Ultrasəs vasitəsilə bitki hüceyrələrində genetik transformasiya

Sonikasiya ilə dəstəklənən Agrobacterium vasitəli transformasiya (SAAT) Agrobacterium-dan daşıyıcı kimi istifadə edərək bitki hüceyrələrini yad genlərlə yoluxdurmaq üçün səmərəli üsuldur. Ultrasəs kavitasiyası sonoporasiyaya səbəb olur; bunu bitki toxumasında məqsədyönlü mikroyaraların yaradılması kimi təsvir etmək olar. Ultrasəslə yaradılan bu mikroyaralar vasitəsilə DNT və DNT vektorları hüceyrə matriksinə səmərəli şəkildə daşına bilər.

Sonoporasiya – ultrasəslə gücləndirilən hüceyrə transformasiyası

Hüceyrə suspenziyalarına aşağı tezlikli ultrasəs (təqribən 20kHz) tətbiq edildikdə, akustik kavitasiyanın təsirləri hüceyrə toxumalarında membran keçiriciliyinin müvəqqəti artmasına səbəb olur. Bu ultrasəs təsiri sonoporasiya adlanır və genlərin hüceyrələrə və ya toxumalara köçürülməsi üçün istifadə edilir.
Ultrasəslə emalın üstünlükləri onun qeyri-termik mexaniki iş prinsipinə əsaslanır; bu, sonikasiyanı çox vaxt daha universal və hüceyrə növlərindən daha az asılı edir. Sonoporasiyanın çoxşaxəli tətbiqi mürəkkəb insan terapevtik zülallarının bioloji istehsalında əhəmiyyətli potensiala malik transgen bitkilərdən istifadə imkanı yaradır. Belə bitki əsaslı bioreaktorlar genetik baxımdan asanlıqla dəyişdirilə bilər, insan patogenləri ilə potensial çirklənmənin qarşısını alır, transformasiyada vasitəçilik edən bakteriyalara (məsələn, Agrobacterium) zərər vermir və biosintezin ucuz, effektiv üsuludur.

Ultrasəslə dəstəklənən hüceyrə transformasiyası

Sonikasiya məhluldakı hissəcikləri hərəkətə gətirmək və məhlulları qarışdırmaq üçün aşağı tezlikli ultrasəs dalğalarından istifadə edən, bununla da kütlə ötürülməsi və həllolma sürətini artıran texnikadır. Eyni zamanda, sonikasiya mayelərdən həll olmuş qazları çıxara bilər. Bitkilərin transformasiyasında sonikasiya bitki toxumasında mikroyaraların yaranmasına səbəb olacaq və sərbəst DNT-nin bitki protoplastına çatdırılmasını gücləndirəcək.

Genetik transformasiya üçün sonikasiya ilə dəstəklənən Agrobacterium vasitəli transformasiya (SAAT) üstünlük verilən üsuldur və sərbəst DNT və DNT vektorlarının birbaşa protoplasta köçürülməsi üçün istifadə olunan sonikasiyadan əhəmiyyətli dərəcədə daha yüksək səmərəliliyə malikdir. Çoxsaylı tədqiqatlar göstərmişdir ki, sonikasiya ilə dəstəklənən Agrobacterium vasitəli transformasiya (SAAT) ultrasəs dalğaları və nəticədə yaranan akustik kavitasiya vasitəsilə bitki hüceyrələrində mexaniki parçalanma və yaraların əmələ gəlməsi üçün istifadə edilə bilər. Qısa ultrasəs emalı eksplantların səthində mikroyaralar yaradır. Yaralanmış hüceyrələr Agrobacterium-un bitki toxumalarının daha dərin hissələrinə nüfuz etməsinə imkan verəcək və beləliklə, bitki hüceyrələrinin yoluxma ehtimalını artıracaq. Bundan əlavə, ifraz olunan fenol birləşmələri transformasiyanı gücləndirir. Ultrasəslə yaradılan mikroyaralar bakteriyaların eksplantlara nüfuz etməsini də daha mümkün edir. SAAT, xüsusilə Agrobacterium-a davamlı hesab olunan bitki növlərində genetik transformasiya üçün uğurla istifadə edilmişdir.
SAAT-ın əsas üstünlükləri çox sadə və ucuz üsul olması, eləcə də Agrobacterium vasitəli gen köçürülməsini əhəmiyyətli dərəcədə gücləndirməsidir. SAAT-ın Chenopodium rubrum L. və Beta vulgaris L. transformasiyasında uğurlu tətbiqindən əlavə, bu yanaşma Nicotiana tabacum-da rekombinant Escherichia coli-nin vəhşi tipli termolabil holotoksininin və Escherichia coli mutant LT vaksin adyuvantlarının istehsalında da tətbiq edilmişdir; bu zaman quşlarda LT-B-yə spesifik sistemik IgG-nin ən yüksək titrləri aşkar edilmişdir.
(bax: Laere və b., 2016; M. Klimek-Chodacka və R. Baranski, 2014)

Bitki hüceyrələrində sonoporasiya vasitəsilə gen köçürülməsinin ümumi proseduru

1. Genetik materialın hazırlanması: Bitki hüceyrələrinə daxil etmək istədiyiniz genetik materialı hazırlamaqla başlayın. Bu, plazmid DNT-si, RNT və ya digər nuklein turşuları ola bilər.
2. Bitki hüceyrələrinin təcrid edilməsi: Hədəfləmək istədiyiniz bitki hüceyrələrini təcrid edin. Təcrübənizdən asılı olaraq, bu hüceyrələr bitki toxumalarından və ya kulturlardan təcrid edilə bilər.
3. Hüceyrə suspenziyası: Bitki hüceyrələrini uyğun mühitdə və ya buferdə suspenziya halına gətirin. Bu, hüceyrələrin sağlam və genlərin qəbuluna əlverişli vəziyyətdə olmasını təmin etmək üçün vacibdir.
4. Sonikatorunuzu sazlayın: Amplituda, vaxt, enerji və temperatur kimi sonikasiya parametrlərini əvvəlcədən təyin edərək zond tipli sonikatorunuzu hazırlayın. Ultrasəs zondunu hüceyrə suspenziyasına batırın.
5. Sonikasiya: Sonikasiya prosedurunu başladın. Zond ucunun sürətli rəqsi mayedə kavitasiya qabarcıqları yaradır. Bu qabarcıqlar ultrasəs dalğalarının təsiri ilə genişlənir və çökür, suspenziyada mexaniki qüvvələr və mikroaxınlar yaradır.
6. Sonoporasiya: Kavitasiyanın yaratdığı mexaniki qüvvələr və mikroaxınlar bitki hüceyrələrinin membranlarında müvəqqəti məsamələr və dəliklər yaradır. Suspenziyada olan genetik material bu məsamələrdən bitki hüceyrələrinə daxil ola bilər.
7. İnkubasiya: Sonoporasiya emalından sonra bitki hüceyrələrini inkubasiya edin ki, onlar bərpa olunsun və membranları sabitləşsin. Bu, hüceyrələrin sağ qalmasını və uğurlu gen köçürülməsini təmin etmək üçün həlledici mərhələdir.

Agrobacterium və ya liposomlar vasitəsilə gen köçürülməsi

Bitki hüceyrələrinin transfeksiyası üçün iki geniş yayılmış üsul mövcuddur. Bu üsullarda genetik materialın daşıyıcısı kimi ya qram-mənfi bakteriyalar cinsi olan Agrobacterium-dan, ya da liposomlardan istifadə edilir.

• Agrobacterium vasitəli sonoporasiya: Agrobacterium tumefaciens bitki gen mühəndisliyində geniş istifadə olunan bakteriyadır. Bu üsulda arzu olunan geni daşıyan plazmid DNT-si Agrobacterium-a daxil edilir, sonra isə Agrobacterium bitki hüceyrələri ilə qarışdırılır. Hüceyrə suspenziyası zond tipli sonikatorla sonoporasiyaya məruz qoyulur. Ultrasəs enerjisi genetik materialın Agrobacterium-dan bitki hüceyrələrinə köçürülməsini gücləndirir. Bu üsul bitkilərin genetik modifikasiyası üçün geniş istifadə edilir.
• Liposom vasitəli sonoporasiya: Liposomlar genetik material daşıya bilən lipid əsaslı vezikullardır. Bu üsulda plazmid DNT-si və ya digər nuklein turşuları ilə yüklənmiş liposomlar bitki hüceyrələri ilə qarışdırılır. Liposomların bitki hüceyrələri tərəfindən qəbulunu asanlaşdırmaq üçün zond tipli sonikatorla sonoporasiyadan istifadə edilir. Ultrasəs liposomların lipid ikiqat təbəqələrini parçalayaraq genetik materialı bitki hüceyrələrinə buraxır. Bu yanaşma bitki hüceyrələrində müvəqqəti gen ekspressiyasının tədqiqi üçün faydalıdır.

Sonikasiya ilə dəstəklənən Agrobacterium vasitəli transformasiyanın (SAAT) elmi cəhətdən sübut olunmuş faydaları

Sonikasiya ilə dəstəklənən Agrobacterium vasitəli transformasiya (SAAT) çoxsaylı bitki növlərinə tətbiq edilmişdir. Bitki hüceyrə kulturlarının qısa və nisbətən yumşaq ultrasəs emalı sonoporasiyaya səbəb olur, bu isə sonradan gen daşıyıcısı kimi Agrobacterium-un dərinə nüfuz etməsinə imkan verir. Aşağıda SAAT-ın faydalı təsirlərini göstərən nümunə tədqiqatları oxuya bilərsiniz.

Aşvaqandanın ultrasəslə dəstəklənən transformasiyası

W. somnifera-da (aşvaqanda və ya qış albalısı kimi tanınır) transformasiya səmərəliliyini yaxşılaşdırmaq üçün Dehdashti və həmkarları (2016) asetosirinqon (AS) və sonikasiyanın istifadəsini araşdırmışlar.
Asetosirinqon (AS) üç mərhələdə əlavə edilmişdir: Agrobacterium-un maye kulturu, Agrobacterium ilə yoluxdurma və eksplantların Agrobacterium ilə birgə kultivasiyası. Agrobacterium-un maye kulturuna 75 μM AS əlavə edilməsinin vir genlərinin induksiyası üçün optimal olduğu müəyyən edilmişdir.
Sonikasiyanın (SAAT) əlavə tətbiqi ən yüksək gen ekspressiyası ilə nəticələnmişdir. Yarpaqlar və zoğ ucları müvafiq olaraq 10 və 20s ərzində sonikasiya edildikdə, tüklü köklərdə gusA geninin ekspressiyasının ən yaxşı olduğu müəyyən edilmişdir. Təkmilləşdirilmiş protokolun transformasiya səmərəliliyi yarpaq və zoğ ucu eksplantları üçün müvafiq olaraq 66,5 və 59,5% qeydə alınmışdır. Digər protokollarla müqayisədə, bu təkmilləşdirilmiş protokolun transformasiya səmərəliliyinin yarpaqlar üçün 2,5 dəfə yüksək, zoğ ucları üçün isə 3,7 dəfə çox olduğu müəyyən edilmişdir. Southern blot təhlilləri W1-W4 xətlərində gusA transgeninin 1–2 nüsxəsini təsdiqləmiş, təkmilləşdirilmiş protokolla yaradılmış W5 xəttində isə transgenin 1–4 nüsxəsi aşkar edilmişdir.

Sonikasiya ilə dəstəklənən Agrobacterium vasitəli transformasiyanın (SAAT) müddətinin W. somnifera yarpaq (a) və zoğ ucu (b) eksplantlarının transformasiya tezliyinə təsiri
(tədqiqat və qrafik: © Dehdashti və b., 2016)

Pambığın ultrasəslə dəstəklənən transformasiyası

Hussain və b. (2007) sonikasiya ilə dəstəklənən pambıq transformasiyasının faydalı təsirlərini nümayiş etdirirlər. Aşağı tezlikli ultrasəsin yaratdığı akustik kavitasiya bitki toxumasının səthində və səthinin altında mikroyaralar yaradır (sonoporasiya) və Agrobacterium-un daha dərinə, həmçinin bütün bitki toxuması boyunca yayılmasına imkan verir. Bu yaralanma forması toxumanın dərinliyində yerləşən bitki hüceyrələrinin yoluxma ehtimalını artırır. SAAT-ın transformasiya səmərəliliyini qiymətləndirmək üçün GUS geninin ekspressiyası ölçülmüşdür. GUS reportyor sistemi xüsusilə bitki molekulyar biologiyası və mikrobiologiyasında faydalı olan reportyor gen sistemidir. Müxtəlif SAAT parametrlərinin tənzimlənməsi ilə eksplant kimi yetkin embrionlardan istifadə olunan pambıqda GUS-un müvəqqəti ekspressiyası əhəmiyyətli dərəcədə artırılmışdır. GUS ilk dəfə eksplantların inkubasiyasından 24h sonra aşkar edilmiş, 48h müddətində isə GUS ekspressiyası çox intensiv olmuşdur; bu, sonikasiya ilə dəstəklənən Agrobacterium vasitəli transformasiyadan (SAAT) sonra pambıq eksplantının uğurlu transformasiyasının faydalı göstəricisi olmuşdur. Müxtəlif transformasiya texnikalarının (yəni biolistik, Agro, BAAT, SAAT) müqayisəsində sonikasiya ilə dəstəklənən Agrobacterium vasitəli transformasiya (SAAT) transformasiyanın açıq fərqlə ən yaxşı nəticələrini göstərmişdir.

GUS-un müvəqqəti ekspressiyası əsasında transformasiya prosedurunun seçilməsi. Sonikasiya ilə dəstəklənən Agrobacterium vasitəli transformasiya (SAAT) əhəmiyyətli dərəcədə daha yüksək müvəqqəti ekspressiya göstərir.
(tədqiqat və qrafik: © Hussain və b., 2007)

Sonoporasiya və SAAT üçün yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs həlləri

Hielscher Ultrasonics laboratoriyalar, tədqiqat müəssisələri, eləcə də çox yüksək emal məhsuldarlığı olan sənaye istehsalı üçün yüksək məhsuldarlıqlı ultrasəs cihazlarının hazırlanması və istehsalında uzunmüddətli təcrübəyə malikdir. Mikrobiologiya və həyat elmləri üçün Hielscher konkret toxumalar və onların emalı ilə bağlı müxtəlif tələbləri ödəyən fərqli həllər təklif edir. Çoxsaylı nümunələrin eyni vaxtda ultrasəslə emalı üçün Hielscher çoxyuvalı lövhələr üçün UIP400MTP, 10-a qədər flakonun (məsələn, Eppendorf sınaq borularının) sonikasiyası üçün VialTweeter və ya ultrasəs CupHorn təklif edir. Laboratoriya homogenizatorları kimi zond tipli ultrasəs cihazları 50–400 vatt güc diapazonunda mövcuddur, sənaye sistemləri isə 500 vattdan 16kW-a qədər güc diapazonunu əhatə edir.
Bizimlə əlaqə saxlayın və tətbiqiniz, eləcə də proses tələbləriniz barədə məlumat verin. Təcrübəli əməkdaşlarımız bioloji prosesiniz üçün ən uyğun ultrasəs cihazını məmnuniyyətlə tövsiyə edəcəklər.
Aşağıdakı cədvəl ultrasəs cihazlarımızın təxmini emal gücü barədə təsəvvür yaradır: