Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) je efikasna metoda za zarazu biljnih ćelija stranim genima koristeći Agrobacterium kao transporter. Ultrazvučna kavitacija uzrokuje sonoporaciju, koja se može opisati kao ciljano mikro-ranjavanje biljnog tkivo. Preko ovih ultrazvučno stvara mikro-rane, DNK i DNK vektori mogu se efikasno transportirati u ćelijsku matricu.

Sonoporacija – Ultrazvučno poboljšana transformacija ćelija

Kada se ultrazvuk niske frekvencije (cca. 20kHz) nanese na ćelijske suspenzije, efekti akustičke kavitacije uzrokuju prolaznu membransku permeabilizaciju na ćelijska tkiva. Ovaj ultrazvučni efekat je poznat kao sonoporacija i koristi se za prenos gena u ćelije ili tkivo.
Prednosti ultrasonication su zasnovane na njegovom ne-termalnom mehaničkom principu rada, što čini sonikaciju često svestranom i manje zavisnom od tipova ćelija. Svestrana primjena sonoporacije otvara mogućnost za iskorišćenje transgenih biljaka, koje imaju značajan potencijal u bioprodukciji složenih ljudskih terapeutskih proteina. Takvi bioreaktori na bazi biljaka mogu se lako genetski manipulirati, spriječiti potencijalnu kontaminaciju ljudskim patogenima, ne oštećuju transformaciju posredujućih bakterija (npr. Agrobacterium), te su jeftina, učinljiva metoda bio-sinteze.

Ultrazvučno-asistirana transformacija ćelija

Sonication je tehnika koja primjenjuje ultrazvučne talase niske frekvencije za agitaciju čestica u rastvoru, za miješanje rješenja, i time povećava brzinu prijenosa mase i rastvaranja. Istovremeno, sonikacija može ukloniti otošene gasove iz tečnosti. U biljno-transformaciji, sonikacija će izazvati formiranje mikro-lova na biljnom tkivu i pojačati isporuku gole DNK u biljni protoplast.

Za genetičku transformaciju, Transformacija posredovana Sonication-Assisted Agrobacterium (SAAT) je preferirana metoda i ima znatno veću efikasnost od sonikacije koja se koristi za prijenos golih DNK i DNK vektora direktno u protoplast. Brojne studije su pokazale da sonication asisted Agrobacterium-posredovan transformacija (SAAT) može koristiti za izazivanje mehaničkih poremećaja i formiranje rana na biljnim ćelijama ultrazvučnim valovima i rezultirajući akustička kavitacija. Kratki ultrazvučni tretman stvara mikro rane na površini objašnjenja. Kako će ranjene ćelije omogućiti prodiranje Agrobacteriuma u dublji dio biljnih tkiva, povećavajući tako i moguænost zaraze biljnih ćelija. Osim toga, izlučiva fenolički spojovi pojačava transformaciju. Ultrazvučno generirane mikro rane čine eksplantnu penetraciju bakterijama također izvodljivije. SAAT je uspješno korišten za genetičku transformaciju kod biljnih vrsta koje se posebno smatraju otpornim na Agrobacterium.
To što je vrlo jednostavna i jeftina metoda, kao i značajno poboljšanje transfera gena posredovanog agrobakterijom su glavne prednosti SAAT-a. Osim uspješne primjene SAAT-a u transformaciji Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L., ovaj pristup je primijenjen i u proizvodnji rekombinantnih escherichia coli divljeg tipa toplotno-labilan holotoksina i escherichia coli mutant LT cjepiva adjuvanti u Nicotiana tabacum, u kojima su kod ptica otkriveni najviši sistemski IgG titri specifični za LT-B.
(usp. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka i R. Baranski, 2014)

Opća procedura za prijenos gena putem sonoporacije u biljnim ćelijama

1. Priprema genetičkog materijala: Počnite sa pripremanjem genetskog materijala koji želite da unesete u biljne ćelije. To može biti plazmidna DNK, RNK ili druge nukleinske kiseline.
2. Izolacija biljnih ćelija: Izolirajte biljne ćelije koje želite ciljati. U zavisnosti od vašeg eksperimenta, ove ćelije mogu biti izolovane iz biljnih tkiva ili kultura.
3. Suspenzija ćelije: Obustavite biljne ćelije u odgovarajućem mediju ili baferu. Ovo je od suštinskog značaja kako bi se osiguralo da su ćelije zdrave i u stanju pogodnom za unos gena.
4. Podesite vaš Sonicator: Pripremite sondni sondni sondni unapred podešeni parametri kao što su amplituda, vreme, energija i temperatura. Uronite ultrazvučnu sondu u ćelijsku suspenziju.
5. sonication: Započnite proceduru sonicacije. Brza oscilacija vrha sonde stvara mjehuriće kavitacije u tekućini. Ovi mehurići se šire i urušavaju zbog ultrazvučnih talasa, stvarajući mehaničke sile i mikrostriming u vešanju.
6. Sonoporation: Mehaničke sile i mikrostrujanje nastali kavitacijom stvaraju privremeno pore i rupe u membranama biljnih ćelija. Genetički materijal prisutan u suspenziji može ući u biljne ćelije kroz ove pore.
7. Inkubacija: Nakon tretmana sonoporacije, inkubirajte biljne ćelije kako bi im se omogućilo da se oporave i stabilizuju svoje membrane. Ovo je ključni korak za osiguravanje preživljavanja ćelija i uspješnog transfera gena.

Transfer gena putem agrobakterija ili liposoma

Postoje dva uobičajena oblika za transfekciju biljnih ćelija. Oni koriste ili agrobacterium, rod Gram-negativnih bakterija, ili liposomi kao nosioci genetičkog materijala.

• Agrobacterium-posredovana sonoporacija: Agrobacterium tumefaciens je bakterija koja se obično koristi u biljnom genetičkom inženjerstvu. U ovoj metodi, plazmidna DNK koja sadrži željeni gen se uvodi u Agrobacterium, koji se zatim miješa sa biljnim ćelijama. Ćelijska suspenzija je podvrgnuta sonoporaciji pomoću sondinog sonatora. Ultrazvučna energija poboljšava prenos genetskog materijala iz Agrobacterium u biljne ćelije. Ova metoda se široko koristi za genetičku modifikaciju biljaka.
• Liposom-posredovana sonoporacija: Liposomi su vezikule na bazi lipida koje mogu nositi genetički materijal. U ovoj metodi, liposomi napunjeni plazmidnom DNK ili drugim nukleinskim kiselinama se miješaju sa biljnim ćelijama. Sonoporacija pomoću sondnog sonatora koristi se za olakšavanje uzimanja liposoma u biljnim ćelijama. Ultrazvuk remeti lipidne dvoslojeve liposoma, oslobađajući genetski materijal u biljne ćelije. Ovaj pristup je koristan za prolazne studije ekspresije gena u biljnim ćelijama.

Naučno dokazane prednosti sonication-assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) primijenjen je na brojne biljne vrste. Kratko i relativno blago ultrazvučno liječenje kultura biljnih ćelija uzrokuje sonoporaciju, što nakon toga omogućava dubok prodor Agrobacteriuma kao genskog transportera. U nastavku možete pročitati uzorne studije koje pokazuju blagotvornog efekta SAAT-a.

