Твърдофазен пептиден синтез – по-ефективен с ултразвукова обработка
Твърдофазният пептиден синтез (SPPS) е обичайният метод за синтез на пептиди. Ултразвуковата обработка е надеждно средство за интензифициране на твърдофазния пептиден синтез, което води до по-високи добиви, подобрена чистота, липса на рацемизация и значително повишена скорост на реакцията. Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови решения за синтез, отцепване и разтваряне на пептиди.
Ултразвуков твърдофазен пептиден синтез
Ултразвуковата обработка вече се прилага широко като метод за интензифициране на органичния синтез и е добре позната със своите предимства, като драстично съкратено време на реакциите, по-високи добиви, по-малко странични продукти, задействане на реакционни пътища, които не могат да бъдат осъществени по друг начин, и/или по-добра селективност. Големи ползи могат да се постигнат и когато ултразвуковата обработка се включи в реакциите на пептиден синтез. Резултатите от изследванията показват, че пептидният синтез с ултразвуково подпомагане постига оптимизиран добив на пептиди с висока чистота, без рацемизация и за кратко време на реакцията.
- Високи добиви на пептиди
- Значително по-бърз синтез
- По-висока чистота на пептидите
- Без рацемизация
- Паралелен синтез на различни пептиди
- Мащабируем до всеки обем
Чашков ултразвуков излъчвател CupHorn за равномерна ултразвукова обработка на няколко реакционни съда за подобрен пептиден синтез.
Схема, илюстрираща твърдофазния пептиден синтез по Merrifield. Ултразвуковата обработка се използва за стимулиране и подобряване на реакцията на синтез, както и за отцепване на синтезираните пептиди от смолата.
Схема: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Изследване | Изследван(и) пептид(и) | Време на реакцията (класически метод спрямо US-SPPS) | Чистота на суровия продукт (класически метод спрямо US-SPPS) | Рацемизация и странични реакции | Основни изводи |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Мет-енкефалин, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-ендорфин | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Не са наблюдавани при Cys/His, дори при 70°C | ~7–12x по-бърз синтез; значителни подобрения в чистотата, особено при последователности, склонни към агрегация, като TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-мер), Pep2 (9-мер), Pep3 (25-мер) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (само с ултразвук) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Не са изследвани; отбелязан е лек спад в чистотата на Pep2 | 14x съкращаване на времето за Pep1; добивите на суровия продукт са значително увеличени. |
| Merlino et al. (2019) | Моделни пентапептиди, пептиди до 44-мер, „трудни последователности“ (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (моделен пептид) | 84% → 93% (моделен пептид); значително по-висока чистота, отколкото при термично нагряване (~45°C) | Без значително увеличение при енантиомерите на Cys/His | Висока ефективност при трудни/склонни към агрегация последователности; позволява намаляване на излишъка от реагенти при запазване на висока чистота. |
Твърдофазен пептиден синтез, подобрен с ултразвук
Твърдофазният пептиден синтез (SPPS) е химична реакция, която позволява изграждането на пептидна верига чрез последователни реакции на аминокиселинни производни върху неразтворим порест носител. Традиционният твърдофазен пептиден синтез обаче е сравнително неефективен и бавен процес. Затова ултразвуковото интензифициране на пептидния синтез е високо ценено средство за по-ефективен и бърз синтез на пептиди.
Silva et al. (2021) сравняват „класическия“ твърдофазен пептиден синтез (SPPS) с флуоренилметоксикарбонилна (Fmoc) защитна група със SPPS, подпомаган с ултразвук (US), въз основа на получаването на три пептида, а именно пептида Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2), специфичен за рецептор 3 на фибробластния растежен фактор (FGFR3), и новите пептиди Pep2 (RQMATADEA-NH2) и Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS с ултразвуково подпомагане води до 14-кратно (Pep1) и 4-кратно (Pep2) съкращаване на времето за изграждане на пептидите в сравнение с „класическия“ метод. Интересно е, че SPPS с ултразвуково подпомагане дава Pep1 с по-висока чистота (82%) от „класическия“ SPPS (73%). Значителното съкращаване на времето, съчетано с постигнатата висока чистота на суровия пептид, подтиква изследователския екип да приложи SPPS с ултразвуково подпомагане към големия пептид Pep3, който съдържа голям брой хидрофобни аминокиселини и хомоолигомерни последователности. Забележително е, че синтезът на този 25-мерен пептид е постигнат за по-малко от 6 часа (347 min) с умерена чистота (прибл. 49%).
По-бърз пептиден синтез чрез твърдофазен пептиден синтез с ултразвуково разбъркване.
(Изследване и анализ: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) също провеждат обстойно изследване на ултразвуковите ефекти върху твърдофазния пептиден синтез, базиран на Fmoc, което позволява синтеза на различни биологично активни пептиди (до 44-мер) със забележителна икономия на материали и време на реакцията. Те показват, че ултразвуковата обработка не засилва основните странични реакции и подобрява синтеза на пептиди с „трудни последователности“, поставяйки стимулирания с ултразвук твърдофазен пептиден синтез (US-SPPS) сред съвременните високоефективни стратегии за синтез на пептиди.
Наличието на високопроизводителни системи за ултразвуков (звуков) синтез на пептиди позволява значително повишаване на скоростта на синтеза и увеличаване на чистотата на суровите продукти. (вж. Wołczański et al., 2019)
Изследване на рацемизацията. Сравнение на характерни 1H ЯМР спектри на моделни пептиди, синтезирани ръчно по класическия подход при стайна температура, спрямо ултразвуковия метод при повишена температура. Химичните отмествания на α-протоните на His и Cys и метиленовата група на Acm (левите панели), както и на ɣ-метилните протони на Val (десните панели), показват, че ултразвуковата обработка при 70°C не причинява рацемизация.
(Изследване и анализ: Wołczański et al., 2019)
Ултразвуково отцепване на пептиди
След твърдофазния пептиден синтез (SPPS) синтезираните пептиди трябва да бъдат отцепени от полимерните смоли. Този етап е известен и като отстраняване на защитните групи. При сравнение на обичайното разклащане и ултразвуковата обработка за отцепване на пептидите от смолата методът с разклащане изисква прибл. 1 час, докато ултразвуковото отцепване може да бъде извършено за 15 до 20 min. Ултразвуковото отцепване на пептиди може да се прилага за отцепване на защитени аминокиселини и пептиди, свързани с полистиренови смоли чрез бензилови естерни връзки.
Ултразвуковото отцепване на пептиди от полистиренова смола осигурява високи добиви на пептиди с висока чистота, без рацемизация, чрез бърза процедура.
(изследване и схема: ©Anuradha and Ravindranath, 1995)
Реактор с ултразвуково разбъркване за подобрен и ускорен пептиден синтез. На снимката е показан ултразвуковият апарат UP200St в стъклен реактор с разбъркване.
Високопроизводителни ултразвукови апарати за пептиден синтез
Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови решения за директна и индиректна ултразвукова обработка. Мощните ултразвукови процесори с прецизно управление подават точно необходимото количество ултразвукова енергия към реакционния съд. Независимо дали използвате спринцовки, епруветки, многоямкови плаки или стъклени реактори като съдове за синтез, Hielscher Ultrasonics предлага най-подходящия ултразвуков апарат за вашето приложение с пептиди.
- пептиди по индивидуални изисквания
- пептиди в голям производствен мащаб
- пептидни библиотеки
Много пептидни синтези се извършват в спринцовки (напр. спринцовъчни реактори с фрита). Ултразвуковият апарат на Hielscher за разбъркване в спринцовки обработва пептидния разтвор, като предава ултразвуковите вълни през стената на спринцовката в течността. Ултразвуковият апарат за разбъркване в спринцовки е едно от най-популярните ултразвукови решения за синтез на пептиди с ултразвуково подпомагане.
Чашковият ултразвуков излъчвател CupHorn е подходящо средство за ултразвукова обработка на до 5 реакционни съда, докато VialTweeter може да побере до десет реакционни епруветки плюс още пет по-големи съда чрез приставка със скоба.
