Ултразвуково приготвяне на липозоми

Липозомите, произведени чрез ултразвук, показват много висока ефективност на включване, висок капацитет на натоварване и равномерно малък размер със сферична форма. Благодарение на това ултразвуково произведените липозоми осигуряват отлична бионаличност. Hielscher Ultrasonics предлага ултразвукови апарати за надеждно производство на липозоми с фармацевтично качество в партиден и непрекъснат режим.

Предимства на ултразвуковото производство на липозоми

Ултразвуковото капсулиране в липозоми е техника за капсулиране на лекарства или други терапевтични агенти в липозоми посредством ултразвукова енергия. В сравнение с други методи за капсулиране в липозоми ултразвуковото капсулиране има няколко предимства, които го правят превъзхождаща производствена техника.

• Високо натоварване, висока ефективност на включване: Ултразвуковото производство на липозоми е добре известно с получаването на липозоми с високо натоварване с активни съставки, например витамин C, лекарствени молекули и др. Същевременно методът на ултразвукова обработка показва висока ефективност на включване. Това означава, че висок процент от активното вещество се капсулира чрез ултразвукова обработка. В заключение, това прави ултразвуковата обработка високоефективен метод за производство на липозоми.
• Липозоми с равномерно малък размер: Едно от предимствата на ултразвуковото капсулиране в липозоми е способността му да произвежда силно еднородни липозоми с тясно разпределение по размер. Ултразвуковата енергия може да се използва за раздробяване на по-големи липозоми или липидни агрегати до по-малки, по-еднородни липозоми. Това води до по-голяма еднородност на размера и формата на липозомите, което може да бъде важно при приложения за доставяне на лекарства, при които размерът на частиците може да повлияе върху тяхната фармакокинетика и ефикасност.
• Приложимо за всякакви молекули: Друго предимство на ултразвуковото капсулиране в липозоми е способността му да капсулира широк спектър от лекарства и други терапевтични агенти. Техниката може да се използва за капсулиране както на хидрофилни, така и на хидрофобни лекарства, което може да бъде трудно при други методи. Освен това ултразвуковата енергия може да се използва за капсулиране на макромолекули и наночастици, които може да са твърде големи за капсулиране чрез други методи.
• Бързо и надеждно: Ултразвуковото капсулиране в липозоми е и сравнително прост и бърз процес. То не изисква използването на агресивни химикали или високи температури, които могат да навредят на капсулираните терапевтични агенти.
• Мащабиране: Освен това техниката може лесно да се мащабира за широкомащабно производство, което я прави икономически ефективен вариант за приложения за доставяне на лекарства.

В обобщение, ултразвуковото капсулиране в липозоми е превъзхождаща техника за капсулиране в липозоми благодарение на способността си да произвежда еднородни липозоми с тясно разпределение по размер, да капсулира широк спектър от терапевтични агенти, както и на своята простота и мащабируемост.

След образуването на липиден филм и последващата му рехидратация се използва ултразвукова обработка за подпомагане на включването на активни съставки в липозомата. Освен това чрез ултразвуковата обработка се постига желаният размер на липозомите.

Ултразвуково приготвяне на липозоми за фармацевтични и козметични продукти

Липозомите (везикули на липидна основа), трансферозомите (ултрадeформируеми липозоми), етозомите (ултрадeформируеми везикули с високо съдържание на алкохол) и ниозомите (синтетични везикули) са микроскопични везикули, които могат да бъдат изкуствено приготвени като сферични носители, в които да се капсулират активни молекули. Тези везикули с диаметри между 25 и 5000 nm често се използват като носители на лекарства във фармацевтичната и козметичната промишленост, например за перорално или локално доставяне на лекарства, генна терапия и имунизация. Ултразвуковата обработка е научно доказан метод за високоефективно производство на липозоми. Ултразвуковите апарати на Hielscher произвеждат липозоми с високо натоварване с активни съставки и превъзходна бионаличност.

