Ultratovush yordamida oʻsimlik hujayralarida genetik transformatsiya

Ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi Agrobacterium vositasidagi transformatsiya (SAAT) Agrobacteriumdan tashuvchi sifatida foydalanib, oʻsimlik hujayralarini begona genlar bilan zararlashning samarali usulidir. Ultratovushli kavitatsiya sonoporatsiyani keltirib chiqaradi; uni oʻsimlik toʻqimasida maqsadli mikrojarohatlar hosil qilish deb taʼriflash mumkin. Ultratovush yordamida hosil qilingan ushbu mikrojarohatlar orqali DNK va DNK vektorlarini hujayra matritsasiga samarali yetkazish mumkin.

Sonoporatsiya – ultratovush yordamida kuchaytirilgan hujayra transformatsiyasi

Hujayra suspenziyalariga past chastotali ultratovush (taxminan 20kHz) qoʻllanganda, akustik kavitatsiya taʼsiri hujayra toʻqimalaridagi membranalar oʻtkazuvchanligini vaqtincha oshiradi. Ushbu ultratovush taʼsiri sonoporatsiya deb ataladi va genlarni hujayralar yoki toʻqimalarga oʻtkazish uchun qoʻllanadi.
Ultratovush bilan ishlov berishning afzalliklari uning issiqlikka asoslanmagan mexanik ishlash tamoyiliga tayanadi; bu ultratovush bilan ishlov berishni koʻpincha yanada koʻp maqsadlarda qoʻllashga imkon beradi va uning hujayra turlariga bogʻliqligini kamaytiradi. Sonoporatsiyaning turli maqsadlarda qoʻllanishi insonni davolash uchun moʻljallangan murakkab oqsillarni biologik ishlab chiqarishda katta salohiyatga ega transgen oʻsimliklardan foydalanish imkonini ochadi. Bunday oʻsimlik asosidagi bioreaktorlarni genetik jihatdan oson oʻzgartirish mumkin, ular inson patogenlari bilan ehtimoliy ifloslanishning oldini oladi, transformatsiyada vositachilik qiluvchi bakteriyalarga (masalan, Agrobacterium) zarar yetkazmaydi va biosintezning arzon, samarali usuli hisoblanadi.

Ultratovush yordamidagi hujayra transformatsiyasi

Ultratovush bilan ishlov berish eritmadagi zarrachalarni harakatga keltirish va eritmalarni aralashtirish uchun past chastotali ultratovush toʻlqinlarini qoʻllaydigan usul boʻlib, shu orqali massa almashinuvi va erish tezligini oshiradi. Shu bilan birga, ultratovush bilan ishlov berish suyuqliklardan erigan gazlarni chiqarib tashlashi mumkin. Oʻsimlik transformatsiyasida ultratovush bilan ishlov berish oʻsimlik toʻqimasida mikrojarohatlar hosil boʻlishiga olib keladi va yalangʻoch DNKning oʻsimlik protoplastiga yetkazilishini yaxshilaydi.

Genetik transformatsiya uchun ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi Agrobacterium vositasidagi transformatsiya (SAAT) afzal koʻriladigan usul boʻlib, yalangʻoch DNK va DNK vektorlarini bevosita protoplastga oʻtkazish uchun qoʻllanadigan ultratovush bilan ishlov berishga qaraganda ancha yuqori samaradorlikka ega. Koʻplab tadqiqotlar ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi Agrobacterium vositasidagi transformatsiya (SAAT) ultratovush toʻlqinlari va ular natijasida yuzaga keladigan akustik kavitatsiya orqali oʻsimlik hujayralarida mexanik parchalanish va jarohatlar hosil boʻlishini keltirib chiqarish uchun qoʻllanishi mumkinligini koʻrsatgan. Ultratovush bilan qisqa muddatli ishlov berish eksplantlar yuzasida mikrojarohatlar hosil qiladi. Jarohatlangan hujayralar Agrobacteriumning oʻsimlik toʻqimalarining chuqurroq qismlariga kirishiga imkon beradi va shu orqali oʻsimlik hujayralarining zararlanish ehtimolini oshiradi. Bundan tashqari, ajralib chiqadigan fenol birikmalari transformatsiyani kuchaytiradi. Ultratovush yordamida hosil qilingan mikrojarohatlar bakteriyalarning eksplantga kirishini ham osonlashtiradi. SAAT ayniqsa Agrobacteriumga chidamli deb hisoblanadigan oʻsimlik turlarida genetik transformatsiya uchun muvaffaqiyatli qoʻllangan.
SAATning asosiy afzalliklari uning juda sodda va arzon usul ekanligi hamda Agrobacterium vositasida gen oʻtkazishni sezilarli darajada kuchaytirishidir. SAAT Chenopodium rubrum L. va Beta vulgaris L. transformatsiyasida muvaffaqiyatli qoʻllanganidan tashqari, ushbu yondashuv Nicotiana tabacumda rekombinant Escherichia coli yovvoyi tipidagi issiqlikka chidamsiz holotoksin va Escherichia coli mutant LT vaksina adyuvantlarini ishlab chiqarishda ham qoʻllangan; bunda qushlarda LT-B ga xos tizimli IgG titrlarining eng yuqori darajalari aniqlangan.
(qiyoslang: Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka va R. Baranski, 2014)

Oʻsimlik hujayralarida sonoporatsiya orqali gen oʻtkazishning umumiy tartibi

1. Genetik materialni tayyorlash: Oʻsimlik hujayralariga kiritmoqchi boʻlgan genetik materialingizni tayyorlashdan boshlang. Bu plazmid DNKsi, RNK yoki boshqa nuklein kislotalar boʻlishi mumkin.
2. Oʻsimlik hujayralarini ajratib olish: Nishon sifatida tanlagan oʻsimlik hujayralaringizni ajratib oling. Tajribangizga qarab, bu hujayralar oʻsimlik toʻqimalari yoki kulturalaridan ajratib olinishi mumkin.
3. Hujayra suspenziyasi: Oʻsimlik hujayralarini mos muhit yoki buferda suspenziya holatiga keltiring. Bu hujayralarning sogʻlom boʻlishini va genlarni qabul qilish uchun qulay holatda boʻlishini taʼminlash uchun zarur.
4. Ultratovush qurilmangizni sozlash: Amplituda, vaqt, energiya va harorat kabi ultratovush bilan ishlov berish parametrlarini oldindan sozlab, zondli ultratovush qurilmangizni tayyorlang. Ultratovush zondini hujayra suspenziyasiga botiring.
5. Ultratovush bilan ishlov berish: Ultratovush bilan ishlov berish jarayonini boshlang. Zond uchining tez tebranishi suyuqlikda kavitatsiya pufakchalarini hosil qiladi. Ushbu pufakchalar ultratovush toʻlqinlari taʼsirida kengayadi va qulaydi, natijada suspenziyada mexanik kuchlar va mikrooqimlar hosil boʻladi.
6. Sonoporatsiya: Kavitatsiya hosil qilgan mexanik kuchlar va mikrooqimlar oʻsimlik hujayralari membranalarida vaqtinchalik gʻovaklar va teshiklar hosil qiladi. Suspenziyada mavjud genetik material ushbu gʻovaklar orqali oʻsimlik hujayralariga kirishi mumkin.
7. Inkubatsiya: Sonoporatsiya bilan ishlov berilgandan soʻng, oʻsimlik hujayralari tiklanishi va membranalarini barqarorlashtirishi uchun ularni inkubatsiya qiling. Bu hujayralarning yashab qolishini va genlarning muvaffaqiyatli oʻtkazilishini taʼminlash uchun juda muhim bosqichdir.

Agrobacterium yoki liposomalar orqali gen oʻtkazish

Oʻsimlik hujayrasini transfeksiya qilishning ikkita keng tarqalgan shakli mavjud. Ularda genetik material tashuvchisi sifatida gram-manfiy bakteriyalar turkumi boʻlgan agrobacterium yoki liposomalardan foydalaniladi.

• Agrobacterium vositasidagi sonoporatsiya: Agrobacterium tumefaciens oʻsimliklar genetik muhandisligida keng qoʻllanadigan bakteriyadir. Ushbu usulda kerakli genni oʻz ichiga olgan plazmid DNKsi Agrobacteriumga kiritiladi, soʻng u oʻsimlik hujayralari bilan aralashtiriladi. Hujayra suspenziyasi zondli ultratovush qurilmasi yordamida sonoporatsiya qilinadi. Ultratovush energiyasi genetik materialning Agrobacteriumdan oʻsimlik hujayralariga oʻtkazilishini kuchaytiradi. Ushbu usul oʻsimliklarni genetik oʻzgartirish uchun keng qoʻllanadi.
• Liposomalar vositasidagi sonoporatsiya: Liposomalar genetik materialni tashiy oladigan lipid asosidagi pufakchalardir. Ushbu usulda plazmid DNKsi yoki boshqa nuklein kislotalar yuklangan liposomalar oʻsimlik hujayralari bilan aralashtiriladi. Oʻsimlik hujayralarining liposomalarni qabul qilishini osonlashtirish uchun zondli ultratovush qurilmasi yordamida sonoporatsiya qoʻllanadi. Ultratovush liposomalarning lipid qoʻsh qatlamlarini buzib, genetik materialni oʻsimlik hujayralariga chiqaradi. Ushbu yondashuv oʻsimlik hujayralarida vaqtinchalik gen ekspressiyasini oʻrganish uchun foydalidir.

Ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi Agrobacterium vositasidagi transformatsiyaning (SAAT) ilmiy jihatdan isbotlangan afzalliklari

Ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi Agrobacterium vositasidagi transformatsiya (SAAT) koʻplab oʻsimlik turlarida qoʻllangan. Oʻsimlik hujayra kulturalariga ultratovush bilan qisqa muddatli va nisbatan yumshoq ishlov berish sonoporatsiyani keltirib chiqaradi; bu esa keyinchalik gen tashuvchisi boʻlgan Agrobacteriumning chuqur kirib borishiga imkon beradi. Quyida SAATning foydali taʼsirlarini koʻrsatuvchi tadqiqot misollarini oʻqishingiz mumkin.

Ashvagandaning ultratovush yordamidagi transformatsiyasi

W. somniferada (ashvaganda yoki qishki olcha nomi bilan tanilgan) transformatsiya samaradorligini oshirish maqsadida Dehdashti va hamkasblari (2016) asetosiringon (AS) va ultratovush bilan ishlov berishdan foydalanishni oʻrgangan.
Asetosiringon (AS) uch bosqichda qoʻshilgan: Agrobacteriumning suyuq kulturasi, Agrobacterium bilan zararlash va eksplantlarni Agrobacterium bilan birgalikda kultivatsiya qilish. Agrobacteriumning suyuq kulturasiga 75 μM AS qoʻshish vir genlarini induksiya qilish uchun eng maqbul ekanligi aniqlangan.
Ultratovush bilan ishlov berishning (SAAT) qoʻshimcha qoʻllanishi eng yuqori gen ekspressiyasiga olib kelgan. Tukli ildizlarda gusA geni ekspressiyasi barglar va novda uchlariga mos ravishda 10 va 20s davomida ultratovush bilan ishlov berilganda eng yaxshi boʻlganligi aniqlangan. Takomillashtirilgan protokolning transformatsiya samaradorligi barg va novda uchi eksplantlari uchun mos ravishda 66,5 va 59,5% deb qayd etilgan. Boshqa protokollar bilan taqqoslanganda, ushbu takomillashtirilgan protokolning transformatsiya samaradorligi barglar uchun 2,5 baravar, novda uchlari uchun esa 3,7 baravar yuqori ekanligi aniqlangan. Southern blot tahlillari W1-W4 liniyalarida gusA transgenining 1–2 nusxasini tasdiqlagan, takomillashtirilgan protokol yordamida hosil qilingan W5 liniyasida esa transgenning 1–4 nusxasi aniqlangan.

Ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi Agrobacterium vositasidagi transformatsiya (SAAT) davomiyligining W. somnifera barg (a) va novda uchi (b) eksplantlarining transformatsiya chastotasiga taʼsiri
(tadqiqot va grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Gʻoʻzaning ultratovush yordamidagi transformatsiyasi

Hussain et al. (2007) ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi gʻoʻza transformatsiyasining foydali taʼsirlarini koʻrsatadi. Past chastotali ultratovush keltirib chiqaradigan akustik kavitatsiya oʻsimlik toʻqimasi yuzasida va uning ostida mikrojarohatlar hosil qiladi (sonoporatsiya) va Agrobacteriumning chuqurroq kirib, butun oʻsimlik toʻqimasi boʻylab toʻliq tarqalishiga imkon beradi. Bunday jarohatlanish toʻqimaning chuqurroq qismlarida joylashgan oʻsimlik hujayralarining zararlanish ehtimolini oshiradi. SAATning transformatsiya samaradorligini baholash uchun GUS geni ekspressiyasi oʻlchangan. GUS reporter tizimi ayniqsa oʻsimliklar molekulyar biologiyasi va mikrobiologiyasida foydali boʻlgan reporter gen tizimidir. Turli SAAT parametrlarini sozlash orqali yetilgan embrionlardan eksplant sifatida foydalanilgan gʻoʻzada GUSning vaqtinchalik ekspressiyasi sezilarli darajada kuchaytirilgan. GUS ilk bor eksplantlar inkubatsiya qilinganidan 24h oʻtgach aniqlangan va 48h ga kelib GUS ekspressiyasi juda kuchli boʻlgan; bu ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi Agrobacterium vositasidagi transformatsiyadan (SAAT) keyin gʻoʻza eksplantining muvaffaqiyatli transformatsiyalanganini koʻrsatuvchi foydali indikator boʻlib xizmat qilgan. Turli transformatsiya usullari (yaʼni biolistik, Agro, BAAT, SAAT) taqqoslanganda, ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi Agrobacterium vositasidagi transformatsiya (SAAT) transformatsiyaning ancha katta ustunlik bilan eng yaxshi natijalarini koʻrsatgan.

GUSning vaqtinchalik ekspressiyasi asosida transformatsiya tartibini tanlash. Ultratovush bilan ishlov berish yordamidagi Agrobacterium vositasidagi transformatsiya (SAAT) ancha yuqori vaqtinchalik ekspressiyani koʻrsatadi.
(tadqiqot va grafik: © Hussain et al., 2007)

Sonoporatsiya va SAAT uchun yuqori unumdor ultratovush yechimlari

Hielscher Ultrasonics laboratoriyalar, tadqiqot muassasalari hamda ishlov berish unumdorligi juda yuqori boʻlgan sanoat ishlab chiqarishi uchun yuqori unumdor ultratovush qurilmalarini ishlab chiqish va ishlab chiqarishda koʻp yillik tajribaga ega. Mikrobiologiya va hayot haqidagi fanlar uchun Hielscher muayyan toʻqimalar va ularga ishlov berish bilan bogʻliq turli talablarni qondiradigan xilma-xil yechimlarni taklif etadi. Koʻplab namunalarga bir vaqtning oʻzida ultratovush bilan ishlov berish uchun Hielscher koʻp chuqurchali planshetlar uchun UIP400MTP qurilmasini, 10 tagacha flakonga (masalan, Eppendorf probirkalariga) ultratovush bilan ishlov berish uchun VialTweeter qurilmasini yoki ultratovushli CupHorn qurilmasini taklif etadi. Zondli ultratovush qurilmalarining quvvati laboratoriya gomogenizatorlari uchun 50 dan 400 vattgacha, sanoat tizimlari uchun esa 500 vattdan 16kW gacha boʻladi.
Biz bilan bogʻlaning va qoʻllash maqsadingiz hamda jarayon talablaringiz haqida xabar bering. Katta tajribaga ega xodimlarimiz biologik jarayoningiz uchun eng mos ultratovush qurilmasini mamnuniyat bilan tavsiya qiladi.
Quyidagi jadval ultratovush qurilmalarimizning taxminiy ishlov berish unumdorligi haqida tasavvur beradi: