PMCA để phát hiện thông lượng cao của prion bằng UIP400MTP Sonicator

Máy siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP cung cấp một giải pháp mạnh mẽ để chuẩn bị mẫu thông lượng cao trong khuếch đại tuần hoàn gấp sai protein (PMCA). Bằng cách phân phối năng lượng đồng đều trên nhiều giếng và duy trì các thông số siêu âm chính xác, hệ thống này cho phép xử lý đồng thời nhiều mẫu với khả năng tái tạo đặc biệt. Những khả năng này rất quan trọng để tối ưu hóa PMCA để phát hiện prion ở nồng độ thấp trong các mẫu sinh học khó khăn, chẳng hạn như nước bọt, nơi các chất ức chế xét nghiệm có thể che khuất kết quả.

Các bệnh prion, chẳng hạn như bệnh suy nhược mãn tính (CWD) ở cổ tử cung và bệnh Creutzfeldt-Jakob (CJD) ở người, là rối loạn thoái hóa thần kinh do protein prion bị gấp sai (PrP^Sc). Những bệnh này thường liên quan đến mức độ thấp của prion lây nhiễm trong dịch cơ thể, chẳng hạn như nước bọt, máu và nước tiểu, làm phức tạp việc chẩn đoán và nghiên cứu. Sự lây truyền CWD theo chiều ngang qua prion rụng trong ma trận môi trường có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc quản lý động vật hoang dã và sức khỏe sinh thái. Tương tự, trong các bệnh như bệnh Creutzfeldt-Jakob, sự khuếch đại đáng tin cậy của các protein prion bị gấp sai từ các mẫu người là rất quan trọng để thúc đẩy chẩn đoán và hiểu sự tiến triển của bệnh.

Áp dụng phác đồ PMCA sửa đổi cho phép bỏ qua các chất ức chế xét nghiệm thông thường (ví dụ: chất nhầy trong nước bọt) và đạt được độ nhạy cao trong việc phát hiện prion không thể phát hiện được hoặc mơ hồ bằng cách sử dụng các kỹ thuật như chuyển đổi do rung động theo thời gian thực (RT-QuIC). Những tiến bộ này giúp tăng cường phát hiện prion đối với các bệnh khác nhau, làm cho PMCA trở thành một công cụ không thể thiếu để nghiên cứu và chẩn đoán prion. Máy siêu âm tấm đa giếng UIP400MTP tạo điều kiện cho PMCA thông lượng cao siêu âm nhiều mẫu trong tấm vi mô (ví dụ: đĩa 6, 24 hoặc 96 giếng) hoặc lọ trong giá ống.

Giao thức khuếch đại tuần hoàn gấp sai protein thông lượng cao (PMCA)

Giao thức sau đây cho phép xử lý hiệu quả số lượng mẫu cao trong các điều kiện chính xác giống nhau để có kết quả nghiên cứu mạnh mẽ.

Chuẩn bị mẫu

Vật liệu ban đầu:
Chuẩn bị mẫu bằng cách:

• Đình chỉ lại viên chiết xuất sarkosyl trong chất nền PMCA.
• Trực tiếp tăng đột biến đồng nhất não hoặc mẫu máu bằng hạt prion.

Chất nền:

• Sử dụng chất đồng nhất não 10% (wt / vol) được điều chế từ chuột chuyển gen biểu hiện quá mức PrP^C (ví dụ: chuột Tg).
• Đồng nhất mô não trong:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Bảo quản chất nền ở -80ºC cho đến khi sử dụng.

Thiết lập mẫu trong tấm vi mô hoặc ống:
Ống:

• Thêm 90 μL chất nền đồng nhất não và hạt với 10 μL mẫu (ví dụ: máu, đồng nhất não hoặc viên sarkosyl).
• Đặt 3 hạt Teflon (đường kính 1.59 mm hoặc 2.38 mm) vào mỗi ống 0.2 mL.
• Gắn các ống vào giá tương thích với máy siêu âm UIP400MTP.

Tấm vi mô 6 giếng:

• Thêm 5 mL chất nền đồng nhất não và hạt với 500 μL mẫu mỗi giếng.
• Thêm 3 hạt Teflon vào mỗi giếng.

Thủ tục PMCA

Vị trí:
Đặt giá đỡ ống hoặc tấm vi mô 6 giếng vào máy siêu âm UIP400MTP theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chương trình đạp xe:
Thực hiện 144 chu kỳ PMCA như sau:

• Ấp: 29 phút 30 giây ở 37°C.
• Siêu âm: 30 giây ở biên độ 60%.
• Theo dõi nhiệt độ: Sử dụng cảm biến nhiệt độ có thể cắm được để theo dõi sample nhiệt độ và lập trình UIP400MTP lên tối đa nhiệt độ 48–50 ° C.

Các vòng tiếp theo:
Sau khi hoàn thành vòng đầu tiên của 144 chu kỳ, chuyển một phần của vật liệu khuếch đại:

• Pha loãng 10 lần vào chất nền đồng nhất não chuột chuyển gen tươi.
• Thực hiện 96 chu kỳ PMCA cho các vòng tiếp theo, duy trì các thông số siêu âm giống nhau.
• Tiếp tục cho số vòng mong muốn (thường là tối đa 5).

Phát hiện PrP^Sc

1. Tiêu hóa Proteinase K:
   – Xử lý các mẫu bằng Proteinase K (50 μg/mL) ở 37°C trong 1 giờ.
   – Chấm dứt quá trình phân hủy bằng cách thêm SDS-sample đệm và đun sôi trong 10 phút.
2. Phân tích Western Blot:
   – Phân tích các mẫu tiêu hóa bằng cách:
   – Kháng thể kháng PrP 6H4 hoặc PRC1.
   – Thực hiện SDS-PAGE và chuyển sang màng PVDF để phát hiện.

 

 

Xử lý nhiều mẫu hơn để có kết quả mạnh mẽ hơn

Máy siêu âm đĩa đa giếng UIP400MTP nâng cao đáng kể hiệu quả và khả năng mở rộng của khuếch đại tuần hoàn gấp sai protein (PMCA), giải quyết bản chất tốn thời gian truyền thống của quy trình. Bằng cách cho phép xử lý đồng thời tối đa 96 mẫu trong một tấm 96 giếng, hệ thống hợp lý hóa quy trình làm việc PMCA trong khi vẫn duy trì các điều kiện siêu âm chính xác và đồng nhất trên tất cả các giếng. Khả năng thông lượng cao này giảm thiểu việc xử lý thủ công, giảm các bước tốn nhiều công sức và đảm bảo khả năng tái tạo, làm cho nó trở thành một công cụ không thể thiếu để nghiên cứu prion. Cho dù điều tra bệnh suy nhược mãn tính hay bệnh Creutzfeldt-Jakob, UIP400MTP tạo điều kiện cho các nghiên cứu quy mô lớn với hiệu quả cao hơn, cho phép các nhà nghiên cứu đáp ứng nhu cầu của các ứng dụng khoa học và chẩn đoán hiện đại.

---

---

Văn học / Tài liệu tham khảo

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.