Подобряване на HPLC анализа чрез надеждна подготовка на пробите
Високоефективната течна хроматография (HPLC) остава една от най-важните аналитични техники за идентифициране и количествено определяне на съединения в сложни матрици. От фармацевтичния контрол на качеството до мониторинга на околната среда и анализа на храни, HPLC методите се ценят заради тяхната чувствителност, селективност и възпроизводимост. Надеждността на хроматографските данни обаче зависи в голяма степен от една важна стъпка: подготовката на пробите с HPLC.
Изследванията и процедурите за подготовка на проби показват, че екстракцията и подготовката на проби с помощта на соникация значително подобряват ефективността, точността и скоростта на HPLC анализа. Чрез използване на ултразвукова енергия за разрушаване на матриците и подобряване на преноса на аналита в разтворителите лабораториите могат да получат по-високо възстановяване, по-кратко време за екстракция и по-възпроизводими аналитични резултати.
Защо подготовката на пробата е от значение при HPLC
В много аналитични работни процеси матрицата на пробата – като растителен материал, биологична тъкан, почва или вода. – съдържа сложни смеси от съединения, които могат да попречат на хроматографското разделяне. Затова е необходима ефективна подготовка на пробата, за да се изолират аналитите, да се отстранят смущаващите вещества и да се концентрират целевите съединения преди инжектиране в системата HPLC.
Традиционните техники за екстракция често включват продължителни процедури, големи обеми органични разтворители и множество стъпки за почистване. Тези методи могат да внесат променливост, да увеличат оперативните разходи и да удължат общото време за анализ.
Ултразвуковата подготовка на пробите предлага ефективна алтернатива. Соникацията въвежда високочестотна акустична енергия в течна среда, като създава микроскопични кавитационни мехурчета. Когато тези мехурчета се разрушат, те генерират локални сили на срязване и ефекти на микросмесване, които разрушават твърдите матрици и ускоряват масовия трансфер. Този процес значително повишава ефективността на екстракцията.
UIP400MTP високопроизводителен ултразвуков уред със стойка за тръби за флакони за автосамплер
Научни доказателства: Соникацията подобрява аналитичните резултати
Няколко рецензирани проучвания показват предимствата на ултразвуковата екстракция в работните процеси на HPLC.
Например в метод, разработен за мониторинг на остатъци от пестициди във водни проби, се използва сониране в комбинация с LC-MS/MS анализ за определяне на концентрациите на пестицида карбарил. При този подход водните проби се екстрахират с ацетонитрил при ултразвукова обработка преди хроматографския анализ. Методът постигна високи аналитични резултати, включително възстановяване между 89,53 % и 101,72 %, което потвърждава точността и надеждността на процедурата за подготовка на пробите с ултразвук.
Стъпката на екстракция с ултразвук позволява ефективно прехвърляне на аналитите от водната матрица в органичния разтворител, като намалява консумацията на разтворител и елиминира необходимостта от обширни процедури за почистване. Валидираният аналитичен метод демонстрира отлична линейност, прецизност и граници на количествено определяне, подчертавайки ефективността на звуковата екстракция в съвременните хроматографски работни процеси. (вж. Roudani et al., 2018)
В друго проучване е въведена матрична твърдофазна дисперсия с помощта на ултразвук (UA-MSPD) за определяне на олеуропеин в маслинови листа чрез HPLC анализ. При тази техника растителният прах и сорбционният материал се смесват и след това се излагат на ултразвукови вълни по време на етапа на елуиране. Ултразвукът засилва десорбцията на аналита от повърхността на сорбента, като същевременно подобрява извличането от матрицата на пробата. (вж. Rashidipour и Heydari, 2018)
Оптимизираната ултразвукова процедура доведе до значителни аналитични подобрения, включително:
- Линейни криви на калибриране с R² = 0,9979
- Граници на откриване до 0,03 µg mL-¹
- Степен на възстановяване между 90,2% и 96,7%
Тези резултати потвърждават, че екстракцията с помощта на ултразвук не само ускорява подготовката на пробата, но и увеличава добива на екстракция в сравнение с класическите матрични техники за твърдофазна дисперсия.
Сонден ултразвук UP200St за подготовка на HPLC проби
Основни предимства на ултразвуковата подготовка на проби за HPLC
Все по-широкото разпространение на ултразвуковата екстракция в аналитичните лаборатории се дължи на няколко измерими предимства.
- По-висока ефективност на извличане
Акустичната кавитация разгражда твърдите матрици и подобрява проникването на разтворителя. Това подобрява освобождаването на аналита и повишава степента на възстановяване, особено за съединения на ниво следи в сложни проби. - Намалено време за подготовка на пробите
Ултразвуковата екстракция често може да завърши подготовката на пробата в рамките на секунди или минути. Например оптимизираните параметри на ултразвуковата екстракция в UA-MSPD постигат ефективно възстановяване на аналитите за около 30 секунди сониране, което показва колко драстично могат да бъдат ускорени работните процеси за анализ. - По-ниска консумация на разтворители
Тъй като ултразвукът подобрява масовия трансфер, обикновено са необходими по-малки обеми разтворител. Намаленото използване на разтворители подобрява устойчивостта на лабораторията и намалява оперативните разходи. - Подобрена възпроизводимост
Равномерното разпределение на ултразвуковата енергия осигурява последователно разрушаване и екстракция на пробата в различните повторения, което води до по-голяма прецизност на аналитичните измервания. - Съвместимост със съвременните хроматографски методи
Ултразвуковата екстракция се интегрира лесно с HPLC, UHPLC и LC-MS системи, което я прави подходяща за аналитични среди с висока производителност.
HPLC хроматограма на фенолни съединения от ултразвуково изолиран екстракт от листа на Annona muricata с помощта на ултразвуковия апарат UP400S.
(Проучване и графика: ©Nolasco-González et al., 2022)
Практически решения за соникация за подготовка на проби за HPLC
За лабораториите, прилагащи ултразвукова екстракция, сонаторите на Hielscher осигуряват прецизен контрол на параметрите като амплитуда, време и режим на импулсите. Затова лабораторните сонатори на Hielscher са особено подходящи за аналитични лаборатории.
Изберете най-подходящия лабораторен соникатор за вашите HPLC проби
| Модел Sonicator | Предимства за HPLC | Най-добро използване при подготовката на проби за HPLC |
| Многотръбен соникатор за високи честоти VialTweeter |
- Едновременна соникация на до 10 запечатани флакона с еднаква ултразвукова енергия - Стерилни: няма кръстосано замърсяване, защото пробите остават затворени - Високо възпроизводими условия за екстракция в различните партиди - Ефективна кавитация за аналитични проби с малък обем |
- Високопроизводителна подготовка на проби от околната среда, храни или фармацевтични продукти - Екстракция на аналитични следи преди анализ с HPLC, UHPLC или LC-MS - Стандартизирани работни процеси, изискващи идентична обработка на множество проби |
| Микроплачен ултразвуков UIP400MTP |
- Безконтактно сониране на цели микроплаки (96-ямкови, 384-ямкови формати) - Равномерно разпределение на ултразвуковата енергия във всички кладенци - Позволява автоматизация и роботизирана интеграция на аналитични работни процеси - Висока производителност с прецизен контрол на амплитудата и времето за сониране |
- Високопроизводителни работни процеси за скрининг с UHPLC - Библиотеки от фармацевтични съединения и подготовка на проби за метаболомика - Екстракция на базата на плочи за аналитични тръбопроводи LC-MS или UHPLC |
| Лабораторни соникатори с микронакрайник (директно сониране) |
- Максимален ултразвуков интензитет за ефективно разрушаване на матрицата - Много бързо извличане на аналити от твърди, вискозни или хетерогенни проби - Регулируеми параметри на амплитудата и импулса за оптимизирани условия на екстракция - Високата енергия на кавитация подобрява възстановяването на аналитите и добива на екстракция |
- Извличане от трудни матрици, като растителна тъкан, хранителни проби или полимери - Хомогенизиране преди SPE, филтриране или екстракция течност-течност - Разработване на метод за ултразвукова подготовка на проби с HPLC |
| Cuphorn (“високоинтензивна вана” за чаши и епруветки) |
- Индиректната соникация предотвратява замърсяването на сондата - Равномерно ултразвуково поле за няколко тръби едновременно - Идеален за стерилни, опасни или летливи проби, които трябва да останат запечатани - Опростява работата, като същевременно поддържа силна кавитационна енергия |
- Паралелна екстракция на множество HPLC проби в запечатани центрофужни епруветки - Подготовка на биологични, фармацевтични или екологични проби - Работни процеси, при които се изисква индиректно сониране без замърсяване |
Научно значение за аналитичната химия
Тъй като аналитичната химия се насочва към по-бързи и по-устойчиви лабораторни практики, подготовката на проби с ултразвук се превърна в мощна технология. Соникацията подпомага разработването на бързи аналитични методи с по-ниска консумация на разтворители, подобрена ефективност на екстракцията и стабилни параметри за валидиране.
Нарастващият брой публикации за ултразвуковата екстракция показва, че подготовката на пробите за HPLC с помощта на соникация не е просто удобство. – това е научно утвърден подход, който подобрява аналитичните резултати. Чрез комбиниране на ултразвукова екстракция със съвременни хроматографски техники лабораториите могат да постигнат надеждно откриване на следи от аналити във все по-сложни матрици на пробите.
Работни потоци на HPLC с усилена соникация
С непрекъснатия напредък в аналитичната апаратура и технологиите за подготовка на проби ултразвуковата екстракция вероятно ще играе още по-голяма роля в хроматографските лаборатории. Способността му да рационализира работните процеси, да подобрява качеството на данните и да намалява въздействието върху околната среда съответства добре на развиващите се изисквания на съвременната аналитична наука.
За аналитичните химици и промишлените лаборатории, които се стремят да оптимизират подготовката на HPLC пробите, ултразвуковата екстракция предлага доказано, мащабируемо и научно обосновано решение. Чрез интегриране на ултразвуковото екстрахиране в рутинните протоколи за подготовка на проби лабораториите могат значително да подобрят както ефективността, така и надеждността на хроматографския анализ.
Проектиране, производство и консултиране – Качество, произведено в Германия
Ултразвуковите апарати Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и дизайн. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Тежките условия и взискателните условия се справят лесно с ултразвуковите апарати на Hielscher.
Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високопроизводителните ултразвукови уреди, отличаващи се с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са съвместими с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.
Литература / Препратки
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Често задавани въпроси
Какво е HPLC?
Високоефективната течна хроматография (HPLC) е аналитична техника за разделяне, която се използва за идентифициране, количествено определяне и пречистване на компоненти в смес. При HPLC течна подвижна фаза пренася разтворените аналити през колона, напълнена с неподвижна фаза, под високо налягане. Разликите във взаимодействията между аналитите, стационарната фаза и подвижната фаза водят до разделяне на съединенията при преминаването им през колоната. Детектори като UV-Vis, флуоресцентни или масспектрометрични измерват отделените съединения, което позволява прецизен качествен и количествен анализ.
Какви са видовете течна хроматография?
Течната хроматография може да се класифицира според използвания механизъм на разделяне между аналита, стационарната фаза и подвижната фаза. Най-разпространените видове са хроматография с обърната фаза, при която неполярна стационарна фаза разделя съединенията въз основа на хидрофобни взаимодействия; хроматография с нормална фаза, при която се използва полярна стационарна фаза и съединенията се разделят в зависимост от полярността; йонообменна хроматография, при която заредени стационарни фази разделят анализите въз основа на йонни взаимодействия; и хроматография с изключване на размера, при която молекулите се разделят в зависимост от техния хидродинамичен размер и молекулно тегло. Допълнителните специализирани методи включват афинитетна хроматография и хроматография на хидрофилното взаимодействие (HILIC), които са насочени към специфични молекулни взаимодействия или полярни съединения.
Какви флакони се използват за HPLC?
При HPLC анализите обикновено се използват малки стъклени или полимерни флакони, предназначени за съхраняване на подготвени проби преди инжектиране в хроматографската система. Най-разпространеният формат е 2-милилитровата флаконче за автосемплер, което е съвместимо с повечето HPLC автосемплери. Тези флакони обикновено са изработени от боросиликатно стъкло, за да се осигури химическа устойчивост и минимално взаимодействие с разтворителите и аналитите. В зависимост от вида на пробата, флаконите могат да включват вложки за проби с малък обем, капачки с винт или кримп-връх, както и септи, изработени от материали като PTFE/силикон, за да се запази целостта на пробата.
Какво представляват флаконите за автосемплер?
Флаконите за автосамплер са специализирани контейнери за проби, предназначени за автоматични системи за инжектиране в HPLC и UHPLC инструменти. В тях се съхранява подготвеният разтвор на пробата и се поставят в тавата на автосемплера на инструмента, където системата автоматично изтегля определен обем за инжектиране в хроматографската колона. Флаконите за автосамплер се произвеждат с точни размери, за да се осигури съвместимост с роботизираните игли за вземане на проби и да се сведе до минимум изпаряването, замърсяването или адсорбцията на пробата. Тяхната конструкция позволява възпроизводим, високопроизводителен анализ в съвременните хроматографски лаборатории.
Какви са стъпките в HPLC?
Типичният работен процес на високоефективната течна хроматография (HPLC) се състои от няколко последователни стъпки, които осигуряват надеждно разделяне и откриване на аналитите.
- Първо се извършва подготовка на пробата, за да се разтвори аналитът, да се отстранят частиците и често да се извлекат или концентрират целевите съединения от матрицата на пробата. Тази стъпка може да включва филтриране, разреждане или техники за екстракция, като ултразвукова екстракция, твърдофазна екстракция или течно-течна екстракция.
- След това подготвената проба се поставя във флакон за HPLC и се зарежда в автосемплера. Автосемплерът впръсква точно определен обем от пробата в течащата мобилна фаза.
- След това етапът на подаване на мобилната фаза пренася инжектираната проба през системата с помощта на помпа с високо налягане. Мобилната фаза пренася аналитите през хроматографската колона с контролиран дебит.
- Вътре в хроматографската колона се извършва разделяне. Колоната съдържа стационарна фаза, обикновено опаковани частици с определени химични свойства. Докато аналитите преминават през колоната, те взаимодействат по различен начин с неподвижната и подвижната фаза, в резултат на което се елуират по различно време.
- След разделянето съединенията преминават през детектор, например UV-Vis, флуоресцентен или масспектрометричен детектор. Детекторът измерва наличието и концентрацията на елуиращите съединения и преобразува сигнала в електронни данни.
- Накрая събирането и анализът на данните се извършват с помощта на хроматографски софтуер. Системата генерира хроматограма, в която пиковете съответстват на отделните съединения. Времената на задържане на пиковете помагат за идентифициране на аналитите, докато площите или височините на пиковете позволяват количествено определяне на тяхната концентрация.
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори от лаборатория да индустриален размер.