Липозоми и липозомни формулировки

Липозомите са униламеларни, олиголамеларни или мултиламеларни везикуларни системи и са изградени от същия материал като клетъчната мембрана (липиден бислой). Според състава и размера си липозомите се разграничават, както следва:

• мултиламеларни везикули (MLV, 0,1–10μm)
• малки униламеларни везикули (SUV, <100 nm)
• големи униламеларни везикули (LUV, 100–500 nm)
• гигантски униламеларни везикули (GUV, ≥1 μm)

Основната структура на липозомите се състои от фосфолипиди. Фосфолипидите имат хидрофилна главна група и хидрофобна опашна група, която се състои от дълга въглеводородна верига.
Липозомната мембрана има много сходен състав с кожната бариера, така че липозомите могат лесно да се интегрират в човешката кожа. Когато липозомите се сливат с кожата, те могат да освобождават включените агенти директно на целевото място, където активните вещества могат да изпълняват своите функции. По този начин липозомите увеличават способността за проникване през кожата/кожната пропускливост за включените фармацевтични и козметични агенти. Липозомите без капсулирани агенти, празните везикули, също са мощни активни средства за кожата, тъй като „phosphatidylcholin“ включва два незаменими компонента, които човешкият организъм не може да произвежда сам: линолова киселина и холин.
Липозомите се използват като биосъвместими носители на лекарства, пептиди, протеини, „plasmic DNA“, антисенс олигонуклеотиди или рибозими за фармацевтични, козметични и биохимични цели. Огромното разнообразие в размера на частиците и във физичните параметри на липидите предоставя привлекателен потенциал за конструиране на носители, съобразени с конкретните нужди, за широк спектър от приложения. (Ulrich 2002)

Ултразвуково образуване на липозоми

Липозоми могат да се образуват чрез използване на ултразвук. Основният материал за приготвяне на липозоми са молекули, описани като „amphilic“, получени от липиди на биологични мембрани или базирани на тях. За образуването на малки униламеларни везикули (SUV) липидната дисперсия се подлага на щадяща ултразвукова обработка – например с ръчния ултразвуков апарат UP50H (50W, 30kHz), VialTweeter или ултразвуковия реактор CupHorn – в ледена баня. Продължителността на такава ултразвукова обработка е приблизително 5 – 15 минути. Друг метод за производство на малки униламеларни везикули е ултразвуковата обработка на липозоми, представляващи мултиламеларни везикули.
Dinu-Pirvu et al. (2010) съобщават за получаване на трансферозоми чрез ултразвукова обработка на MLV при стайна температура.
Hielscher Ultrasonics предлага различни ултразвукови апарати, сонотроди и принадлежности и по този начин може да предостави най-подходящата ултразвукова конфигурация за високоефективно капсулиране в липозоми във всякакъв мащаб.

Ултразвуково капсулиране на активни вещества в липозоми

Липозомите служат като носители на активни съставки като витамини, терапевтични молекули, пептиди и др. Ултразвукът е ефективен инструмент за приготвяне и образуване на липозоми за включване на активни агенти. Същевременно ултразвуковата обработка подпомага процеса на капсулиране и включване, така че се произвеждат липозоми с високо натоварване с активни съставки. Преди капсулирането липозомите са склонни да образуват клъстери поради взаимодействието между повърхностните заряди на полярните глави на фосфолипидите (вж. Míckova et al. 2008); освен това те трябва да бъдат отворени. Например Zhu et al. (2003) описват капсулирането на биотин на прах в липозоми чрез ултразвукова обработка. След добавянето на биотина на прах към разтвора с везикуларната суспензия разтворът е подложен на ултразвукова обработка. След тази обработка биотинът е включен в липозомите.
Прочетете повече за ултразвуковото капсулиране на GLP-1 „peptrides“ (например семаглутид) в липозоми!

Липозомни емулсии чрез ултразвукова обработка

За да се засили подхранващият ефект на овлажняващи кремове или кремове против стареене, лосиони, гелове и други козмецевтични формулировки, към липозомните дисперсии се добавят емулгатори за стабилизиране на по-големи количества липиди. Изследванията обаче показват, че капацитетът на липозомите като цяло е ограничен. При добавянето на емулгатори този ефект ще се прояви по-рано, а допълнителните емулгатори отслабват афинитета на фосфатидилхолина към кожната бариера. Наночастиците – съставени от фосфатидилхолин и липиди – са отговорът на този проблем. Тези наночастици се образуват от маслена капка, покрита с монослой от фосфатидилхолин. Използването на наночастици позволява получаването на формулировки, които могат да поемат повече липиди и да останат стабилни, така че не са необходими допълнителни емулгатори.
Ултразвуковата обработка е доказан метод за производство на наноемулсии и нанодисперсии. Ултразвукът с много висок интензитет осигурява мощността, необходима за диспергиране на течна фаза (дисперсна фаза) под формата на малки капки във втора фаза (непрекъсната фаза). В зоната на диспергиране имплодиращите кавитационни мехурчета предизвикват интензивни ударни вълни в околната течност и водят до образуването на течни струи с висока скорост. За да се стабилизират новообразуваните капки на дисперсната фаза срещу коалесценция, към емулсията се добавят емулгатори (повърхностноактивни вещества, ПАВ) и стабилизатори. Тъй като коалесценцията на капките след раздробяването влияе върху крайното разпределение на капките по размер, се използват ефективно стабилизиращи емулгатори, за да се поддържа крайното разпределение на капките по размер на ниво, равно на разпределението непосредствено след раздробяването на капките в зоната на ултразвуково диспергиране.

Липозомни дисперсии чрез ултразвукова обработка

Липозомните дисперсии, базирани на ненаситен „phosphatidylchlorine“, имат недостатъчна устойчивост на окисление. Стабилизирането на дисперсията може да се постигне чрез антиоксиданти, например чрез комплекс от витамини C и E.
 

Образуване на липозоми чрез метода на изпаряване в обратна фаза с ултразвукова обработка

 
Ortan et al. (2002) постигат добри резултати в своето изследване върху ултразвуковото приготвяне на етерично масло от Anethum graveolens в липозоми. След ултразвуковата обработка размерите на липозомите са между 70–150 nm, а на MLV – между 230–475 nm; тези стойности остават приблизително постоянни и след 2 месеца, но се увеличават след 12 месеца, особено при дисперсията на SUV (вж. хистограмите по-долу). Измерването на стабилността по отношение на загубата на етерично масло и разпределението по размер също показва, че липозомните дисперсии запазват съдържанието на летливо масло. Това предполага, че включването на етеричното масло в липозоми увеличава стабилността на маслото.

Ortan et al. (2009): Стабилност на дисперсии на MLV и SUV след 1 година. Липозомните формулировки са съхранявани при 4±1 ºC.

Ултразвуковите процесори на Hielscher са идеалните устройства за приложения в козметичната и фармацевтичната промишленост. Системи, състоящи се от няколко ултразвукови процесора с мощност до 16 000 вата всеки, осигуряват капацитета, необходим за превръщането на това лабораторно приложение в ефективен производствен метод за получаване на фино диспергирани емулсии в непрекъснат поток или на партиди – като се постигат резултати, сравними с тези на най-добрите налични днес хомогенизатори под високо налягане, например такива с клапани с дроселиращ отвор. Освен тази висока ефективност при непрекъснато емулгиране, ултразвуковите апарати на Hielscher изискват много малко поддръжка и са много лесни за работа и почистване. Ултразвукът действително подпомага почистването и изплакването. Ултразвуковата мощност се регулира и може да се адаптира към конкретните продукти и изисквания за емулгиране. Предлагат се и специални реактори с проточни клетки, отговарящи на високите изисквания за CIP (почистване на място) и SIP (стерилизация на място).

Често задавани въпроси за липозомите

Какви видове липозоми се разграничават?

Липозомите се класифицират в различни видове според размера си и броя на бислоевете, които съдържат. Тези категории включват:

• Малки униламеларни везикули (SUV): Това са най-малките липозоми с един липиден бислой.
• Големи униламеларни везикули (LUV): По-големи от SUV, те също имат един бислой.
• Мултиламеларни везикули (MLV): Те съдържат множество концентрични бислоеве.
• Мултивезикуларни везикули (MVV): Те са съставени от множество по-малки везикули в една по-голяма везикула.

 
Други специализирани видове включват:

• ПЕГилирани липозоми: Липозоми, модифицирани с полиетиленгликол (PEG) за повишаване на стабилността и удължаване на времето на циркулация.
• Нанолипозоми: Много малки липозоми, обикновено използвани за целево доставяне на лекарства.

Какви везикуларни структури могат да имат липозомите?

Липозомите допълнително се категоризират според везикуларната си структура в седем основни вида:

• Големи мултиламеларни везикули (MLV): Съдържат множество бислоеве.
• Олиголамеларни везикули (OLV): Имат няколко бислоя.
• Малки униламеларни везикули (SUV): Най-малките, с един бислой.
• Униламеларни везикули със среден размер (MUV): С междинен размер и един бислой.
• Големи униламеларни везикули (LUV): По-големи, с един бислой.
• Гигантски униламеларни везикули (GUV): Много големи, с един бислой.
• Мултивезикуларни везикули (MVV): Множество везикули в една голяма везикула.

Какви са разликите между липозомите и ниозомите?

Липозомите и ниозомите се различават главно по своя състав:
Липозоми: Изградени от фосфолипиди с две вериги, които могат да бъдат неутрални или заредени.
Ниозоми: Изградени от незаредени повърхностноактивни вещества с една верига и холестерол.
И двете структури се образуват чрез ултразвукова обработка, която подпомага самоорганизацията на двуслойните везикули.

Какъв е идеалният размер на една липозома?

За доставяне на терапевтични вещества идеалният размер на липозомата теоретично е между 50 и 200 нанометра в диаметър. Този диапазон на размерите оптимизира стабилността и бионаличността. Ултразвуковата обработка обикновено се използва за намаляване на везикулата до желания размер.

Могат ли липозомите да пренасят хидрофилни лекарства?

Да, липозомите могат да пренасят хидрофилни лекарства. Те са ценени в биомедицинските приложения заради способността си да капсулират както хидрофобни, така и хидрофилни агенти. Освен това те предлагат висока биосъвместимост и биоразградимост, което ги прави ефективни системи за доставяне.

Как се приготвят липозоми?

Най-разпространените техники за приготвяне на липозоми са методът на тънкия филм и методът на изпаряване в обратна фаза.
Метод на хидратация на тънък филм:

1. Разтворете липидите в органичен разтворител.
2. Изпарете разтворителя, за да се образува тънък липиден филм.
3. Хидратирайте филма с воден разтвор чрез ултразвукова обработка, за да се образуват мултиламеларни везикули.

Метод на изпаряване в обратна фаза:

1. Разтворете липидите във вода и етанол.
2. Подложете разтвора на ултразвукова обработка при 60°C за около 10 минути, за да се получи липидна паста.
3. Охладете липидната суспензия и добавяйте вода или буферен разтвор капка по капка при разбъркване.
4. Хидратирайте суспензията за 1 час, за да се образуват мултиламеларни везикули.
5. Намалете размера на липозомите чрез допълнителна ултразвукова обработка.

Какво представляват археозомите?

Археозомите са липозоми, изградени от липиди на археи, които са известни със своята стабилност и устойчивост на екстремни условия. Тези свойства правят археозомите особено полезни за доставяне на лекарства и разработване на ваксини в условия на неблагоприятна среда.

Как се приготвят археозомите?

Процедура за ултразвукова обработка според Pise (2022): Археозомите могат да се приготвят от полярната липидна фракция „PLF“ на Sulfolobussolfataricus чрез ултразвукова обработка при 60°C, без да е необходимо добавяне на липиди от външен източник. При 0°C полярните липиди от Sulfolobusacidocaldarius са подложени на ефективна ултразвукова обработка за образуване на археозоми. Археозоми, натоварени с BMD, и конвенционални липозоми, както и липиди на археи, изолирани от Archaea H. salinarum и обогатени с фосфатидилхолин, са приготвени чрез техники на ултразвукова обработка. Ултразвуково обработени везикули са създадени за локално доставяне чрез ултразвукова обработка на дисперсии на MLV при 80 процента амплитуда за 4 минути с ултразвуков апарат със сонда Hielscher UP50H (вж. снимката вляво).

Литература/Източници

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.