Ultrazvučno-asistirana transformacija Ashwagandha

Kako bi se poboljšala efikasnost transformacije u W. somnifera (poznata kao ashwagandha ili zimska trešnja), Dehdashti i kolege (2016) istraživali su upotrebu acetosiringona (AS) i sonication.
Acetosyringone (AS) je dodat u tri faze: Agrobacterium tečni kultura, Agrobacterium infekcija i ko-kultura objašnjenja sa Agrobacterium. Za dodavanje 75 μM AS u agrobakterijsku tekuću kulturu je pronađeno da je optimalno za indukciju vir gena.
Dodatna primjena sonikacije (SAAT) rezultirala je najvišim genom ekspresije. Izraz gusA gena u dlakavim korijenima je bio najbolji kada su savjeti za lišće i snimanje sonicirani za 10 odnosno 20-ih godina. Efikasnost transformacije poboljšanog protokola zabilježena je 66,5 odnosno 59,5% u slučaju objašnjenja za list i pucanje savjeta. Kada se uporedi sa drugim protokolima, za efikasnost transformacije ovog poboljšanog protokola je bilo 2,5 puta više za lišće i 3,7 puta više za vrhove pucanja. Analize južnih blotova su potvrdile 1–2 kopije gusA transgena u linijama W1-W4, dok su 1-4 transgene kopije otkrivene u liniji W5 koju je generirao poboljšani protokol.

Efekt trajanja sonication-assisted Agrobacterium- posredovane transformacije (SAAT) na transformacijsku frekvenciju W. somnifera list (a) i pucati vrh (b) objašnjenja
(studija i grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvučno-asistirana transformacija pamuka

Hussain et al. (2007) pokazuju blagotvornog efekta transformacije pamuka uz pomoć sonicationa. Akustična kavitacija uzrokovana ultrazvukom niske frekvencije stvara mikro-rane na i ispod površine biljnog tkivo (sonoporacija) i omogućava Agrobacteriumu da putuje dublje i potpuno u cijelom biljnom tkivu. Ova moda ranjavanja povećava vjerojatnost zaraze biljnih ćelija koje su dublje u tkivu. Da bi se ocijenila efikasnost transformacije SAAT-a, izmjerena je gus ekspresija gena. Gus reporterski sistem je genski sistem reportera, posebno koristan u molekularnoj biologiji biljaka i mikrobiologiji. Podešavanje raznih SAAT parametara, GUS prolazan izraz u pamuk koristeći zrele embrione kao objašnjenje je značajno poboljšan. GUS je prvi put otkriven 24h nakon inkubacije objašnjenja i do 48h, GUS izraz je bio vrlo intezivan što je poslužilo kao koristan pokazatelj uspješne transformacije pamuk objašnjenja nakon sonication pomogla Agrobacterium posredovane transformacije (SAAT). Poređenje različitih tehnika transformacije (i to biolistika, Agro, BAAT, SAAT), transformacija posredovana u sonicijama (SAAT) pokazala je daleko najbolje rezultate transformacije.

Izbor postupka transformacije na osnovu prolazne ekspresije GUS-a. Sonication-assisted Agrobacterium-posredovane transformacije (SAAT) pokazuje znatno veći prolazni izraz.
(studija i grafika: © Hussain et al., 2007)

Ultrazvučna rješenja visokih performansi za sonoporaciju i SAAT

Hielscher Ultrasonics je dugo vremena iskusna u razvoju i proizvodnji ultrazvučnikatora visokih performansi za laboratorije, istraživačkih objekata kao i industrijske proizvodnje sa vrlo visokim ulazima. Za mikrobiologiju i nauku o životu, Hielscher nudi različita rješenja za smještaj različitih zahtjeva neophodnih za specifična tkiva i njihove tretmane. Za istovremenu ultrazvuku brojnih uzoraka Hielscher nudi UIP400MTP za multiwell ploče, VialTweeter za sonication do 10 bočica (npr. Eppendorfove cijevi) ili ultrazvučni CupHorn. Ultrasonikatori tipa sonde dostupni su od 50 do 400 vata kao laboratorijski homogenizatori, dok industrijski sistemi pokrivaju raspon snage od 500 vata do 16kW.
Molimo vas da nam se javite i javite nam o vašim zahtjevima za prijavu i procese. Našem dobro iskusnom osoblju će biti drago da vam preporuči najpo odgovara ultrasonikator za vaš biološki proces.
Tabela u nastavku daje naznaku približan kapacitet prerade naših ultrasonicators: