Генетична трансформация на растителни клетки с помощта на ултразвук

Трансформацията, медиирана от Agrobacterium и подпомагана от ултразвукова обработка (SAAT), е ефективен метод за инфектиране на растителни клетки с чужди гени, при който Agrobacterium се използва като преносител. Ултразвуковата кавитация причинява сонопорация, която може да се опише като целенасочено образуване на микрорани в растителната тъкан. Чрез тези създадени с ултразвук микрорани ДНК и ДНК вектори могат да бъдат ефективно пренесени в клетъчната матрица.

Сонопорация – клетъчна трансформация, подобрена чрез ултразвук

Когато върху клетъчни суспензии се прилага нискочестотен ултразвук (прибл. 20kHz), ефектите на акустичната кавитация предизвикват временно повишаване на мембранната пропускливост в клетъчните тъкани. Този ултразвуков ефект е известен като сонопорация и се използва за пренос на гени в клетки или тъкани.
Предимствата на ултразвуковата обработка се основават на нейния нетермичен механичен принцип на действие, който често я прави по-универсална и по-малко зависима от типовете клетки. Разнообразните приложения на сонопорацията откриват възможност за използване на трансгенни растения, които имат значителен потенциал за биопроизводство на сложни човешки терапевтични протеини. Такива биореактори на растителна основа могат лесно да бъдат генетично манипулирани, предотвратяват потенциалното замърсяване с човешки патогени, не увреждат бактериите, медииращи трансформацията (напр. Agrobacterium), и представляват евтин и ефективен метод за биосинтез.

Клетъчна трансформация, подпомагана от ултразвук

Ултразвуковата обработка е техника, при която се прилагат нискочестотни ултразвукови вълни за раздвижване на частици в разтвор и смесване на разтвори, като по този начин се увеличава скоростта на масопренос и разтваряне. Същевременно ултразвуковата обработка може да отстранява разтворените газове от течности. При трансформацията на растения ултразвуковата обработка предизвиква образуване на микрорани в растителната тъкан и подобрява доставянето на гола ДНК в растителния протопласт.

За генетична трансформация предпочитаният метод е трансформацията, медиирана от Agrobacterium и подпомагана от ултразвукова обработка (SAAT), която има значително по-висока ефективност от ултразвуковата обработка, използвана за директен пренос на гола ДНК и ДНК вектори в протопласта. Многобройни изследвания показват, че трансформацията, медиирана от Agrobacterium и подпомагана от ултразвукова обработка (SAAT), може да се използва за предизвикване на механично разрушаване и образуване на рани в растителните клетки чрез ултразвукови вълни и получената акустична кавитация. Кратка ултразвукова обработка създава микрорани по повърхността на експлантите. Наранените клетки позволяват проникването на Agrobacterium в по-дълбоките части на растителните тъкани, като по този начин увеличават вероятността за инфектиране на растителните клетки. Освен това секретираните фенолни съединения подобряват трансформацията. Създадените чрез ултразвук микрорани също улесняват проникването на бактерии в експлантите. SAAT е използвана успешно за генетична трансформация на растителни видове, считани за особено устойчиви на Agrobacterium.
Основните предимства на SAAT са, че методът е много прост и евтин, както и че значително подобрява медиирания от Agrobacterium пренос на гени. Освен успешното приложение на SAAT при трансформацията на Chenopodium rubrum L. и Beta vulgaris L., този подход е приложен и при производството в Nicotiana tabacum на рекомбинантен термолабилен холотоксин от див тип на Escherichia coli и ваксинални адюванти на базата на мутантен LT на Escherichia coli, при което най-високите системни титри на LT-B-специфични IgG са установени при птици.
(вж. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka и R. Baranski, 2014)

Обща процедура за пренос на гени чрез сонопорация в растителни клетки

1. Подготовка на генетичния материал: Започнете с подготовката на генетичния материал, който искате да въведете в растителните клетки. Това може да бъде плазмидна ДНК, РНК или други нуклеинови киселини.
2. Изолиране на растителни клетки: Изолирайте растителните клетки, към които искате да насочите обработката. В зависимост от експеримента тези клетки могат да бъдат изолирани от растителни тъкани или култури.
3. Клетъчна суспензия: Суспендирайте растителните клетки в подходяща среда или буфер. Това е от съществено значение, за да се гарантира, че клетките са здрави и в състояние, благоприятстващо поемането на гени.
4. Настройване на ултразвуковия апарат: Подгответе своя ултразвуков апарат със сонда, като предварително зададете параметрите за ултразвукова обработка, като амплитуда, време, енергия и температура. Потопете ултразвуковата сонда в клетъчната суспензия.
5. Ултразвукова обработка: Започнете процедурата за ултразвукова обработка. Бързото трептене на върха на сондата генерира кавитационни мехурчета в течността. Тези мехурчета се разширяват и колабират под въздействието на ултразвуковите вълни, създавайки механични сили и микропотоци в суспензията.
6. Сонопорация: Механичните сили и микропотоците, генерирани от кавитацията, създават временни пори и отвори в мембраните на растителните клетки. Генетичният материал, присъстващ в суспензията, може да навлезе в растителните клетки през тези пори.
7. Инкубация: След обработката чрез сонопорация инкубирайте растителните клетки, за да им позволите да се възстановят и да стабилизират мембраните си. Това е решаваща стъпка за осигуряване на оцеляването на клетките и успешния пренос на гени.

Пренос на гени чрез Agrobacterium или липозоми

Има два често използвани начина за трансфекция на растителни клетки. При тях като носител на генетичния материал се използват или Agrobacterium, род грам-отрицателни бактерии, или липозоми.

• Сонопорация, медиирана от Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens е бактерия, често използвана в генното инженерство на растенията. При този метод плазмидна ДНК, съдържаща желания ген, се въвежда в Agrobacterium, която след това се смесва с растителни клетки. Клетъчната суспензия се подлага на сонопорация с помощта на ултразвуков апарат със сонда. Ултразвуковата енергия подобрява преноса на генетичния материал от Agrobacterium към растителните клетки. Този метод се използва широко за генетично модифициране на растения.
• Сонопорация, медиирана от липозоми: Липозомите са везикули на липидна основа, които могат да пренасят генетичен материал. При този метод липозоми, заредени с плазмидна ДНК или други нуклеинови киселини, се смесват с растителни клетки. Сонопорацията с помощта на ултразвуков апарат със сонда се използва за улесняване на поемането на липозомите от растителните клетки. Ултразвукът разрушава липидните бислоеве на липозомите, освобождавайки генетичния материал в растителните клетки. Този подход е полезен за изследвания на преходната генна експресия в растителни клетки.

Научно доказани предимства на трансформацията, медиирана от Agrobacterium и подпомагана от ултразвукова обработка (SAAT)

Трансформацията, медиирана от Agrobacterium и подпомагана от ултразвукова обработка (SAAT), е прилагана при многобройни растителни видове. Кратка и сравнително щадяща ултразвукова обработка на растителни клетъчни култури причинява сонопорация, която впоследствие позволява дълбоко проникване на Agrobacterium като преносител на гени. По-долу можете да прочетете примерни изследвания, демонстриращи благоприятните ефекти на SAAT.

