Синтез на пептиди в твърда фаза – По-голяма ефективност чрез ултразвукова обработка
Синтезът на пептиди в твърда фаза (SPPS) е често срещаният метод за синтез на пептиди. Ултразвукът е надежден инструмент за интензифициране на синтеза на твърдофазен пептид, което води до по-високи добиви, подобрена чистота, липса на състезание и значително ускорена скорост на реакцията. Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови решения за синтез, разцепване и разтваряне на пептиди.
Ултразвукова синтеза на пептиди в твърда фаза
Ултразвукът вече се прилага широко като интензивиращ метод в органичния синтез и е добре известен със своите предимства като драстично намалено време за реакция, по-високи добиви, по-малко странични продукти, иницииране на пътища, които не могат да бъдат постигнати по други начини, и/или по-добра селективност. Големи ползи могат да се получат и когато ултразвукът е свързан с реакции на синтез на пептиди. Резултатите от изследванията показват, че ултразвуковият синтез на пептиди постига оптимизиран добив на пептиди с висока чистота, без рацемизация за кратко време на реакция.
- Високи добиви на пептиди
- Значително по-бърз синтез
- По-висока чистота на пептидите
- Без състезание
- Паралелен синтез на различни пептиди
- Мащабируемо до всякакъв обем
Ултразвуков куперн за равномерно ултразвукоизлъчване на няколко реакторни съда за подобрен синтез на пептиди.
Илюстрация, показваща метода на Мерфийлд за синтез на пептиди в твърда фаза. Ултразвуковата обработка се използва за ускоряване и подобряване на синтезната реакция, както и за отделяне на синтезираните пептиди от смолата.
Графика: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Изследване | Изследвани пептиди | Време за реакция (класически метод срещу US-SPPS) | Чистота на суровия нефт (класически метод срещу US-SPPS) | Рацемизация и странични реакции | Основни изводи |
|---|---|---|---|---|---|
| Волчански и др. (2019) | Мет-енкефалин, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-ендорфин | 600–1920 мин. → 48–284 мин. | 24,2–71,3 % → 60,6–89,9 % | За Cys/His не се наблюдава такова явление, дори при 70 °C | ~7–12 пъти по-бърз синтез; значително подобрение на чистотата, особено при последователности, склонни към агрегация, като TAT. |
| Силва и др. (2021) | Pep1 (12-мер), Pep2 (9-мер), Pep3 (25-мер) | >3515/365 мин. → ~250/85 мин. (Pep1/Pep2); Pep3: 347 мин. (само в САЩ) | 73–84 % → 72–82 % (Pep1/Pep2) | Не е тествано; отбелязано е леко понижение на чистотата при Pep2 | 14-кратно съкращаване на времето за Pep1; значително увеличаване на добива на суров продукт. |
| Мерлино и др. (2019) | Моделни пентапептиди, пептиди с дължина до 44 аминокиселини, “трудни последователности” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 мин. → 30 мин. (модел) | 84 % → 93 % (модел); значително по-висока от термичното нагряване (~45 °C) | Няма значително увеличение при енантиомерите на Cys/His | Изключително ефективен при трудни за секвениране или склонни към агрегация последователности; позволява намаляване на излишъка от реагенти, като същевременно се запазва висока чистота. |
Твърдофазният пептиден синтез е подобрен с ултразвук
Синтезът на твърдофазен пептид (SPPS) е химическа реакция, която позволява сглобяването на пептидна верига чрез последователни реакции на аминокиселинни производни върху неразтворима пореста основа. Традиционният синтез на твърдофазни пептиди обаче е относително неефективен и бавен процес. Следователно ултразвуковото интензифициране на синтеза на пептиди е високо ценен инструмент за по-ефикасен и бърз синтез на пептиди.
Силва и др. (2021) сравниха “класически” флуоренилметоксикарбонил (Fmoc)-синтез на пептиди в твърда фаза (SPPS) с помощта на ултразвук (US)-подпомогната SPPS, базирана на получаването на три пептида, а именно специфичния за рецептора 3 на фибробластния растежен фактор (FGFR3) пептид Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) и новите пептиди Pep2 (RQMATADEA-NH2) и Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
SPPS, подпомогната от САЩ, доведе до 14-кратно (Pep1) и 4-кратно (Pep2) съкращаване на времето за сглобяване на пептида в сравнение с “класически” метод. Интересното е, че SPPS с ултразвукова подкрепа доведе до получаване на Pep1 с по-висока чистота (82 %), отколкото “класически” SPPS (73 %). Значителното съкращаване на времето, съчетано с постигнатата висока чистота на суровия пептид, подтикна изследователския екип да приложи SPPS с помощта на ултразвук към големия пептид Pep3, който се характеризира с голям брой хидрофобни аминокиселини и хомоолигосеквенции. Забележително е, че синтезът на този 25-мер пептид беше осъществен за по-малко от 6 часа (347 минути) при умерена чистота (около 49%).
По-бърз синтез на пептиди чрез синтез на твърдофазен пептид с помощта на ултразвуково разбъркване.
(Проучване и анализ: Wołczański et al., 2019)
Мерлино и др. (2019) също така проведоха всеобхватно проучване на въздействието на ултразвука върху твърдофазната пептидна синтеза на базата на Fmoc, което позволи синтеза на различни биологично активни пептиди (до 44-мер), при значителна икономия на материал и реакционно време. Те доказаха, че ултразвуковата обработка не засилва основните странични реакции и подобрява синтеза на пептиди, притежаващи “трудни последователности”, поставяйки ултразвуково насърчавания синтез на твърдофазен пептид (US-SPPS) сред настоящите високоефективни стратегии за синтез на пептиди.
Наличието на високоефективни системи за ултразвуков (звуков) синтез на пептиди позволява значително подобряване на скоростта на синтез и повишаване на чистотата на суровите продукти. (срв. Wołczański et al., 2019)
Изследване на рацемизацията. Сравнение на значими 1H NMR спектри на моделни пептиди, синтезирани ръчно с помощта на класическия подход при стайна температура спрямо ултразвуковия метод при повишена температура. Химичните измествания на His и Cys α-протоните и метиленовата група на Acm (леви панели), ɣ-метиловите протони на Val (десни панели) показват, че ултразвукът при 70°C не причинява рацемизация.
(Проучване и анализ: Wołczański et al., 2019)
Ултразвуково разцепване на пептиди
След синтеза на твърдофазен пептид (SPPS) синтезираните пептиди трябва да бъдат разцепени от полимерните смоли. Тази стъпка е известна още като дезащита. Когато се сравняват обичайното разклащане и ултразвук за разцепване на пептиди от смола, методът на разклащане изисква приблизително 1 час, докато ултразвуковото разцепване може да се извърши за 15 до 20 минути. Ултразвуковото разцепване на пептида може да се приложи за разцепване на защитени аминокиселини и пептиди, свързани с полистиролови смоли чрез бензилови естерни връзки.
Ултразвуковото разцепване на пептиди от полистиролова смола дава високи добиви на пептиди с висока чистота, без рацемизация, в рамките на бърза процедура.
(проучване и графика: ©Anuradha and Ravindranath, 1995)
Ултразвуково разбъркан реактор за подобрен и ускорен синтез на пептиди. На снимката е показано ултразвуков апарат UP200St в разбъркан стъклен реактор.
Високоефективни ултразвукови апарати за синтез на пептиди
Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови решения за директна и индиректна ултразвук. Мощни и прецизно управляеми ултразвукови процесори доставят точното количество ултразвукова енергия към реакционния съд. Независимо дали използвате спринцовки, епруветки, многоямкови плочи или стъклени реактори като съда за синтез, Hielscher Ultrasonics предлага най-подходящия ултразвуков уред за вашето приложение на пептиди.
- Персонализирани пептиди
- Широкомащабно производство на пептиди
- Пептидни библиотеки
Много пептидни синтези се извършват в спринцовки (напр. реактори за спринцовки). Ултразвуковата бъркалка на спринцовката на Hielscher озвучава пептидния разтвор, свързвайки ултразвуковите вълни през стената на спринцовката в течността. Ултразвуковата бъркалка за спринцовка е едно от най-популярните ултразвукови решения за ултразвуков синтез на пептиди.
