronite ultrazvučnu sondu u ćelijsku suspenziju.
5. Sonikacija: Pokrenite postupak sonikacije. Brzo oscilovanje vrha sonde stvara kavitacijske mjehuriće u tečnosti. Ovi mjehurići se šire i kolabiraju pod djelovanjem ultrazvučnih valova, stvarajući mehaničke sile i mikrostrujanje u suspenziji.
6. Sonoporacija: Mehaničke sile i mikrostrujanje nastali kavitacijom privremeno stvaraju pore i otvore u membranama biljnih ćelija. Genetski materijal prisutan u suspenziji može ući u biljne ćelije kroz te pore.
7. Inkubacija: Nakon sonoporacije inkubirajte biljne ćelije kako bi se oporavile i stabilizirale svoje membrane. Ovo je ključan korak za osiguravanje preživljavanja ćelija i uspješnog prijenosa gena.

Prijenos gena putem bakterije Agrobacterium ili liposoma

Postoje dva uobičajena načina transfekcije biljnih ćelija. Koriste ili agrobakterije, rod gram-negativnih bakterija, ili liposome kao nosioce genetskog materijala.

• Sonoporacija posredovana bakterijom Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens je bakterija koja se uobičajeno koristi u genetskom inženjerstvu biljaka. U ovoj metodi plazmidna DNK koja sadrži željeni gen unosi se u Agrobacterium, koji se zatim miješa s biljnim ćelijama. Ćelijska suspenzija podvrgava se sonoporaciji pomoću sonikatora sa sondom. Ultrazvučna energija pospješuje prijenos genetskog materijala iz bakterije Agrobacterium u biljne ćelije. Ova se metoda široko koristi za genetsku modifikaciju biljaka.
• Sonoporacija posredovana liposomima: Liposomi su vezikule na bazi lipida koje mogu nositi genetski materijal. U ovoj metodi liposomi napunjeni plazmidnom DNK ili drugim nukleinskim kiselinama miješaju se s biljnim ćelijama. Sonoporacija pomoću sonikatora sa sondom koristi se da bi se olakšao unos liposoma u biljne ćelije. Ultrazvuk razara lipidne dvoslojeve liposoma, oslobađajući genetski materijal u biljne ćelije. Ovaj pristup je koristan za studije prolazne ekspresije gena u biljnim ćelijama.

Naučno dokazane prednosti transformacije posredovane bakterijom Agrobacterium uz podršku sonikacije (SAAT)

Transformacija posredovana bakterijom Agrobacterium uz podršku sonikacije (SAAT) primijenjena je na brojnim biljnim vrstama. Kratka i relativno blaga ultrazvučna obrada kultura biljnih ćelija uzrokuje sonoporaciju, koja potom omogućava duboko prodiranje bakterije Agrobacterium kao prijenosnika gena. U nastavku možete pročitati primjere studija koje pokazuju povoljne efekte metode SAAT.

Ultrazvučno potpomognuta transformacija biljke ašvaganda

Kako bi poboljšali efikasnost transformacije kod vrste W. somnifera (poznate kao ašvaganda ili zimska trešnja), Dehdashti i saradnici (2016) istražili su primjenu acetosiringona (AS) i sonikacije.
Acetosiringon (AS) dodavan je u tri faze: tečna kultura bakterije Agrobacterium, infekcija bakterijom Agrobacterium i zajednička kultura eksplantata s bakterijom Agrobacterium. Utvrđeno je da je dodatak 75 μM AS u tečnu kulturu bakterije Agrobacterium optimalan za indukciju vir gena.
Dodatna primjena sonikacije (SAAT) rezultirala je najvišom ekspresijom gena. Ekspresija gena gusA u kosmatim korijenima bila je najbolja kada su listovi i vrhovi izdanaka sonicirani 10 odnosno 20s. Efikasnost transformacije poboljšanog protokola iznosila je 66,5 i 59,5% kod eksplantata lista, odnosno vrha izdanka. U poređenju s drugim protokolima, efikasnost transformacije ovog poboljšanog protokola bila je 2,5 puta veća kod listova i 3,7 puta veća kod vrhova izdanaka. Southern blot analize potvrdile su 1–2 kopije transgena gusA u linijama W1-W4, dok je 1–4 kopije transgena otkriveno u liniji W5 dobijenoj poboljšanim protokolom.

Učinak trajanja transformacije posredovane bakterijom Agrobacterium uz podršku sonikacije (SAAT) na učestalost transformacije eksplantata lista (a) i vrha izdanka (b) vrste W. somnifera
(studija i grafikon: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvučno potpomognuta transformacija pamuka

Hussain et al. (2007) pokazuju povoljne efekte transformacije pamuka uz podršku sonikacije. Akustična kavitacija uzrokovana niskofrekventnim ultrazvukom stvara mikrorane na površini i ispod površine biljnog tkiva (sonoporacija) i omogućava bakteriji Agrobacterium da putuje dublje i potpuno kroz biljno tkivo. Ovakav način ranjavanja povećava vjerovatnoću inficiranja biljnih ćelija koje leže dublje u tkivu. Kako bi se procijenila efikasnost transformacije metodom SAAT, mjerena je ekspresija gena GUS. GUS reporterski sistem je sistem reporterskih gena, posebno koristan u molekularnoj biologiji biljaka i mikrobiologiji. Prilagođavanjem različitih parametara SAAT-a, prolazna ekspresija GUS-a kod pamuka uz korištenje zrelih embrija kao eksplantata bila je znatno pojačana. GUS je prvi put otkriven 24h nakon inkubacije eksplantata, a do 48h ekspresija GUS-a bila je veoma intenzivna, što je poslužilo kao koristan pokazatelj uspješne transformacije eksplantata pamuka nakon transformacije posredovane bakterijom Agrobacterium uz podršku sonikacije (SAAT). U poređenju različitih tehnika transformacije (naime biolistike, Agro, BAAT, SAAT), transformacija posredovana bakterijom Agrobacterium uz podršku sonikacije (SAAT) pokazala je daleko najbolje rezultate transformacije.

Izbor postupka transformacije na osnovu prolazne ekspresije GUS-a. Transformacija posredovana bakterijom Agrobacterium uz podršku sonikacije (SAAT) pokazuje znatno višu prolaznu ekspresiju.
(studija i grafikon: © Hussain et al., 2007)

Visokoučinkovita ultrazvučna rješenja za sonoporaciju i SAAT

Hielscher Ultrasonics ima dugogodišnje iskustvo u razvoju i proizvodnji visokoučinkovitih ultrazvučnih uređaja za laboratorije, istraživačke ustanove, kao i za industrijsku proizvodnju s veoma visokim protokom. Za mikrobiologiju i nauke o životu Hielscher nudi različita rješenja koja odgovaraju raznolikim zahtjevima specifičnih tkiva i njihovih obrada. Za istovremenu ultrazvučnu obradu većeg broja uzoraka Hielscher nudi UIP400MTP za višejažične ploče, VialTweeter za sonikaciju do 10 epruveta (npr. Eppendorf epruvete) ili ultrazvučni CupHorn. Ultrazvučni uređaji sa sondom dostupni su od 50 do 400 watta kao laboratorijski homogenizatori, dok industrijski sistemi pokrivaju raspon snage od 500 watta do 16kW.
Obratite nam se i recite nam više o svojoj primjeni i zahtjevima procesa. Naše iskusno osoblje rado će vam preporučiti najprikladniji ultrazvučni uređaj za vaš biološki proces.
Tabela u nastavku daje vam orijentaciju o približnom procesnom kapacitetu naših ultrazvučnih uređaja: