Подобрете HPLC анализа чрез надеждна подготовка на пробите
Високоефективната течна хроматография (HPLC) остава една от най-важните аналитични техники за идентифициране и количествено определяне на съединения в сложни матрици. От контрола на качеството във фармацевтичната промишленост до мониторинга на околната среда и анализа на храни, HPLC методите са ценени заради своята чувствителност, селективност и възпроизводимост. Надеждността на хроматографските данни обаче зависи в голяма степен от една решаваща стъпка: подготовката на пробите за HPLC.
Изследванията и рутинните процедури за подготовка на проби показват, че екстракцията и подготовката на проби с помощта на ултразвукова обработка значително подобряват ефективността, точността и скоростта на HPLC анализа. Като използват ултразвукова енергия за разрушаване на матриците и засилване на преноса на аналитите в разтворителите, лабораториите могат да постигнат по-високи степени на извличане, по-кратки времена за екстракция и по-възпроизводими аналитични резултати.
Защо подготовката на пробите е важна при HPLC
В много аналитични работни процеси матрицата на пробата – например растителен материал, биологична тъкан, почва или вода – съдържа сложни смеси от съединения, които могат да пречат на хроматографското разделяне. Поради това е необходима ефективна подготовка на пробите, за да се изолират аналитите, да се отстранят пречещите вещества и да се концентрират целевите съединения преди инжектирането в HPLC системата.
Традиционните техники за екстракция често включват продължителни процедури, големи обеми органични разтворители и множество стъпки за пречистване. Тези методи могат да внесат вариабилност, да увеличат оперативните разходи и да удължат общото време за анализ.
Ултразвуковата подготовка на проби предлага ефективна алтернатива. Ултразвуковата обработка въвежда високочестотна акустична енергия в течна среда, като образува микроскопични кавитационни мехурчета. Когато тези мехурчета колапсират, те генерират локализирани сили на срязване и ефекти на микросмесване, които разрушават твърдите матрици и ускоряват масопреноса. Този процес повишава драстично ефективността на екстракцията.
Ултразвуков апарат UIP400MTP с висок капацитет за обработка на проби със статив за виали за автоматичен пробовземач
Научни доказателства: ултразвуковата обработка подобрява аналитичните показатели
Няколко рецензирани научни изследвания са показали предимствата на ултразвуковата екстракция в работните процеси с HPLC.
Например метод, разработен за мониторинг на остатъци от пестициди във водни проби, използва ултразвукова обработка в комбинация с LC–MS/MS анализ за определяне на концентрациите на пестицида карбарил. При този подход водните проби са екстрахирани с ацетонитрил при ултразвукова обработка преди хроматографския анализ. Методът постига високи аналитични показатели, включително степени на извличане между 89,53% и 101,72%, което потвърждава точността и надеждността на процедурата за ултразвукова подготовка на пробите.
Стъпката на ултразвукова екстракция позволява ефективен пренос на аналитите от водната матрица в органичния разтворител, като намалява потреблението на разтворители и премахва необходимостта от обширни процедури за пречистване. Валидираният аналитичен метод показва отлична линейност, прецизност и граници на количествено определяне, което подчертава ефективността на ултразвуковата обработка в съвременните хроматографски работни процеси. (вж. Roudani et al., 2018)
Друго изследване въвежда твърдофазна дисперсия на матрицата с помощта на ултразвук (UA-MSPD) за определяне на олеуропеин в маслинови листа чрез HPLC анализ. При тази техника растителният прах и сорбентът се смесват и след това се подлагат на ултразвукови вълни по време на етапа на елуиране. Ултразвукът засилва десорбцията на аналитите от повърхността на сорбента, като едновременно подобрява екстракцията от матрицата на пробата. (вж. Rashidipour и Heydari, 2018)
Оптимизираната ултразвукова процедура води до значителни подобрения на аналитичните показатели, включително:
- Линейни калибрационни криви с R² = 0,9979
- Граници на откриване, достигащи едва 0,03 µg mL⁻¹
- Степени на извличане между 90,2% и 96,7%
Тези резултати потвърждават, че екстракцията с помощта на ултразвук не само ускорява подготовката на пробите, но и увеличава добива от екстракцията в сравнение с класическите техники за твърдофазна дисперсия на матрицата.