Ултразвуковият куперхорн е подходящ инструмент за ултразвук на до 5 реакторни съда, докато VialTweeter може да побере до десет реакционни тръби плюс допълнително пет по-големи съда чрез аксесоар със затягане.
За други видове реактори, като например твърдофазните реактори „Merrifield“ или „Kamysz“, както и за други съдове и реактори от полипропилен или боросиликат, компанията „Hielscher“ предлага соникатори за непряко и пряко ултразвуково обработване с индивидуално пригодени скоби за закрепване или фланци.
Разбира се, по-големите стъклени реактори с бъркалка, например за синтез в разтворна фаза, могат лесно да бъдат оборудвани с ултразвукови сонди (известни още като сонотроди или ултразвукови рога) с всякакви размери.
- различни видове ултразвукови апарати
- директна и индиректна ултразвук
- прецизен контрол на интензитета
- прецизен контрол на температурата
- непрекъснат или импулсен ултразвук
- Интелигентни функции, програмируеми устройства
- Предлага се за всеки обем
- Линейна мащабируемост
За синтез на пептиди в твърда фаза в плаки с множество лунки/микротитърни плаки, UIP400MTP е идеалното устройство. Ултразвуковата кавитация се предава косвено и равномерно в многобройните лунки за проби, което осигурява отличен масов трансфер и синтезна реакция. Гледайте видеото по-долу, за да видите Устройство за ултразвукова обработка на микроплаки UIP400MTP в действие!
Свържете се с нас! / Попитайте ни!
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори за смесване, дисперсия, емулгиране и екстракция в лабораторен, пилотен и индустриален мащаб.
Интересни факти за ултразвуковия синтез на пептиди
Какво представляват пептидите?
Пептидите са съединения, при които множество аминокиселини са свързани чрез амидни връзки, така наречените пептидни връзки. Когато са свързани в сложни структури – Обикновено състоящи се от 50 или повече аминокиселини -, тези големи пептидни структури се наричат протеини. Пептидите са основен градивен елемент на живота и изпълняват множество функции в тялото.
Как протича синтезът на пептиди?
В органичната химия, молекулярната биология и науките за живота синтезът на пептиди е процес на производство на пептиди. Пептидите се синтезират химически чрез реакция на кондензация на карбоксилната група на една аминокиселина в аминогрупата на друга аминокиселина. Обикновено се използват стратегии за защитни групи (също защитни групи), за да се избегнат нежелани странични реакции с различните аминокиселинни странични вериги.
Химичният (in vitro) пептиден синтез най-често започва чрез свързване на карбоксилната група на входящата аминокиселина (С-край) с N-края на нарастващата пептидна верига. За разлика от този синтез на C-to-N, естествената протеинова биосинтеза на дълги пептиди в живите организми протича в обратната посока. Това означава, че при биосинтезата N-терминалът на входящата аминокиселина е свързан с C-края на протеиновата верига (N-to-C).
Повечето протоколи за научноизследователска и развойна дейност за синтез на пептиди се основават на твърдофазни методи, докато методите за синтез на фаза разтвор могат да бъдат намерени в широкомащабното промишлено производство на пептиди.
Какво е състоянието на науката в областта на синтеза на пептиди към момента?
SUS-SPPS (Устойчива SPPS с ултразвукова подкрепа) Доказано е, че този метод съкращава процеса до само две стъпки на цикъл (комбинирано свързване/капсулиране/депротекция + еднократно промиване), което значително намалява разхода на разтворител и спестява време. (вж. Mottola et al., 2025)
TAPS с ултразвукова подпомощ е нововъзникваща комбинация с доказан успех в пълни синтези (например липобактин) и в момента се проучва от CDMO компаниите с оглед производството на активни фармацевтични съставки (API).
Открийте предимствата на синтеза на пептиди чрез маркиране с помощта на ултразвук!
непрекъсната обработка се проучва като възможност за по-нататъшно усъвършенстване – Описани са платформи за непрекъснат синтез в един съд с помощта на силилирани маркери.
Областта се развива в посока към принципите на зелената химия, като ултразвукът и TAPS допринасят за намаляване на употребата на разтворители, по-малко количество реагенти и по-голяма устойчивост.
Литература / Препратки
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да индустриален размер.