Генетична трансформация в растителни клетки с помощта на ултразвук

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) е ефективен метод за заразяване на растителни клетки с чужди гени, използвайки Agrobacterium като транспортер. Ултразвуковата кавитация причинява сонопорация, която може да се опише като целенасочено микронараняване на растителната тъкан. Чрез тези ултразвукови създават микрорани, ДНК и ДНК векторите могат ефективно да бъдат транспортирани в клетъчната матрица.

Сонопорация – Ултразвуково подобрена клетъчна трансформация

Когато нискочестотен ултразвук (приблизително 20kHz) се прилага върху клетъчните суспензии, ефектите на акустичната кавитация причиняват преходна мембранна пермеабилизация върху клетъчните тъкани. Този ултразвуков ефект е известен като сонопорация и се използва за трансфер на гени в клетки или тъкани.
Предимствата на ултразвука се основават на нейния нетермичен механичен принцип на работа, което прави ултразвука често по-гъвкав и по-малко зависим от типовете клетки. Многостранното приложение на сонопорацията отваря възможността за използване на трансгенни растения, които имат значителен потенциал в биопроизводството на сложни човешки терапевтични протеини. Такива биореактори на растителна основа могат лесно да бъдат генетично манипулирани, да предотвратяват потенциалното замърсяване с човешки патогени, да не увреждат медииращите трансформацията бактерии (напр. Agrobacterium) и са евтин, ефикасен метод за биосинтез.

Ултразвукова клетъчна трансформация

Соникацията е техника, която прилага нискочестотни ултразвукови вълни за разбъркване на частици в разтвор, за смесване на разтвори, като по този начин се увеличава скоростта на пренос и разтваряне на маса. Едновременно с това ултразвукът може да премахне разтворените газове от течностите. При трансформацията на растенията ултразвукът ще причини образуването на микрорани върху растителната тъкан и ще подобри доставката на гола ДНК в растителния протопласт.

За генетичната трансформация Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) е предпочитаният метод и има значително по-висока ефективност от ултразвука, използван за прехвърляне на гола ДНК и ДНК вектори директно в протопласта. Многобройни проучвания показват, че субстицираната от ултразвук Agrobacterium-медиирана трансформация (SAAT) може да се използва за индуциране на механични смущения и образуване на рани по растителните клетки чрез ултразвукови вълни и произтичащата от това акустична кавитация. Кратко ултразвуково лечение създава микрорани на повърхността на експлантите. Тъй като ранените клетки ще позволят проникването на Agrobacterium в по-дълбоката част на растителните тъкани, като по този начин увеличават вероятността от заразяване на растителните клетки. Освен това секретираните фенолни съединения подобряват трансформацията. Ултразвуково генерираните микрорани правят проникването на бактерии също по-осъществимо. SAAT се използва успешно за генетична трансформация при растителни видове, особено считани за резистентни към Agrobacterium.
Тъй като е много прост и евтин метод, както и значителното подобряване на Agrobacterium-медиирания трансфер на гени са основните предимства на SAAT. Освен успешното приложение на SAAT при трансформацията на Chenopodium rubrum L. и Beta vulgaris L., този подход е приложен и при производството на рекомбинантен топлолабилен холотоксин от див тип Escherichia coli и мутантни LT адюванти от ваксината Escherichia coli в Nicotiana tabacum, при които при птици са открити най-високите системни LT-B-специфични IgG титри.
(срв. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka и R. Baranski, 2014)

Обща процедура за трансфер на гени чрез сонопорация в растителни клетки

1. Подготовка на генетичен материал: Започнете с подготовката на генетичния материал, който искате да въведете в растителните клетки. Това може да бъде плазмидна ДНК, РНК или други нуклеинови киселини.
2. Изолиране на растителни клетки: Изолирайте растителните клетки, към които искате да се насочите. В зависимост от вашия експеримент, тези клетки могат да бъдат изолирани от растителни тъкани или култури.
3. Клетъчна суспензия: Суспендирайте растителните клетки в подходяща среда или буфер. Това е от съществено значение, за да се гарантира, че клетките са здрави и в състояние, благоприятно за усвояването на гените.
4. Настройте вашия Sonicator: Подгответе вашия сонден тип ултразвук чрез предварително зададени параметри на ултразвука като амплитуда, време, енергия и температура. Потопете ултразвуковата сонда в клетъчната суспензия.
5. Уникиране: Стартирайте процедурата за ултразвук. Бързото трептене на върха на сондата генерира кавитационни мехурчета в течността. Тези мехурчета се разширяват и свиват поради ултразвуковите вълни, създавайки механични сили и микрострийминг в суспензията.
6. Сонопорация: Механичните сили и микропотокът, генерирани от кавитацията, временно създават пори и дупки в мембраните на растителните клетки. Генетичният материал, присъстващ в суспензията, може да навлезе в растителните клетки през тези пори.
7. Инкубация: След сонопорационното лечение инкубирайте растителните клетки, за да им позволите да се възстановят и стабилизират мембраните си. Това е решаваща стъпка за осигуряване на оцеляване на клетките и успешен трансфер на гени.

Трансфер на гени чрез агробактерии или липозоми

Има две често срещани форми за трансфектиране на растителна клетка. Те използват или agrobacterium, род грам-отрицателни бактерии, или липозоми като носител на генетичния материал.

• Агробактерия-медиирана сонопорация: Agrobacterium tumefaciens е бактерия, която обикновено се използва в генното инженерство на растенията. При този метод плазмидната ДНК, съдържаща желания ген, се въвежда в Agrobacterium, която след това се смесва с растителни клетки. Клетъчната суспензия се подлага на сонопорация с помощта на сондов ултразвук. Ултразвуковата енергия засилва преноса на генетичния материал от Agrobacterium към растителните клетки. Този метод се използва широко за генетична модификация на растенията.
• Липозома-медиирана сонопорация: Липозомите са везикули на липидна основа, които могат да носят генетичен материал. При този метод липозоми, заредени с плазмидна ДНК или други нуклеинови киселини, се смесват с растителни клетки. Използва се сонопорация с помощта на сонден тип сонда, за да се улесни поглъщането на липозоми от растителните клетки. Ултразвукът разрушава липидните двуслоеве на липозомите, освобождавайки генетичния материал в растителните клетки. Този подход е полезен за преходни изследвания на генната експресия в растителни клетки.

Научно доказани ползи от подпомаганата от соникация агробактерия-медиирана трансформация (SAAT)

Подпомаганата от Sonication Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) е приложена към множество растителни видове. Кратка и сравнително лека ултразвукова обработка на растителни клетъчни култури причинява сонопорация, която впоследствие позволява дълбоко проникване на Agrobacterium като генен транспортер. По-долу можете да прочетете примерни проучвания, демонстриращи благоприятните ефекти на SAAT.

Ултразвукова трансформация на ашваганда

За да подобрят ефективността на трансформацията в W. somnifera (известен като ашваганда или зимна череша), Dehdashti и колеги (2016) изследват използването на ацетосирингон (AS) и ултразвук.
Ацетосирингон (AS) се добавя на три етапа: течна култура Agrobacterium, инфекция с Agrobacterium и съвместна култура на експланти с Agrobacterium. Установено е, че добавянето на 75 μM AS към течна култура на Agrobacterium е оптимално за индуциране на вир гени.
Допълнителното прилагане на ултразвук (SAAT) доведе до най-висока генна експресия. Установено е, че експресията на гена gusA в косматите корени е най-добра, когато листата и върховете на леторастите са ултразвукани съответно за 10 и 20 секунди. Ефективността на трансформацията на подобрения протокол е регистрирана съответно 66,5 и 59,5% в случай на експланти с листа и върха на издънките. В сравнение с други протоколи е установено, че ефективността на трансформация на този подобрен протокол е 2,5 пъти по-висока за листата и 3,7 пъти повече за върховете на издънките. Анализите на южните блот потвърждават 1–2 копия на трансгена gusA в линиите W1-W4, докато 1–4 трансгенни копия са открити в линията W5, генерирана от подобрения протокол.

Ефект на продължителността на ултразвуковата медиирана трансформация (SAAT) върху честотата на трансформация на листата на W. somnifera (a) и върха на издънките (b)
(проучване и графика: © Dehdashti et al., 2016)

Ултразвукова трансформация на памук

Hussain et al. (2007) демонстрират благоприятните ефекти от трансформацията на памука с помощта на ултразвук. Акустичната кавитация, причинена от нискочестотен ултразвук, създава микрорани върху и под повърхността на растителната тъкан (сонопорация) и позволява на Agrobacterium да пътува по-дълбоко и напълно в растителната тъкан. Този начин на нараняване увеличава вероятността от заразяване на растителни клетки, лежащи по-дълбоко в тъканта. За да се оцени ефективността на трансформацията на SAAT, беше измерена експресията на GUS гена. Репортерната система на GUS е репортерна генна система, особено полезна в молекулярната биология и микробиологията на растенията. Коригиране на различни параметри на SAAT, преходната експресия на GUS в памук, използваща зрели ембриони като експлант, е значително подобрена. GUS е открит за първи път 24 часа след инкубацията на експлантите и до 48 часа експресията на GUS е много интензивна, което служи като полезен индикатор за успешна трансформация на памуковия експлант след ултратерапия, подпомагана от Agrobacterium медиирана трансформация (SAAT). Сравнението на различни техники за трансформация (а именно биолистична, Agro, BAAT, SAAT), подпомагана от ултразвук Agrobacterium-медиирана трансформация (SAAT) показа най-добрите резултати от трансформацията.

Избор на процедура за трансформация на базата на преходен израз на GUS. Подпомогната от соникация Agrobacterium-медиирана трансформация (SAAT) показва значително по-висока преходна експресия.
(проучване и графика: © Hussain et al., 2007)

Високоефективни ултразвукови решения за сонопорация и SAAT

Hielscher Ultrasonics има дългогодишен опит в разработването и производството на високоефективни ултразвукови уреди за лаборатории, изследователски съоръжения, както и за промишлено производство с много висока производителност. За микробиологията и науките за живота Hielscher предлага различни решения, за да отговори на различни изисквания, необходими за специфични тъкани и тяхното третиране. За едновременна ултразвукова обработка на множество проби Hielscher предлага UIP400MTP за многоямкови плаки, VialTweeter за ултразвук на до 10 флакона (напр. епруветки Eppendorf) или ултразвуковия CupHorn. Ултразвуковите апарати тип сонда се предлагат от 50 до 400 вата като лабораторни хомогенизатори, докато индустриалните системи покриват диапазона на мощност от 500 вата до 16kW.
Моля, свържете се с нас и ни уведомете за вашите изисквания за кандидатстване и процес. Нашият опитен персонал ще се радва да препоръча най-подходящия ултразвуков апарат за вашия биологичен процес.
Таблицата по-долу ви дава представа за приблизителния капацитет на обработка на нашите ултразвукови апарати: