Sonication-Подпомага агробактерия-медиирана трансформация (SAAT) е ефикасен метод за заразяване на растителни клетки с чужди гени, използващи Agrobacterium като транспортер. Ултразвуковата кавитация причинява сонопорация, която може да бъде описана като целенасочена микро-рана на растителна тъкан. Чрез тези ултразвуково създава микро-рани, ДНК и ДНК вектори могат да бъдат ефективно транспортирани в клетъчната матрица.

сонопорация – Ултразвуково подобрена трансформация на клетките

Когато нискочестотният ултразвук (прибл. 20kHz) се прилага върху клетъчните суспензии, ефектите на акустичната кавитация причиняват преходна мембранна пермеабилизация върху клетъчните тъкани. Този ултразвуков ефект е известен като сонопорация и се използва за генен трансфер в клетки или тъкани.
Предимствата на ултразвука се основават на неговия нетермичен механичен принцип на работа, което прави ултразвука често по-универсален и по-малко зависим от типовете клетки. Универсалното прилагане на сонопорацията отваря възможността за използване на трансгенни растения, които имат значителен потенциал в биопроизводството на сложни човешки терапевтични протеини. Такива биореактори на растителна основа могат да бъдат лесни генетично манипулирани, да предотвратят потенциалното замърсяване с човешки патогени, да не повредят трансформацията посреднически бактерии (например Агробактерия), и са евтин, ефикасен метод за био-синтез.

Ултразвукова подпомогната клетъчна трансформация

Sonication е техника, която прилага нискочестотни ултразвукови вълни за агитация на частици в разтвор, за смесване на разтвори, като по този начин се увеличава скоростта на масов трансфер и разтваряне. Едновременно с това ултразвукът може да отстрани разтворените газове от течностите. При растително-трансформацията ултразвукът ще предизвика образуването на микродуми върху растителната тъкан и ще засили доставката на гола ДНК в растителния протопласт.

За генетична трансформация, подпомаганата от Sonication Agrobacterium-медиирана Трансформация (SAAT) е предпочитаният метод и има значително по-висока ефективност от ултразвука, използван за прехвърляне на голи ДНК и ДНК вектори директно в протоплазта. Многобройни проучвания са доказали, че sonication подпомага Agrobacterium-медиирана трансформация (SAAT) може да се използва за предизвикване на механични смущения и образуване на рани върху растителни клетки от ултразвукови вълни и получената акустична кавитация. Кратко ултразвуково лечение създава микро-рани на повърхността на обяснения. Тъй като ранените клетки ще позволят проникването на Agrobacterium в по-дълбоката част на растителните тъкани, като по този начин ще се увеличи вероятността растителните клетки да бъдат заразени. Освен това секретираните фенолни съединения засилват трансформацията. Ултразвуково генерираните микро-рани правят експлантното проникване от бактериите също по-осъществимо. SAAT е успешно използван за генетична трансформация при растителни видове, особено считани за устойчиви на Agrobacterium.
Да бъдеш много прост и евтин метод, както и значителното подобрение на Agrobacterium-медииран генен трансфер са основните предимства на SAAT. Отделно от успешното прилагане на SAAT при трансформацията на Chenopodium rubrum L. и Beta vulgaris L., този подход е приложен и при производството на рекомбинантни Escherichia coli див тип топло-лабилен холотоксин и Escherichia coli мутант LT ваксина адюванти в Nicotiana tabacum, при които най-високите системни LT-B-специфични IgG титри бяха открити при птици.
(срв. Лаере и др., 2016 г.; М. Климек-Чодачка и Р. Барански, 2014 г.)

Обща процедура за трансфер на гени чрез сонопорация в растителни клетки

1. Подготовка на генетичния материал: Започнете с подготовката на генетичния материал, който искате да въведете в растителните клетки. Това може да бъде плазмидна ДНК, РНК или други нуклеинови киселини.
2. Изолиране на растителни клетки: Изолирайте растителните клетки, към които искате да се насочите. В зависимост от вашия експеримент, тези клетки могат да бъдат изолирани от растителни тъкани или култури.
3. Клетъчна суспензия: Суспендират се растителните клетки в подходяща среда или буфер. Това е от съществено значение, за да се гарантира, че клетките са здрави и в състояние, благоприятстващо усвояването на гените.
4. Настройте вашия Sonicator: Подгответе вашия сонда тип соникатор чрез ултразвук предварително задаване на параметри като амплитуда, време, енергия и температура. Потопете ултразвуковата сонда в клетъчната суспензия.
5. Звукообработването: Започнете процедурата с ултразвук. Бързото колебание на върха на сондата генерира кавитационни мехурчета в течността. Тези мехурчета се разширяват и колапсират поради ултразвуковите вълни, създавайки механични сили и микрострийминг в окачването.
6. Sonoporation: Механичните сили и микростриймингът, генерирани от кавитацията, създават временно пори и дупки в мембраните на растителните клетки. Генетичният материал, присъстващ в суспензията, може да влезе в растителните клетки през тези пори.
7. Инкубация: След сонопорното третиране инкубирайте растителните клетки, за да им позволите да се възстановят и стабилизират мембраните си. Това е решаваща стъпка за осигуряване на оцеляването на клетките и успешния трансфер на гени.

Трансфер на гени чрез Agrobacterium или липозоми

Има две общи форми за трансфектиране на растителна клетка. Те използват или agrobacterium, род Грам-отрицателни бактерии, или липозоми като носител на генетичния материал.

