Tạo sợi amyloid bằng máy siêu âm đĩa vi thể UIP400MTP

Các sợi amyloid, tương tự như tinh thể, hình thành thông qua quá trình tạo mầm và tăng trưởng tiếp theo. Tuy nhiên, do hàng rào năng lượng tự do cao của quá trình tạo mầm, sự hình thành sợi amyloid tự phát chỉ xảy ra sau một pha trễ kéo dài. Xử lý siêu âm đã trở thành một công cụ mạnh mẽ để cảm ứng tạo mầm amyloid, qua đó đẩy nhanh đáng kể quá trình hình thành sợi. Khi kết hợp với máy đọc đĩa vi thể sử dụng huỳnh quang thioflavin T (ThT), xử lý siêu âm cho phép phát hiện sợi amyloid đồng thời trong nhiều mẫu với thông lượng cao.

Tạo sợi amyloid cảm ứng bằng siêu âm với máy siêu âm đĩa vi thể UIP400MTP

Với máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP, có thể tổng hợp nhanh các sợi amyloid có chất lượng đồng nhất với số lượng lớn cho mục đích nghiên cứu. Phương pháp hiệu quả này cho phép nghiên cứu khả năng tạo amyloid của protein. Kỹ thuật này giúp quá trình tạo sợi amyloid diễn ra nhanh và có khả năng tái lập, như đã được chứng minh với β2-microglobulin (β2-m), một protein có khả năng tạo amyloid liên quan đến bệnh amyloidosis do lọc máu.

Phương pháp thực nghiệm đơn giản: Tạo sợi amyloid cảm ứng bằng siêu âm

Để cảm ứng hình thành sợi, một đĩa vi thể 96 giếng được đặt ở trung tâm của máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP, thiết bị bảo đảm tất cả các giếng tiếp xúc đồng đều với siêu âm. Các điều kiện thực nghiệm như sau:

Mỗi giếng chứa 0,2 ml dung dịch β2-microglobulin (0,3 mg/ml, pH 2,5) được bổ sung 5 μM ThT.
Đĩa được xử lý theo các chu kỳ siêu âm, chẳng hạn như siêu âm trong 1 phút rồi tạm dừng trong 9 phút.
Sau khi xử lý siêu âm, huỳnh quang ThT được đo bằng máy đọc đĩa vi thể.

(xem So và cộng sự, 2011)

Hielscher UIP400MTP là máy siêu âm linh hoạt nhất cho đĩa nhiều giếng, đĩa PCR hoặc ống mẫu. Với công suất siêu âm đầu ra liên tục 400 oát, thiết bị được chế tạo cho các ứng dụng như: ly giải tế bào, nhũ hóa, chiết xuất protein, phân mảnh DNA / RNA, phá kết tụ, chiết xuất từ mẫu FFPE, tách tế bào và màng sinh học khỏi bề mặt hoặc nhũ hóa. UIP400MTP không phải là bể siêu âm. Đây là đầu phát siêu âm dạng cốc cường độ cao để xử lý siêu âm tập trung. Máy siêu âm không tiếp xúc mạnh mẽ này xử lý siêu âm đồng đều trên tất cả các giếng của đĩa giếng tiêu chuẩn. Người dùng có thể kiểm soát chính xác biên độ, công suất và chế độ xung. Bộ hẹn giờ và đầu dò nhiệt độ tích hợp đảm bảo kết quả nhất quán. Máy siêu âm đĩa UIP400MTP làm mát mẫu bằng bể nước, với bộ làm lạnh bên ngoài tùy chọn.

So sánh với phương pháp khuấy lắc thông thường

So với các phương pháp khuấy lắc truyền thống, xử lý siêu âm làm giảm mạnh pha trễ của quá trình hình thành sợi. Trong điều kiện lắc đĩa vi thể thông thường, chỉ 1 trong số 10 giếng cho thấy huỳnh quang ThT tăng sau 20 giờ. Ngược lại, khi sử dụng xử lý siêu âm theo chu kỳ (siêu âm trong 15 phút rồi để yên trong 5 phút), mức tăng huỳnh quang ThT đáng kể được phát hiện ngay sau lần xử lý siêu âm đầu tiên.