Ултразвуков апарат със сонда UP200St за подготовка на проби за HPLC
Основни предимства на ултразвуковата подготовка на проби за HPLC
Нарастващото използване на ултразвуковата екстракция в аналитичните лаборатории се дължи на няколко измерими предимства.
- По-висока ефективност на екстракцията
Акустичната кавитация разрушава твърдите матрици и подобрява проникването на разтворителя. Това засилва освобождаването на аналитите и повишава степените на извличане, особено при съединения в следови концентрации в сложни проби. - По-кратко време за подготовка на пробите
Ултразвуковата екстракция често може да завърши подготовката на пробите за секунди или минути. Например оптимизираните параметри на ултразвуковата екстракция при UA-MSPD позволяват ефективно извличане на аналитите за около 30 секунди ултразвукова обработка, което показва колко драстично могат да бъдат ускорени аналитичните работни процеси. - По-ниско потребление на разтворители
Тъй като ултразвукът засилва масопреноса, обикновено са необходими по-малки обеми разтворители. Намалената употреба на разтворители подобрява екологичната устойчивост на лабораторията и понижава оперативните разходи. - Подобрена възпроизводимост
Равномерното разпределение на ултразвуковата енергия осигурява еднакво разрушаване на пробите и екстракция при повторните измервания, което води до по-добра прецизност на аналитичните измервания. - Съвместимост със съвременните хроматографски методи
Ултразвуковата екстракция се интегрира лесно с HPLC, UHPLC и LC-MS системи, което я прави подходяща за аналитични среди с висок капацитет за обработка на проби.
HPLC хроматограма на фенолни съединения от екстракт от листа на Annona muricata, изолиран чрез ултразвук с помощта на ултразвуковия апарат UP400S.
(Изследване и графика: ©Nolasco-González et al., 2022)
Практически решения за ултразвукова обработка при подготовката на проби за HPLC
За лабораториите, които внедряват ултразвукова екстракция, ултразвуковите апарати на Hielscher осигуряват прецизен контрол на параметри като амплитуда, време и импулсен режим. Поради това лабораторните ултразвукови апарати на Hielscher са особено подходящи за аналитични лаборатории.
Изберете най-подходящия лабораторен ултразвуков апарат за вашите HPLC проби
| Модел на ултразвуковия апарат | Предимства за HPLC | Най-подходящи приложения при подготовката на проби за HPLC |
| Ултразвуков апарат VialTweeter за множество епруветки |
• Едновременна ултразвукова обработка на до 10 запечатани виали с еднаква ултразвукова енергия • Стерилност: без кръстосано замърсяване, тъй като пробите остават затворени • Условия за екстракция с висока възпроизводимост между партидите • Ефективна кавитация за аналитични проби с малък обем |
• Подготовка на проби от околната среда, храни или фармацевтични продукти с висок капацитет за обработка на проби • Екстракция на аналити в следови концентрации преди HPLC, UHPLC или LC-MS анализ • Стандартизирани работни процеси, изискващи еднаква обработка на множество проби |
| Ултразвуков апарат UIP400MTP за микроплаки |
• Безконтактна ултразвукова обработка на цели микроплаки (формати с 96 и 384 ямки) • Равномерно разпределение на ултразвуковата енергия във всички ямки • Позволява автоматизация и интегриране на роботизирани системи в аналитичните работни процеси • Висок капацитет за обработка на проби с прецизен контрол на амплитудата и времето за ултразвукова обработка |
• Работни процеси за UHPLC скрининг с висок капацитет за обработка на проби • Библиотеки от фармацевтични съединения и подготовка на проби за метаболомика • Екстракция в плаки за аналитични процеси с LC-MS или UHPLC |
| Лабораторни ултразвукови апарати с микровръх (директна ултразвукова обработка) |
• Максимална интензивност на ултразвука за ефективно разрушаване на матрицата • Много бърза екстракция на аналити от твърди, вискозни или хетерогенни проби • Регулируеми параметри на амплитудата и импулсите за оптимизирани условия на екстракция • Високата кавитационна енергия подобрява извличането на аналитите и добива от екстракцията |
• Екстракция от трудни за обработка матрици като растителна тъкан, хранителни проби или полимери • Хомогенизиране преди SPE, филтриране или екстракция течност–течност • Разработване на методи за ултразвукова подготовка на проби за HPLC |
| CupHorn („високоинтензивна вана“ за бехерови чаши и епруветки) |
• Индиректната ултразвукова обработка предотвратява замърсяването на сондата • Равномерно ултразвуково поле за едновременна обработка на множество епруветки • Идеален за стерилни, опасни или летливи проби, които трябва да останат запечатани • Опростява работата, като същевременно поддържа висока кавитационна енергия |
• Паралелна екстракция на множество HPLC проби в запечатани центрофужни епруветки • Подготовка на биологични, фармацевтични проби или проби от околната среда • Работни процеси, при които се изисква индиректна ултразвукова обработка без замърсяване |
Научно значение за аналитичната химия
С преминаването на аналитичната химия към по-бързи и по-устойчиви лабораторни практики ултразвуковата подготовка на проби се превръща в мощна технология, която разкрива нови възможности. Ултразвуковата обработка подпомага разработването на бързи аналитични методи с по-ниско потребление на разтворители, подобрена ефективност на екстракцията и надеждни параметри на валидирането.
Нарастващият обем научна литература за ултразвуковата екстракция показва, че подготовката на проби за HPLC с помощта на ултразвукова обработка не е просто удобство – тя е научно валидиран подход, който подобрява аналитичните показатели. Чрез съчетаване на ултразвукова екстракция със съвременни хроматографски техники лабораториите могат да постигнат надеждно откриване на аналити в следови концентрации във все по-сложни матрици на пробите.
HPLC работни процеси, подобрени чрез ултразвукова обработка
С непрекъснатия напредък на аналитичната апаратура и технологиите за подготовка на проби ултразвуковата екстракция вероятно ще играе още по-голяма роля в хроматографските лаборатории. Способността ѝ да оптимизира работните процеси, да подобрява качеството на данните и да намалява въздействието върху околната среда съответства добре на развиващите се изисквания на съвременната аналитична наука.
За аналитичните химици и промишлените лаборатории, които се стремят да оптимизират подготовката на проби за HPLC, ултразвуковата екстракция предлага доказано, мащабируемо и научно обосновано решение. Като интегрират ултразвуковата обработка в рутинните протоколи за подготовка на проби, лабораториите могат значително да подобрят както ефективността, така и надеждността на хроматографския анализ.
Проектиране, производство и консултиране – качество, произведено в Германия
Ултразвуковите апарати на Hielscher са добре известни със своите най-високи стандарти за качество и проектиране. Здравината и лесната работа позволяват безпроблемното интегриране на нашите ултразвукови апарати в промишлени съоръжения. Ултразвуковите апарати на Hielscher се справят лесно с тежки условия и взискателни среди.
Hielscher Ultrasonics е сертифицирана по ISO компания и поставя специален акцент върху високоефективни ултразвукови апарати, които се отличават с най-съвременна технология и удобство за потребителя. Разбира се, ултразвуковите апарати на Hielscher са в съответствие с CE и отговарят на изискванията на UL, CSA и RoHs.
Литература / Източници
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Често задавани въпроси
Какво е HPLC?
Високоефективната течна хроматография (HPLC) е аналитична техника за разделяне, използвана за идентифициране, количествено определяне и пречистване на компоненти в смес. При HPLC течна подвижна фаза пренася разтворените аналити под високо налягане през колона, запълнена с неподвижна фаза. Разликите във взаимодействията между аналитите, неподвижната фаза и подвижната фаза водят до разделяне на съединенията при преминаването им през колоната. Детектори, например UV-Vis, флуоресцентни или масспектрометрични, измерват разделените съединения, което позволява прецизен качествен и количествен анализ.
Какви са видовете течна хроматография?
Течната хроматография може да се класифицира според механизма на разделяне, основан на взаимодействията между аналита, неподвижната фаза и подвижната фаза. Най-разпространените видове са обратнофазова хроматография, при която неполярна неподвижна фаза разделя съединенията въз основа на хидрофобни взаимодействия; нормалнофазова хроматография, която използва полярна неподвижна фаза и разделя съединенията според полярността; йонообменна хроматография, при която заредени неподвижни фази разделят аналитите въз основа на йонни взаимодействия; и размерно-изключваща хроматография, която разделя молекулите според техния хидродинамичен размер и молекулна маса. Допълнителните специализирани методи включват афинитетна хроматография и хроматография с хидрофилни взаимодействия (HILIC), които са насочени към специфични молекулни взаимодействия или полярни съединения.
Какви виали се използват за HPLC?
При HPLC анализите обикновено се използват малки стъклени или полимерни виали, предназначени да съдържат подготвените проби преди инжектирането им в хроматографската система. Най-разпространеният формат е виалата с обем 2-mL за автоматичен пробовземач, която е съвместима с повечето автоматични пробовземачи за HPLC. Тези виали обикновено са изработени от боросиликатно стъкло, за да осигурят химическа устойчивост и минимално взаимодействие с разтворителите и аналитите. В зависимост от вида на пробата виалите могат да включват вложки за проби с малък обем, затваряне с винтови капачки или капачки за кримпване и септи от материали като PTFE/силикон, за да се запази целостта на пробата.
Какво представляват виалите за автоматичен пробовземач?
Виалите за автоматичен пробовземач са специализирани съдове за проби, предназначени за автоматизирани системи за инжектиране в HPLC и UHPLC апаратура. Те съдържат подготвения разтвор на пробата и се поставят в поставката на автоматичния пробовземач на апарата, откъдето системата автоматично изтегля определен обем за инжектиране в хроматографската колона. Виалите за автоматичен пробовземач се произвеждат с точни размери, за да осигурят съвместимост с роботизираните игли за вземане на проби и да сведат до минимум изпаряването, замърсяването или адсорбцията на пробата. Тяхната конструкция позволява възпроизводим анализ с висок капацитет за обработка на проби в съвременните хроматографски лаборатории.
Какви са стъпките при HPLC?
Типичният работен процес на високоефективната течна хроматография (HPLC) се състои от няколко последователни стъпки, които осигуряват надеждно разделяне и откриване на аналитите.
- Първо се извършва подготовка на пробата, за да се разтвори аналитът, да се отстранят твърдите частици и често да се екстрахират или концентрират целевите съединения от матрицата на пробата. Тази стъпка може да включва филтриране, разреждане или техники за екстракция като ултразвукова екстракция, твърдофазна екстракция или екстракция течност–течност.
- След това подготвената проба се поставя във виала за HPLC и се зарежда в автоматичния пробовземач. Автоматичният пробовземач инжектира точен обем от пробата в потока на подвижната фаза.
- След това, на етапа на подаване на подвижната фаза, инжектираната проба се пренася през системата с помощта на помпа за високо налягане. Подвижната фаза пренася аналитите през хроматографската колона при контролиран дебит.
- Разделянето се извършва вътре в хроматографската колона. Колоната съдържа неподвижна фаза, обикновено плътно насипани частици с определени химични свойства. При преминаването през колоната аналитите взаимодействат по различен начин с неподвижната и подвижната фаза, което води до елуирането им в различни моменти.
- След разделянето съединенията преминават през детектор, например UV-Vis, флуоресцентен или масспектрометричен детектор. Детекторът измерва наличието и концентрацията на елуиращите съединения и преобразува сигнала в електронни данни.
- Накрая събирането и анализът на данните се извършват с помощта на хроматографски софтуер. Системата генерира хроматограма, в която пиковете съответстват на отделни съединения. Времената на задържане на пиковете помагат за идентифициране на аналитите, а площите или височините на пиковете позволяват количествено определяне на тяхната концентрация.
Hielscher Ultrasonics произвежда високоефективни ултразвукови хомогенизатори с размери от лабораторни до промишлени.