За други типове реактори, като твърдофазните реактори Merrifield или Kamysz, и други полипропиленови или боросиликатни съдове и реактори Hielscher предлага ултразвукови апарати за индиректна и директна ултразвукова обработка с монтаж чрез скоба или фланец, изработени по индивидуални изисквания.
Разбира се, по-големи стъклени реактори с разбъркване, напр. за синтез в разтвор, могат лесно да бъдат оборудвани с ултразвукови сонди (известни също като сонотроди или ултразвукови излъчватели) с всякакъв размер.
- различни типове ултразвукови апарати
- директна и индиректна ултразвукова обработка
- прецизно управление на интензитета
- прецизно управление на температурата
- непрекъснат или импулсен ултразвук
- интелигентни функции, програмируеми устройства
- предлагат се за всеки обем
- линейна мащабируемост
За твърдофазен пептиден синтез в многоямкови/микротитърни плаки UIP400MTP е идеалното устройство. Ултразвуковата кавитация се предава индиректно и равномерно в многобройните ямки с проби за превъзходен масопренос и реакция на синтез. Гледайте видеото по-долу, за да видите ултразвуковия апарат за микроплаки UIP400MTP в действие!
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
Hielscher Ultrasonics произвежда високопроизводителни ултразвукови хомогенизатори за приложения за смесване, диспергиране, емулгиране и екстракция в лабораторен, пилотен и промишлен мащаб.
Полезни факти за ултразвуковия пептиден синтез
Какво представляват пептидите?
Пептидите са съединения, в които множество аминокиселини са свързани чрез амидни връзки, наречени пептидни връзки. Когато са свързани в сложни структури – обикновено състоящи се от 50 или повече аминокиселини – тези големи пептидни структури се наричат протеини. Пептидите са основен градивен елемент на живота и изпълняват множество функции в организма.
Как протича пептидният синтез?
В органичната химия, молекулярната биология и науките за живота пептидният синтез е процесът на получаване на пептиди. Пептидите се синтезират химически чрез реакция на кондензация между карбоксилната група на една аминокиселина и аминогрупата на друга аминокиселина. Обикновено се използват стратегии със защитни групи, за да се избегнат нежелани странични реакции с различните странични вериги на аминокиселините.
Химичният (in-vitro) пептиден синтез най-често започва със свързване на карбоксилната група на присъединяваната аминокиселина (C-края) към N-края на нарастващата пептидна верига. За разлика от този синтез в посока от C към N, естествената протеинова биосинтеза на дълги пептиди в живите организми протича в обратната посока. Това означава, че при биосинтезата N-краят на присъединяваната аминокиселина се свързва с C-края на протеиновата верига (от N към C).
Повечето протоколи за пептиден синтез в научноизследователската и развойната дейност се основават на твърдофазни методи, докато методите за синтез в разтвор се срещат в широкомащабното промишлено производство на пептиди.
Какво е съвременното състояние на пептидния синтез?
SUS-SPPS (устойчив SPPS с ултразвуково подпомагане) доказано свежда процеса до само два етапа на цикъл (комбинирано свързване/блокиране на нереагиралите групи/отстраняване на защитните групи + едно промиване), като значително намалява разхода на разтворители и времето. (вж. Mottola et al., 2025)
TAPS с ултразвуково подпомагане е нововъзникваща комбинация с доказан успех при тотални синтези (напр. lipobactin) и се проучва от организации за договорна разработка и производство (CDMO) за производство на активни фармацевтични съставки (API).
Открийте предимствата на пептидния синтез TAGGING с ултразвуково подпомагане!
Непрекъснатата обработка се проучва като допълнително подобрение – описани са платформи за непрекъснат синтез в един съд с помощта на силилирани маркери.
Областта се развива към принципите на зелената химия, като и ултразвукът, и TAPS допринасят за намалена употреба на разтворители, по-малки количества използвани реагенти и подобрена устойчивост.
Литература / Източници
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics произвежда високопроизводителни ултразвукови хомогенизатори с размери от лабораторни до промишлени.