Трансформация на ашваганда, подпомагана от ултразвук

За да подобрят ефективността на трансформацията при W. somnifera (известна като ашваганда или зимна череша), Dehdashti и колеги (2016) изследват използването на ацетосирингон (AS) и ултразвукова обработка.
Ацетосирингонът (AS) е добавен на три етапа: течна култура на Agrobacterium, инфектиране с Agrobacterium и съвместно култивиране на експланти с Agrobacterium. Установено е, че добавянето на 75 μM AS към течната култура на Agrobacterium е оптимално за индуциране на vir гените.
Допълнителното прилагане на ултразвукова обработка (SAAT) води до най-висока генна експресия. Установено е, че експресията на гена gusA в косматите корени е най-добра, когато листата и връхните части на леторастите са обработени с ултразвук съответно за 10 и 20s. Ефективността на трансформацията при подобрения протокол е отчетена като 66,5 и 59,5% съответно за експланти от листа и връхни части на леторасти. В сравнение с други протоколи е установено, че ефективността на трансформацията при този подобрен протокол е 2,5 пъти по-висока за листата и 3,7 пъти по-висока за връхните части на леторастите. Анализите чрез Southern blot потвърждават 1–2 копия на трансгена gusA в линиите W1-W4, докато в линията W5, получена чрез подобрения протокол, са открити 1–4 копия на трансгена.

Ефект на продължителността на трансформацията, медиирана от Agrobacterium и подпомагана от ултразвукова обработка (SAAT), върху честотата на трансформация на експланти от листа (a) и връхни части на леторасти (b) на W. somnifera
(изследване и графика: © Dehdashti et al., 2016)

Трансформация на памук, подпомагана от ултразвук

Hussain et al. (2007) демонстрират благоприятните ефекти на трансформацията на памук, подпомагана от ултразвукова обработка. Акустичната кавитация, причинена от нискочестотен ултразвук, създава микрорани по и под повърхността на растителната тъкан (сонопорация) и позволява на Agrobacterium да проникне по-дълбоко и изцяло в цялата растителна тъкан. Този начин на нараняване увеличава вероятността за инфектиране на растителните клетки, разположени по-дълбоко в тъканта. За да се оцени ефективността на трансформацията чрез SAAT, е измерена експресията на гена GUS. Репортерната система GUS е система с репортерен ген, особено полезна в молекулярната биология на растенията и микробиологията. Чрез регулиране на различни параметри на SAAT преходната експресия на GUS в памук, при използване на зрели ембриони като експланти, е значително повишена. GUS е открит за първи път 24h след инкубацията на експлантите, а към 48h експресията на GUS е много интензивна, което служи като полезен индикатор за успешна трансформация на памучния експлант след трансформация, медиирана от Agrobacterium и подпомагана от ултразвукова обработка (SAAT). При сравнението на различни техники за трансформация (а именно биолистична, Agro, BAAT, SAAT), трансформацията, медиирана от Agrobacterium и подпомагана от ултразвукова обработка (SAAT), показва далеч най-добрите резултати от трансформацията.

Избор на процедура за трансформация въз основа на преходната експресия на GUS. Трансформацията, медиирана от Agrobacterium и подпомагана от ултразвукова обработка (SAAT), показва значително по-висока преходна експресия.
(изследване и графика: © Hussain et al., 2007)

Високопроизводителни ултразвукови решения за сонопорация и SAAT

Hielscher Ultrasonics има дългогодишен опит в разработването и производството на високопроизводителни ултразвукови апарати за лаборатории, изследователски центрове, както и за промишлено производство с много висок капацитет за обработка. За микробиологията и науките за живота Hielscher предлага разнообразни решения, които отговарят на различните изисквания за конкретни тъкани и тяхната обработка. За едновременна ултразвукова обработка на множество проби Hielscher предлага UIP400MTP за многоямкови плаки, VialTweeter за ултразвукова обработка на до 10 флакона (напр. епруветки Eppendorf) или ултразвуковия CupHorn. Ултразвуковите апарати със сонда обхващат диапазона на мощност от 50 до 400 вата за лабораторни хомогенизатори и от 500 вата до 16 kW за промишлени системи.
Моля, свържете се с нас и ни информирайте за вашето приложение и изискванията към процеса. Нашият опитен персонал с удоволствие ще препоръча най-подходящия ултразвуков апарат за вашия биологичен процес.
Таблицата по-долу дава представа за приблизителния капацитет за обработка на нашите ултразвукови апарати: