Genetska transformacija u biljnim ćelijama pomoću ultrazvuka

Transformacija posredovana agrobakterijama uz pomoć ultrazvuka (SAAT) je efikasna metoda za inficiranje biljnih stanica stranim genima koristeći Agrobacterium kao transporter. Ultrazvučna kavitacija uzrokuje sonoporaciju, što se može opisati kao ciljano mikro-ranjavanje biljnog tkiva. Preko ovih ultrazvučnih mikro rana, DNK i DNK vektori se mogu efikasno transportovati u ćelijski matriks.

sonoporacija – Ultrazvučno poboljšana transformacija ćelija

Kada se ultrazvuk niske frekvencije (približno 20 kHz) primjenjuje na ćelijske suspenzije, efekti akustične kavitacije uzrokuju prolaznu permeabilizaciju membrane na ćelijskim tkivima. Ovaj ultrazvučni efekat poznat je kao sonoporacija i koristi se za transfer gena u ćelije ili tkiva.
Prednosti ultrazvučne obrade temelje se na njegovom netermičnom mehaničkom principu rada, što ultrazvučnu obradu čini često raznovrsnijom i manje ovisnom o tipovima ćelija. Svestrana primjena sonoporacije otvara mogućnost za korištenje transgenih biljaka, koje imaju značajan potencijal u bioprodukciji kompleksnih humanih terapijskih proteina. Takvi biljni reaktori mogu se lako genetski manipulirati, sprečavaju potencijalnu kontaminaciju ljudskim patogenima, ne oštećuju bakterije koje posreduju transformaciju (npr. Agrobacterium), i predstavljaju jeftinu, efikasnu metodu biosinteze.

Transformacija ćelija potpomognuta ultrazvukom

Sonikacija je tehnika koja primjenjuje ultrazvučne valove niske frekvencije za miješanje čestica u otopini, za miješanje otopina, čime se povećava brzina prijenosa mase i rastvaranja. Istovremeno, ultrazvuk može ukloniti otopljene plinove iz tekućina. U transformaciji biljaka, sonikacija će uzrokovati stvaranje mikrorana na biljnom tkivu i poboljšati isporuku gole DNK u biljni protoplast.

Za genetsku transformaciju, transformacija posredovana agrobakterijama uz pomoć ultrazvuka (SAAT) je poželjna metoda i ima značajno veću efikasnost od sonikacije koja se koristi za prijenos golih DNK i DNK vektora direktno u protoplast. Brojne studije su pokazale da se transformacija posredovana Agrobacterium-om (SAAT) uz pomoć ultrazvuka može koristiti za induciranje mehaničkih poremećaja i formiranja rana na biljnim stanicama ultrazvučnim valovima i rezultirajućom akustičnom kavitacijom. Kratki ultrazvučni tretman stvara mikro-rane na površini eksplantata. Kako će ranjene ćelije omogućiti prodiranje Agrobacterium u dublji dio biljnog tkiva, povećavajući tako vjerovatnoću zaraze biljnih stanica. Osim toga, izlučena fenolna jedinjenja pospješuju transformaciju. Ultrazvučno generirane mikro-rane čine prodiranje eksplantata bakterijama također izvodljivijim. SAAT je uspješno korišten za genetsku transformaciju biljnih vrsta koje se posebno smatraju otpornim na Agrobacterium.
To što je vrlo jednostavna i jeftina metoda, kao i značajno poboljšanje prijenosa gena posredovanog Agrobacteriumom, glavne su prednosti SAAT-a. Osim uspješne primjene SAAT-a u transformaciji Chenopodium rubrum L. i Beta vulgaris L., ovaj pristup je također primijenjen u proizvodnji rekombinantnog toplotno labilnog holotoksina divljeg tipa Escherichia coli i adjuvansa LT vakcine s mutantom Escherichia coli u Nicotiana tabacum. , u kojoj su najviši sistemski titri LT-B-specifičnih IgG otkriveni kod ptica.
(usp. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka i R. Baranski, 2014)

Opća procedura za prijenos gena putem sonoporacije u biljnim ćelijama

1. Priprema genetskog materijala: Započnite pripremom genetskog materijala koji želite da unesete u biljne ćelije. To može biti plazmidna DNK, RNK ili druge nukleinske kiseline.
2. Izolacija biljnih ćelija: Izolirajte biljne ćelije koje želite ciljati. Ovisno o vašem eksperimentu, ove ćelije mogu biti izolirane iz biljnih tkiva ili kultura.
3. ćelijska suspenzija: Suspendujte biljne ćelije u odgovarajućem mediju ili puferu. Ovo je neophodno kako bi se osiguralo da su ćelije zdrave iu stanju pogodnom za unos gena.
4. Postavite svoj Sonicator: Pripremite sonikator tipa sonde tako što ćete unaprijed postaviti parametre sonikacije kao što su amplituda, vrijeme, energija i temperatura. Uronite ultrazvučnu sondu u ćelijsku suspenziju.
5. Sonikacija: Pokrenite proceduru sonikacije. Brza oscilacija vrha sonde stvara mjehuriće kavitacije u tekućini. Ovi mjehurići se šire i kolabiraju zbog ultrazvučnih valova, stvarajući mehaničke sile i mikrostrujanje u suspenziji.
6. sonoporacija: Mehaničke sile i mikrostrujanje koje stvara kavitacija stvara privremeno pore i rupe na membranama biljnih ćelija. Genetski materijal prisutan u suspenziji može ući u biljne ćelije kroz ove pore.
7. inkubacija: Nakon tretmana sonoporacijom, inkubirajte biljne stanice kako biste im omogućili da se oporave i stabiliziraju svoje membrane. Ovo je ključni korak za osiguranje opstanka ćelija i uspješan prijenos gena.

Transfer gena preko Agrobacterium ili liposoma

Postoje dva uobičajena oblika za transfekciju biljnih ćelija. Oni koriste ili agrobakteriju, rod gram-negativnih bakterija, ili liposome kao nosioce genetskog materijala.

• Sonoporacija posredovana agrobakterijama: Agrobacterium tumefaciens je bakterija koja se obično koristi u biljnom genetskom inženjeringu. U ovoj metodi, plazmidna DNK koja sadrži željeni gen se unosi u Agrobacterium, koja se zatim miješa sa biljnim stanicama. Suspenzija ćelija je podvrgnuta sonoporaciji pomoću sonikatora tipa sonde. Ultrazvučna energija pospješuje prijenos genetskog materijala iz Agrobacterium u biljne stanice. Ova metoda se široko koristi za genetsku modifikaciju biljaka.
• Sonoporacija posredovana liposomima: Liposomi su vezikule na bazi lipida koje mogu nositi genetski materijal. U ovoj metodi, liposomi napunjeni plazmidnom DNK ili drugim nukleinskim kiselinama se miješaju s biljnim stanicama. Sonoporacija pomoću sonikatora tipa sonde koristi se za olakšavanje preuzimanja liposoma u biljnim stanicama. Ultrazvuk razbija lipidne dvoslojeve liposoma, oslobađajući genetski materijal u biljne ćelije. Ovaj pristup je koristan za studije prolazne ekspresije gena u biljnim ćelijama.

Naučno dokazane prednosti transformacije posredovane agrobakterijama (SAAT) uz pomoć ultrazvuka

Transformacija posredovana agrobakterijama (SAAT) primijenjena je na brojne biljne vrste. Kratak i relativno blag ultrazvučni tretman biljnih ćelijskih kultura uzrokuje sonoporaciju, što kasnije omogućava duboku penetraciju Agrobacterium kao prenosioca gena. U nastavku možete pročitati ogledne studije koje pokazuju korisne efekte SAAT-a.

Ultrazvučno potpomognuta transformacija Ashwagandhe

Kako bi poboljšali efikasnost transformacije kod W. somnifera (poznatog kao ashwagandha ili zimska trešnja), Dehdashti i kolege (2016) istraživali su upotrebu acetosiringona (AS) i sonikaciju.
Acetosiringon (AS) je dodat u tri faze: tečna kultura Agrobacterium, infekcija Agrobacterium i ko-kultura eksplantata sa Agrobacterium. Utvrđeno je da je dodavanje 75 μM AS tečnoj kulturi Agrobacterium optimalno za indukciju vir gena.
Dodatna primjena sonikacije (SAAT) rezultirala je najvećom ekspresijom gena. Utvrđeno je da je ekspresija gena gusA u dlakavom korijenu najbolja kada su listovi i vrhovi izdanaka sonikirani 10 odnosno 20 sekundi. Efikasnost transformacije poboljšanog protokola zabilježena je 66,5 i 59,5% u slučaju eksplantata vrhova lista i izdanaka. U poređenju sa drugim protokolima, utvrđeno je da je efikasnost transformacije ovog poboljšanog protokola 2,5 puta veća za listove i 3,7 puta veća za vrhove izdanaka. Southern blot analize potvrdile su 1-2 kopije gusA transgena u linijama W1-W4, dok su 1-4 transgenske kopije otkrivene u liniji W5 generisane poboljšanim protokolom.

Učinak trajanja transformacije posredovane Agrobacterium-om (SAAT) uz pomoć ultrazvuka na učestalost transformacije eksplantata lista W. somnifera (a) i vrha izdanka (b)(studija i grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvučno potpomognuta transformacija pamuka

Hussain et al. (2007) pokazuju korisne efekte transformacije pamuka uz pomoć ultrazvuka. Akustična kavitacija uzrokovana ultrazvukom niske frekvencije stvara mikro-rane na i ispod površine biljnog tkiva (sonoporacija) i omogućava Agrobacterium da putuje dublje i potpuno kroz biljno tkivo. Ovaj način ranjavanja povećava vjerovatnoću zaraze biljnih ćelija koje leže dublje u tkivu. Kako bi se procijenila efikasnost transformacije SAAT-a, izmjerena je ekspresija GUS gena. GUS reporter sistem je sistem reporterskih gena, posebno koristan u biljnoj molekularnoj biologiji i mikrobiologiji. Podešavanjem različitih SAAT parametara, GUS prolazna ekspresija u pamuku koristeći zrele embrione kao eksplant je značajno poboljšana. GUS je prvi put otkriven 24 h nakon inkubacije eksplantata, a do 48 h ekspresija GUS-a je bila vrlo intenzivna, što je poslužilo kao koristan pokazatelj uspješne transformacije eksplantata pamuka nakon transformacije posredovane Agrobacteriumom (SAAT) uz pomoć ultrazvuka. Poređenje različitih tehnika transformacije (i to biolistična, Agro, BAAT, SAAT), transformacija posredovana Agrobacterium-om (SAAT) uz pomoć ultrazvuka, pokazala je daleko najbolje rezultate transformacije.

Izbor postupka transformacije na osnovu prelaznog izraza GUS-a. Transformacija posredovana Agrobacteriumom (SAAT) uz pomoć ultrazvuka pokazuje značajno veću prolaznu ekspresiju.(studija i grafika: © Hussain et al., 2007.)

Ultrazvučna rješenja visokih performansi za sonoporaciju i SAAT

Hielscher Ultrasonics ima dugogodišnje iskustvo u razvoju i proizvodnji ultrasonikatora visokih performansi za laboratorije, istraživačke objekte kao i industrijsku proizvodnju s vrlo velikom propusnošću. Za mikrobiologiju i nauku o životu, Hielscher nudi različita rješenja za prilagođavanje različitih zahtjeva potrebnih za određena tkiva i njihove tretmane. Za simultanu ultrazvučnu obradu brojnih uzoraka Hielscher nudi UIP400MTP za ploče s više jažica, VialTweeter za ultrazvučnu obradu do 10 bočica (npr. Eppendorf epruvete) ili ultrazvučni CupHorn. Ultrasonikatori tipa sonde su dostupni od 50 do 400 vati kao laboratorijski homogenizatori, dok industrijski sistemi pokrivaju opseg snage od 500 vati do 16 kW.
Molimo kontaktirajte nas i obavijestite nas o zahtjevima vaše prijave i procesa. Naše iskusno osoblje rado će vam preporučiti najprikladniji ultrazvučni aparat za vaš biološki proces.
Tabela ispod daje vam indikaciju približnih kapaciteta obrade naših ultrazvučnih aparata: