Синтез на пептиди чрез ултразвук с използване на техниката TAGGING
Синтезът на пептиди е в основата на фармацевтичните научноизследователски и развойни дейности, но конвенционалните методи – синтез на пептиди в твърда фаза (SPPS) и класическо свързване в разтворна фаза – остават трудоемки, изискват голямо количество реагенти и са трудни за мащабиране. По-ефективна алтернатива се появи в комбинацията от две ортогонални стратегии: техниката TAGGING (temporary anchoring group) за сглобяване на пептиди в разтворна фаза и ултразвукова (сонохимична) обработка за ускоряване на етапите на свързване, депротекция и дообработка. Заедно те позволяват производство на терапевтични пептиди в мащаб от грама до големи количества. – като например антибиотикът/антираков липопептид липобактин – с висока чистота, намалена тежест на пречистването и значително по-малко ръчни операции.
Какви са предимствата на ултразвуковата синтеза на пептиди?
- Икономика на разтворната фаза: Реакциите се провеждат в разтвор със значително по-нисък разход на аминокиселини в сравнение със синтеза на пептиди в твърда фаза
- Пречистване чрез филтриране: Пептидът, свързан с TAG, се утаява в полярни разтворители, поради което междинните продукти се изолират чрез обикновена филтрация – не се налага колонен хроматографски анализ или характеризиране на всеки етап.
- Значително намаляване на разходите за труд: Премахването на междинните етапи на пречистване и спектралните проверки спестява значителен брой човекочаса в рамките на цялата синтезна кампания.
- Сонохимично ускорение: Ултразвуковата обработка съкращава всеки от решаващите етапи – Отстраняване на Fmoc-защитата, свързване на страничните вериги, циклизация и цялостно отстраняване на защитата – без да се нарушава селективността.
- Висока производителност, висока чистота: Всяко свързване на фрагменти и окончателното сглобяване на липобактина протичат с висок добив; цялостното отстраняване на защитните групи води до получаване на целевото съединение с добив от ~83 %.
- Готовност за мащабни операции: Техниката TAGGING е изрично описана като позволяваща мащабна синтеза на пептиди с максимална чистота, което я превръща в практичен метод за получаване на грамови и килограмови количества терапевтично важни липопептиди.
- Пълна съвместимост на методите: Подходът е напълно съвместим с конвенционалната SPPS и химията в разтворна фаза, така че съществуващите стратегии за защитни групи (Fmoc, Alloc, Pbf, tBu) и свързващи агенти (T3P, HATU, COMU, DIC/DMAP) се прилагат без промени.
Разкажете ни за предизвикателствата в процеса на синтез на пептиди. Нашите експерти по ултразвукова обработка ще ви препоръчат идеалната конфигурация на ултразвуковия апарат за вашите цели при производството на пептиди!
Индустриален ултразвуков уред UIP2000hdT с реактор за фармацевтични партиди за подобрена синтеза на пептиди
Какво представлява техниката TAGGING?
При TAG-подхода пептидният фрагмент се свързва ковалентно с отстранима, подобна на смола анкерна група (TAG), която остава в разтвора. Това позволява нарастващата верига да се обработва като пептид в твърда фаза, но в течна фаза:
- След всяко свързване или отстраняване на защитната група пептидът, свързан с TAG, се извлича в твърдо състояние чрез проста филтрация или утаяване в полярна среда или антиразтворител, докато разтворимите примеси и страничните продукти се отмиват.
- Тъй като пептидът остава свързан с линкера, колоновата хроматография и пълната характеристика на всеки междинен продукт до голяма степен се елиминират, което спестява значително време и човешки усилия.
- Реакциите могат да се провеждат в разтворна фаза, като се използва значително по-малко количество аминокиселина в сравнение със SPPS, а крайният продукт се освобождава чрез отцепване на TAG-групата близо до края на синтеза.
При липобактина при ретросинтезата бяха използвани три фрагмента – Fmoc-Ala-Arg-TAG, Alloc-Thr(Ile-Fmoc)-OH и липидният фрагмент C₁₁H₂₃CONH-Ile-Ser(OᵗBu)-OH – в съчетание със стратегия за кондензация на фрагменти, с цел получаване на дългия пептид с много висок добив. (вж. Ramya и др., 2025)
Пълният синтез на пептида липобактин с помощта на TAG се ускорява чрез ултразвукова обработка.
(Изследване: Рамия и др., 2025 г.)
Как ултразвуковото обработване подобрява синтеза на пептиди в разтворна фаза
Ултразвуковата обработка се използва за ускоряване и съкращаване на ключовите етапи в разтворната фаза. При синтеза на липобактин, както е описано от Ramya и др. (2025), ултразвуковата обработка се прилага за:
Тъй като при TAG-химията междинните продукти вече се получават под формата на филтрируеми твърди вещества, ултразвуковата обработка и TAGGING се допълват взаимно: ултразвукът ускорява масообмена, смесването и реакционната кинетика, докато анкерът задържа пептида като възстановимо твърдо вещество, което позволява чист работен процес с минимална хроматография.
Sonicator UP200St: Реактор с ултразвуково разбъркване за ускорена синтеза на пептиди.
Лесно мащабиране на пептиди с висока степен на чистота чрез ултразвукова обработка
Често срещано предизвикателство при преминаването на процесите за производство на пептиди и пептидни лекарства от лабораторни условия към промишлено производство е запазването на сонохимичния ефект при по-големи обеми и непрекъснат поток. Hielscher решава този проблем с цялостна гама от ултразвукови процесори – от лабораторни до напълно промишлени мащаби, като осигурява валидирана, възпроизводима мощност и документиран контрол на процеса.
Промишлен ултразвуков апарат UIP4000hdT (4000 W, 20 kHz) за синтез на пептиди, подпомогнат от ултразвук
Често задавани въпроси относно синтеза на TAG-пептиди с помощта на ултразвук
Какво представлява синтезът на пептиди в течна фаза (LPPS)?
Синтезът на пептиди в течна фаза (LPPS) е метод за поетапно изграждане на пептиди в разтвор с помощта на класически средства от областта на органичната химия. Той е един от четирите основни метода за създаване на пептиди и е известен като икономически ефективен, мащабируем и най-екологичен сред подходите за синтез на пептиди. Той е особено подходящ за по-къси пептиди, въпреки че при по-дълги последователности могат да възникнат затруднения, свързани с поддържането на стабилни реакции, разтворимостта и отстраняването на нежелани странични продукти.
Как ултразвукът подобрява синтеза на пептиди в течна фаза?
Ултразвукът (соникацията) подобрява процеса на LPPS, като ускорява както етапа на свързване, така и етапа на депротекция. Ултразвуковите вълни подобряват масообмена и реакционната кинетика, което води до:
- Намалено време за реакция: циклите на включване и изключване на защитата могат да бъдат значително съкратени
- По-високи добиви: по-пълно преобразуване на всеки етап
- Повишена чистота на суровия продукт: по-малко непълни странични продукти от свързването
- По-нисък разход на реагенти: необходими са по-малко еквиваленти на свързващи реагенти и аминокиселини, тъй като реакциите протичат по-бързо и по-ефективно
Какво представлява синтезът на пептиди с помощта на TAG (TAPS)?
Синтезът на пептиди с помощта на маркери (TAPS) е специален случай на синтез на пептиди в течна фаза, при който пептидите се изграждат поетапно в разтвор, като се използват разтворими органични маркери вместо твърда подложка. Тези маркери, аналогични на твърдите носители в SPPS, улесняват изолирането след всеки етап от синтеза, като позволяват отделяне чрез утаяване, филтриране или екстракция. Маркерите трябва да се разтварят в органични разтворители, като същевременно остават различими от другите вещества.
Как ултразвукът подобрява процеса на маркиране?
Когато ултразвуковото обработване се съчетае със синтез, подпомаган от TAG, предимствата включват:
- По-бързи цикли на свързване и отключване – ултразвукът ускорява реакциите в разтворна фаза, като намалява времето за всеки етап
- Подобрена разтворимост и масов трансфер – ултразвуковата кавитация спомага за поддържането на хомогенността на маркирания пептид в разтвора, което е от решаващо значение, тъй като разтворимостта е основно предимство на TAPS пред SPPS
- Намалено количество реагент – по-високата ефективност на реакцията означава, че са необходими по-малко еквиваленти на аминокиселини и свързващи реагенти
- По-пълни реакции – намаляване на непълните странични продукти от свързването, което води до по-висока чистота на суровия продукт и опростено последващо пречистване
Забележителен пример е пълната синтеза на липобактин, подпомогната от TAG и осъществена чрез ултразвуково въздействие, която показа, че техниката TAGGING е напълно съвместима с методите в разтворна фаза и че ултразвуковото въздействие осигурява високи добиви на всеки етап. (вж. Ramya и др., 2025)
Какви дължини на пептидите могат да се получат чрез TAPS с ултразвуково подпомагане?
Късите до среднодълги пептиди (~5–20 аминокиселинни остатъка) са идеалният диапазон, в който TAPS осигурява висока чистота и надеждни резултати.
До по-дълги пептиди може да се стигне чрез стратегия за кондензация на фрагменти: по-малки фрагменти (6–10-мери) се синтезират върху маркер, след което се свързват помежду си, за да се образува целевият пептид с пълна дължина.
При много дълги или сложни цели може да се приложи хибриден подход, съчетаващ SPPS и TAPS.
Открийте как ултразвуковата обработка подобри синтеза на пептиди в твърда фаза (SPPS)!
Може ли синтезът на пептиди в течна фаза с помощта на ултразвук да се приложи в промишленото производство?
Да, промишлени ултразвукови апарати – като например моделите на Hielscher UIP2000hdT или UIP4000hdT – могат да бъдат интегрирани в реактори за партидно производство и поточни клетки, което позволява производството на пептиди в голям мащаб. Вграждането им в съществуващи реактори позволява подобряване на утвърдените процеси за синтез на пептиди.
Какви са основните предимства на ултразвуковите LPPS пред конвенционалните LPPS?
- Скорост: Времето за реакция се намалява значително при всеки етап на свързване и депротекция.
- Ефективност: По-високите добиви на етап водят до по-висок общ добив при пептидите с множество остатъци.
- Устойчивост: по-малко еквиваленти на реагенти и потенциално по-малко разтворител благодарение на по-бързите реакции.
- Достъпност: за това е необходима само стандартна ултразвукова вана, без специална апаратура.
- Съвместимост: работи със стандартни свързващи реагенти (DIC, HATU, TBTU, Oxyma и др.) и стратегии за защитни групи (Boc, Fmoc).
Литература / Препратки
- M. Ramya, Veeranjaneyulu Avula, S. Nandeesh, B. Kirankumar, G. Nagendra (2025): TAG assisted and ultrasonication mediated total synthesis of lipobactin. Results in Chemistry, Volume 18, 2025, 102842.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
Ултразвуков CupHorn за интензивно ултразвуково третиране на затворени епруветки и флакони за стерилно ултразвуково третиране на пептиди.
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да индустриален размер.