Sự hình thành sợi amyloid bằng cách sử dụng máy siêu âm tấm vi mô UIP400MTP

Các sợi amyloid, giống như tinh thể, hình thành thông qua quá trình tạo mầm và tăng trưởng sau đó. Tuy nhiên, do hàng rào năng lượng tự do cao của quá trình tạo mầm, sự hình thành sợi amyloid tự phát chỉ xảy ra sau một giai đoạn trễ kéo dài. Siêu âm đã nổi lên như một công cụ mạnh mẽ để tạo mầm amyloid, do đó đẩy nhanh đáng kể sự hình thành sợi. Khi kết hợp với đầu đọc đĩa vi mô sử dụng huỳnh quang thioflavin T (ThT), siêu âm cho phép phát hiện thông lượng cao các sợi amyloid trong nhiều mẫu đồng thời.

Sự hình thành sợi amyloid gây ra bằng siêu âm với máy siêu âm tấm vi mô UIP400MTP

Với máy siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP, các sợi amyloid có cùng chất lượng với số lượng lớn có thể được tổng hợp nhanh chóng cho mục đích nghiên cứu. Cách tiếp cận hiệu quả này cho phép nghiên cứu khả năng sinh amyloid của protein. Kỹ thuật này tạo điều kiện cho rung amyloid nhanh chóng và có thể tái tạo, như đã được chứng minh với β2-microglobulin (β2-m), một protein amyloidogenic liên quan đến bệnh amyloidogenic liên quan đến lọc máu.

Phương pháp tiếp cận thực nghiệm đơn giản: Rung amyloid gây ra siêu âm

Để tạo ra sự hình thành fibril, một tấm vi mô 96 giếng được đặt ở trung tâm của máy siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP, đảm bảo tiếp xúc siêu âm đồng đều trên tất cả các giếng. Các điều kiện thí nghiệm như sau:

1. Mỗi giếng chứa 0,2 ml dung dịch β2-microglobulin (0,3 mg / ml, pH 2,5) được bổ sung 5 μM ThT.
2. Tấm được trải qua các chu kỳ siêu âm, chẳng hạn như siêu âm 1 phút, sau đó là 9 phút tạm dừng.
3. Sau siêu âm, huỳnh quang ThT được đo bằng cách sử dụng đầu đọc đĩa vi mô.

(xem So và cộng sự, 2011)

So sánh với khuấy động thông thường

So với các phương pháp khuấy truyền thống, siêu âm làm giảm đáng kể giai đoạn trễ của sự hình thành sợi. Trong điều kiện lắc tấm vi mô thông thường, chỉ có 1 trong số 10 giếng có huỳnh quang ThT tăng sau 20 giờ. Ngược lại, sử dụng siêu âm theo chu kỳ (siêu âm 15 phút sau đó là 5 phút tĩnh lặng), sự gia tăng huỳnh quang ThT đáng kể đã được phát hiện ngay sau lần điều trị siêu âm đầu tiên.

Tăng tốc nhanh động học rung động

Kết quả thu được từ So et al. (2011) đã chứng minh rằng sự hình thành sợi tự phát của β2-microglobulin ở pH 2,5 có thể được đẩy nhanh từ vài giờ xuống chỉ còn 10–15 phút với siêu âm.
Hình ảnh kính hiển vi lực nguyên tử (AFM) xác nhận rằng các sợi được tạo ra thông qua siêu âm 10 phút cứ sau 15 phút không thể phân biệt được về mặt hình thái với các sợi được hình thành bằng cách sử dụng siêu âm 1 phút cứ sau 10 phút. Điều này làm nổi bật khả năng tái tạo và độ mạnh mẽ của rung amyloid gây ra bằng siêu âm.

Hình ảnh AFM của sợi amyloid được tạo ra bằng siêu âm 1 phút mỗi 10 phút (i), bằng siêu âm 10 phút mỗi 15 phút (ii) và bằng phản ứng gieo hạt mà không cần siêu âm (iii). Thanh tỷ lệ màu trắng đại diện cho 1 μm.
Nghiên cứu và hình ảnh: ©So và cộng sự, 2011

Rung tim ở điều kiện pH trung tính

Ngay cả trong điều kiện pH trung tính, sự hình thành sợi đã đạt được sau thời gian trễ 1,5 giờ, chứng tỏ rằng siêu âm làm giảm đáng kể rào cản năng lượng đối với sự tạo mầm và tăng trưởng. Điều này tiếp tục hỗ trợ giả thuyết rằng rung amyloid chủ yếu là một phản ứng vật lý, phần lớn bị hạn chế bởi rào cản năng lượng tạo mầm, mà siêu âm làm giảm hiệu quả.

Tác động đến nghiên cứu bệnh liên quan đến amyloid

Sự hình thành dễ dàng và đáng tin cậy của các sợi amyloid bằng cách sử dụng máy siêu âm tấm siêu âm UIP400MTP có ý nghĩa quan trọng đối với nghiên cứu bệnh Alzheimer (AD) và các rối loạn liên quan đến amyloid khác, chẳng hạn như bệnh Parkinson, tiểu đường loại II và amyloidose toàn thân. Trong AD, sự kết hợp amyloid-β (Aβ) là một dấu hiệu bệnh lý quan trọng, nhưng việc nghiên cứu động học rung động của nó vẫn còn nhiều thách thức do các giai đoạn trễ dài và sự thay đổi trong các phương pháp thông thường. Sự hình thành sợi do siêu âm thúc đẩy đẩy nhanh quá trình tạo mầm, đảm bảo khả năng tái tạo cao và giảm sự thay đổi, điều này rất quan trọng để sàng lọc các chất ức chế tiềm năng và hiểu các cơ chế tạo amyloidogen. Hơn nữa, khả năng thông lượng cao của UIP400MTP cho phép điều tra quy mô lớn về sự gấp sai và kết tụ protein, tạo điều kiện thuận lợi cho việc khám phá các tác nhân điều trị có thể điều chỉnh sự hình thành sợi và có khả năng giảm thiểu sự tiến triển thoái hóa thần kinh.

Nghiên cứu này thiết lập siêu âm bằng cách sử dụng máy siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP như một phương pháp hiệu quả cao để đẩy nhanh quá trình hình thành sợi amyloid. Những ưu điểm chính của cách tiếp cận này bao gồm:

• Giảm đáng kể thời gian trễ đối với rung động.
• Tiếp xúc siêu âm đồng đều trên tất cả các giếng, cho phép hình thành sợi có thể tái tạo.
• Khả năng sàng lọc thông lượng cao, làm cho nó phù hợp cho các tìm kiếm trên toàn bộ bộ gen về khả năng sinh amyloid của protein.

Bằng cách tích hợp siêu âm với phát hiện huỳnh quang ThT, phương pháp này cung cấp một nền tảng nhanh chóng, có thể mở rộng và đáng tin cậy để nghiên cứu rung amyloid. Với hiệu quả và tiềm năng thông lượng cao, cách tiếp cận này có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc tổng hợp các sợi amyloid dễ dàng cho nghiên cứu vật lý sinh học và dược phẩm, cung cấp một công cụ đầy hứa hẹn cho các nghiên cứu liên quan đến amyloid và sàng lọc thuốc.