Đẩy nhanh đáng kể động học tạo sợi

Các kết quả của So và cộng sự (2011) cho thấy thời gian hình thành sợi tự phát của β2-microglobulin ở pH 2,5 có thể được rút ngắn từ vài giờ xuống chỉ còn 10–15 phút nhờ xử lý siêu âm.
Ảnh hiển vi lực nguyên tử (AFM) xác nhận rằng các sợi được tạo ra bằng cách siêu âm trong 10 phút mỗi 15 phút không thể phân biệt về hình thái với các sợi được hình thành bằng cách siêu âm trong 1 phút mỗi 10 phút. Điều này làm nổi bật khả năng tái lập và tính ổn định của quá trình tạo sợi amyloid cảm ứng bằng siêu âm.

Máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP đẩy nhanh quá trình hình thành sợi amyloid bằng cách tạo mầm nhờ siêu âm

Ảnh AFM của các sợi amyloid được tạo ra bằng cách siêu âm trong 1 phút mỗi 10 phút (i), siêu âm trong 10 phút mỗi 15 phút (ii), và bằng phản ứng gieo mầm không xử lý siêu âm (iii). Thanh tỷ lệ màu trắng biểu thị 1 μm.
Nghiên cứu và hình ảnh: ©So và cộng sự, 2011

Tạo sợi trong điều kiện pH trung tính

Ngay cả trong điều kiện pH trung tính, các sợi vẫn hình thành sau thời gian trễ 1,5 giờ, cho thấy xử lý siêu âm làm giảm đáng kể hàng rào năng lượng đối với quá trình tạo mầm và tăng trưởng. Điều này củng cố thêm giả thuyết rằng quá trình tạo sợi amyloid chủ yếu là một phản ứng vật lý, phần lớn bị hạn chế bởi hàng rào năng lượng tạo mầm, vốn được xử lý siêu âm làm giảm một cách hiệu quả.

Tác động đối với nghiên cứu các bệnh liên quan đến amyloid

Việc tạo sợi amyloid dễ dàng và đáng tin cậy bằng máy siêu âm đĩa vi thể UIP400MTP có ý nghĩa quan trọng đối với nghiên cứu bệnh Alzheimer (AD) và các rối loạn khác liên quan đến amyloid, chẳng hạn như bệnh Parkinson, đái tháo đường týp II và các bệnh amyloidosis toàn thân. Trong AD, sự kết tụ amyloid-β (Aβ) là một dấu hiệu bệnh lý đặc trưng quan trọng, tuy nhiên việc nghiên cứu động học tạo sợi của protein này vẫn còn khó khăn do pha trễ kéo dài và tính biến thiên của các phương pháp thông thường. Quá trình hình thành sợi nhờ siêu âm đẩy nhanh sự tạo mầm, bảo đảm khả năng tái lập cao và giảm tính biến thiên, điều này rất quan trọng để sàng lọc các chất ức chế tiềm năng và tìm hiểu cơ chế tạo amyloid. Hơn nữa, khả năng xử lý mẫu với thông lượng cao của UIP400MTP cho phép nghiên cứu trên quy mô lớn về sự gấp cuộn sai và kết tụ protein, tạo thuận lợi cho việc khám phá các tác nhân điều trị có thể điều biến quá trình hình thành sợi và có khả năng làm chậm tiến triển thoái hóa thần kinh.

Nghiên cứu này xác lập việc xử lý siêu âm bằng máy siêu âm đĩa nhiều giếng UIP400MTP là một phương pháp có hiệu quả cao để đẩy nhanh quá trình hình thành sợi amyloid. Các ưu điểm chính của phương pháp này bao gồm:

Giảm mạnh thời gian trễ của quá trình tạo sợi.
Tất cả các giếng tiếp xúc đồng đều với siêu âm, giúp quá trình hình thành sợi có khả năng tái lập.
Khả năng sàng lọc thông lượng cao, phù hợp để khảo sát khả năng tạo amyloid của protein trên toàn bộ hệ gen.

Bằng cách tích hợp xử lý siêu âm với phát hiện huỳnh quang ThT, phương pháp này cung cấp một nền tảng nhanh chóng, có thể mở rộng quy mô và đáng tin cậy để nghiên cứu quá trình tạo sợi amyloid. Với hiệu quả và tiềm năng thông lượng cao, phương pháp này có thể giúp tổng hợp dễ dàng các sợi amyloid cho nghiên cứu lý sinh và dược học, mang đến một công cụ đầy hứa hẹn cho các nghiên cứu liên quan đến amyloid và sàng lọc thuốc.

Chủ đề liên quan

Tài liệu / Tài liệu tham khảo

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Masatomo So, Hisashi Yagi, Kazumasa Sakurai, Hirotsugu Ogi, Hironobu Naiki, Yuji Goto (2011): Ultrasonication-Dependent Acceleration of Amyloid Fibril Formation. Journal of Molecular Biology, Volume 412, Issue 4, 2011. 568-577.
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Câu hỏi thường gặp

Tạo mầm sơ cấp amyloid là gì?

Tạo mầm sơ cấp amyloid là bước đầu tiên, quyết định tốc độ của quá trình hình thành sợi amyloid, trong đó các protein đơn phân trải qua những thay đổi cấu dạng và tự lắp ráp thành một mầm tới hạn. Mầm này đóng vai trò làm khuôn cho quá trình kết tụ tiếp theo.

Sợi được hình thành như thế nào trong bệnh amyloidosis?

Trong bệnh amyloidosis, các protein gấp cuộn sai kết tụ thông qua quá trình trùng hợp phụ thuộc vào sự tạo mầm. Khi một mầm hình thành, các đơn phân nhanh chóng phát triển kéo dài thành các sợi giàu phiến β thông qua quá trình tạo mầm thứ cấp và tăng trưởng theo khuôn, dẫn đến lắng đọng amyloid.

Tính đa hình của sợi amyloid là gì?

Tính đa hình của sợi amyloid đề cập đến các biến thể cấu trúc ở những sợi được hình thành từ cùng một protein. Sự khác biệt về hình thái sợi, cách sắp xếp các tiền sợi và cách đóng gói phân tử phát sinh do điều kiện môi trường, đột biến hoặc các con đường kết tụ khác nhau.

Sợi amyloid và mảng amyloid khác nhau như thế nào?

Sợi amyloid là các tập hợp protein kết tụ dạng tuyến tính, giàu phiến β, trong khi mảng amyloid là các khối lắng đọng ngoại bào của những sợi đã kết tụ, thường trộn lẫn với lipid, kim loại và mảnh vụn tế bào, như được quan sát thấy trong các bệnh thoái hóa thần kinh như Alzheimer.

Alpha-synuclein và amyloid khác nhau như thế nào?

Alpha-synuclein là một protein của tế bào thần kinh tham gia vào chức năng synap, nhưng trong điều kiện bệnh lý, protein này gấp cuộn sai và hình thành các sợi giống amyloid. “Amyloid” là thuật ngữ chung chỉ các tập hợp protein gấp cuộn sai kết tụ dạng sợi, trong khi các sợi alpha-synuclein là đặc trưng của những bệnh như Parkinson.

Sợi protein là gì?

Sợi protein là một tập hợp kết tụ dạng sợi, có trật tự cao và giàu phiến β, được hình thành từ các protein gấp cuộn sai hoặc bị tháo cuộn một phần. Các sợi này thường không hòa tan và phát sinh thông qua quá trình trùng hợp phụ thuộc vào sự tạo mầm. Chúng liên quan đến nhiều tình trạng bệnh lý khác nhau, bao gồm các bệnh amyloidosis và bệnh thoái hóa thần kinh (ví dụ: Alzheimer, Parkinson). Tuy nhiên, một số sợi protein có chức năng sinh học tồn tại trong các hệ thống sinh học, chẳng hạn như sợi curli ở vi khuẩn và sợi tơ ở nhện.