• Agrobacterium-медиирана сонопорация: Agrobacterium tumefaciens е бактерия, която обикновено се използва в генното инженерство на растенията. При този метод плазмидната ДНК, съдържаща желания ген, се въвежда в Agrobacterium, която след това се смесва с растителни клетки. Клетъчната суспензия се подлага на сонопорация с помощта на сонда тип соникатор. Ултразвуковата енергия подобрява трансфера на генетичния материал от Agrobacterium към растителните клетки. Този метод се използва широко за генетична модификация на растенията.
• Липозомно-медиирана сонопорация: Липозомите са липидни везикули, които могат да носят генетичен материал. При този метод липозомите, натоварени с плазмидна ДНК или други нуклеинови киселини, се смесват с растителни клетки. Sonoporation с помощта на сонда тип соникатор се използва за улесняване на усвояването на липозоми от растителни клетки. Ултразвукът нарушава липидните бислоеве на липозомите, освобождавайки генетичния материал в растителните клетки. Този подход е полезен за преходни изследвания на генната експресия в растителните клетки.

Научно доказани ползи от sonication-подпомага агробактерия-медиирана трансформация (SAAT)

По отношение на множество растителни видове е приложена подпомагана от sonication Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT). Краткото и сравнително леко ултразвуково лечение на растителни клетъчни култури причинява сонопориране, което впоследствие позволява дълбоко проникване на Agrobacterium като генен транспортер. По-долу можете да прочетете примерни проучвания, демонстриращи полезните ефекти на SAAT.

Ултразвуково подпомогната трансформация на Ашваганда

За да се подобри ефективността на трансформацията в W. somnifera (известен като ashwagandha или зимна череша), Dehdashti и колеги (2016) изследва използването на ацетозирингон (AS) и ултразвук.
Ацетозирингон (AS) е добавен на три етапа: Агробактериум течна култура, Агробактериум инфекция и ко-култура на обяснения с Agrobacterium. Установено е, че добавянето на 75 μM AS към Агробактериевата течна култура е оптимално за индукция на вир гени.
Допълнителното прилагане на ултразвук (SAAT) доведе до най-висока генна експресия. Генният израз gusA в космати корени е установено, че е най-добър, когато листата и стреля съвети са били ултразвукови съответно за 10 и 20s. Ефективността на трансформацията на подобрения протокол е отчетена съответно 66,5 и 59,5% в случай на обяснения за накрайници за листа и изстрели. Когато се сравнява с други протоколи ефективността на трансформацията на този подобрен протокол е установено, че е 2.5 гънка по-висока за листа и 3.7 сгънете повече за съвети за снимане. Южните блут анализи потвърдиха 1–2 копия на трансгена gusA в линиите W1-W4, докато в линията W5 бяха открити 1–4 трансгенни копия, генерирани от подобрения протокол.

Ефект на продължителността на sonication подпомага Агробактерия- медиирана трансформация (SAAT) върху трансформация честота на W. somnifera лист (а) и стреля връх б) обяснения
(проучване и графика: © Dehdashti et al., 2016)

Ултразвуково подпомагана трансформация на памука

Hussain et al. (2007) демонстрира полезните ефекти на sonication подпомага памучна трансформация. Акустичната кавитация, причинена от нискочестотния ултразвук, създава микро-рани върху и под повърхността на растителната тъкан (сонопорация) и позволява на Agrobacterium да пътува по-дълбоко и напълно по цялата растителна тъкан. Тази ранителна мода увеличава вероятността от заразяване на растителни клетки, които са в по-дълбоко в тъканта. За да се оцени ефективността на трансформацията на SAAT, е измерена генната експресия на GUS. Системата за репортери на GUS е репортерска генна система, особено полезна в растителната молекулярна биология и микробиология. Настройвайки различни параметри на SAAT, GUS преходен израз в памука, използвайки зрели ембриони като експлант, беше значително подобрен. GUS за първи път е засякъл 24h след инкубация на обясненията и с 48ч, GUS изразът е много интензивен, който служи като полезен показател за успешна трансформация на памучния експлант след ултразвукова помощ Agrobacterium медиирана трансформация (SAAT). Сравнението на различни техники за трансформация (а именно биолистична, Агро, БААТ, SAAT), подпомагана от ултразвук Агробактерия-медиирана трансформация (SAAT) показа несравнено най-добрите резултати от трансформацията.

Избор на процедура по преобразуване въз основа на преходно изразяване на GUS. Подпомаганата от ултразвук Агробактерия медиирана трансформация (SAAT) показва значително по-висок преходен израз.
(проучване и графика: © Hussain et al., 2007)

Високопроизводителни ултразвукови решения за сонопорация и SAAT

Hielscher Ultrasonics е дългогодишен опит в разработването и производството на високопроизводителни ултразвукови средства за лаборатории, изследователски съоръжения, както и промишлено производство с много високи пропускателни продукти. За микробиологията и науката за живота, Hielscher предлага различни решения за настаняване на различни изисквания, необходими за специфични тъкани и техните лечения. За едновременното ултразвукиране на множество проби Hielscher предлага UIP400MTP за мултиуел плочи, VialTweeter за ултразвук на до 10 флакона (напр., Епендорф тръби) или ултразвуковата CupHorn. Ultrasonicators тип сонда се предлагат от 50 до 400 вата като лабораторни хомогенизатори, докато промишлените системи покриват обхвата на мощността от 500 вата до 16kW.
Моля, свържете се с нас и ни уведомете за вашите изисквания за кандидатстване и процес. Нашият добре опитен персонал ще се радва да препоръча най-подходящия ultrasonicator за вашия биологичен процес.
Таблицата по-долу дава индикация за приблизителната капацитет за преработка на нашите ultrasonicators: