Ultratovush yordamida o'simlik hujayralarida genetik transformatsiya
Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) - bu Agrobacterium-dan tashuvchi sifatida foydalangan holda o'simlik hujayralarini begona genlar bilan yuqtirishning samarali usuli. Ultrasonik kavitatsiya o'simlik to'qimalarining maqsadli mikro yaralanishi deb ta'riflanishi mumkin bo'lgan sonoporatsiyani keltirib chiqaradi. Ushbu ultratovush yordamida mikro-yaralar hosil qiladi, DNK va DNK vektorlari hujayra matritsasiga samarali tarzda o'tkazilishi mumkin.
sonoporatsiya – Ultrasonik takomillashtirilgan hujayra transformatsiyasi
Hujayra suspenziyalariga past chastotali ultratovush (taxminan 20 kHz) qo'llanilganda, akustik kavitatsiya ta'siri hujayra to'qimalarida vaqtinchalik membrana o'tkazuvchanligini keltirib chiqaradi. Ushbu ultratovush effekti sonoporatsiya deb nomlanadi va genlarni hujayralar yoki to'qimalarga o'tkazish uchun ishlatiladi.
Ultrasonikatsiyaning afzalliklari uning termal bo'lmagan mexanik ish printsipiga asoslanadi, bu esa sonikatsiyani ko'pincha ko'p qirrali va hujayra turlariga kamroq bog'liq qiladi. Sonoporatsiyaning ko'p qirrali qo'llanilishi insonning murakkab terapevtik oqsillarini bioproduktsiyasida muhim salohiyatga ega bo'lgan transgen o'simliklardan foydalanish imkoniyatini ochadi. Bunday o'simlik bioreaktorlari genetik jihatdan oson o'zgartirilishi mumkin, inson patogenlari bilan potentsial ifloslanishning oldini oladi, transformatsiya vositachisi bakteriyalarga (masalan, Agrobacterium) zarar etkazmaydi va biosintezning arzon, samarali usuli hisoblanadi.
Ultrasonikator UP200St (200W, 26kHz) ovoz muhofazasi bilan
Ultratovush yordamida hujayra transformatsiyasi
Sonication - bu past chastotali ultratovush to'lqinlarini eritmadagi zarrachalarni aralashtirish, eritmalarni aralashtirish va shu bilan massa uzatish va erish tezligini oshirish uchun qo'llaydigan texnikadir. Bir vaqtning o'zida sonikatsiya suyuqliklardan erigan gazlarni olib tashlashi mumkin. O'simliklarni o'zgartirishda sonikatsiya o'simlik to'qimalarida mikro yaralar paydo bo'lishiga olib keladi va yalang'och DNKni o'simlik protoplastiga etkazib berishni kuchaytiradi.
Genetik transformatsiyalar uchun Sonication-Assisted Agrobacterium-vosited Transformation (SAAT) afzal qilingan usul bo'lib, yalang'och DNK va DNK vektorlarini to'g'ridan-to'g'ri protoplastga o'tkazish uchun ishlatiladigan sonikatsiyaga qaraganda ancha yuqori samaradorlikka ega. Ko'pgina tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, sonikatsiya yordamida Agrobacterium vositachiligidagi transformatsiya (SAAT) ultratovush to'lqinlari va natijada akustik kavitatsiya orqali o'simlik hujayralarida mexanik buzilish va jarohatlarning shakllanishiga olib kelishi mumkin. Qisqa ultratovushli davolash eksplantlar yuzasida mikro yaralar hosil qiladi. Yaralangan hujayralar Agrobakteriyalarning o'simlik to'qimalarining chuqur qismiga kirib borishiga imkon beradi, bu esa o'simlik hujayralarining infektsiyalanish ehtimolini oshiradi. Bundan tashqari, ajralib chiqadigan fenolik birikmalar transformatsiyani kuchaytiradi. Ultratovush yordamida hosil bo'lgan mikro-yaralar bakteriyalarning eksplantga kirib borishini ham amalga oshiradi. SAAT ayniqsa Agrobacteriumga chidamli o'simlik turlarida genetik transformatsiya uchun muvaffaqiyatli ishlatilgan.
Juda oddiy va arzon usul bo'lishi, shuningdek, Agrobacterium vositachiligida gen transferini sezilarli darajada yaxshilash SAAT ning asosiy afzalliklari hisoblanadi. Chenopodium rubrum L. va Beta vulgaris L. transformatsiyasida SAATni muvaffaqiyatli qo'llashdan tashqari, bu yondashuv Nicotiana tabacumda rekombinant Escherichia coli yovvoyi turdagi issiqlikka chidamli golotoksin va Escherichia coli mutant LT vaktsina adjuvantlarini ishlab chiqarishda ham qo'llanilgan. , unda eng yuqori tizimli LT-B-ga xos IgG titrlari aniqlangan qushlarda.
(Qarang: Laere va boshqalar, 2016; M. Klimek-Chodacka va R. Baranski, 2014).
VialTweeter bir vaqtning o'zida bir nechta namunali naychalarni sonikatsiya qilish uchun, masalan, sonikatsiya yordamida Agrobakteriya vositachiligidagi transformatsiya (SAAT)
O'simlik hujayralarida sonoporatsiya orqali genlarni uzatishning umumiy tartibi
- Genetik materialni tayyorlash: O'simlik hujayralariga kiritmoqchi bo'lgan genetik materialni tayyorlashdan boshlang. Bu plazmid DNK, RNK yoki boshqa nuklein kislotalar bo'lishi mumkin.
- O'simlik hujayralari izolyatsiyasi: Nishon olmoqchi bo'lgan o'simlik hujayralarini ajratib oling. Tajribangizga qarab, bu hujayralar o'simlik to'qimalaridan yoki madaniyatidan ajratilishi mumkin.
- Hujayra suspenziyasi: O'simlik hujayralarini mos muhitda yoki buferda to'xtatib turing. Bu hujayralar sog'lom va genlarni qabul qilish uchun qulay holatda bo'lishini ta'minlash uchun zarurdir.
- Sonicatoringizni sozlang: Amplituda, vaqt, energiya va harorat kabi sonikatsiya parametrlarini oldindan o'rnatish orqali prob tipidagi sonikatorni tayyorlang. Ultrasonik probni hujayra suspenziyasiga botiring.
- Sonikatsiya: Sonikatsiya jarayonini boshlang. Prob uchining tez tebranishi suyuqlikda kavitatsiya pufakchalarini hosil qiladi. Ushbu pufakchalar ultratovush to'lqinlari tufayli kengayadi va yiqilib, suspenziyada mexanik kuchlar va mikro oqim hosil qiladi.
- Sonoporatsiya: Kavitatsiya natijasida hosil bo'lgan mexanik kuchlar va mikrostreaming o'simlik hujayralari membranalarida vaqtinchalik teshiklar va teshiklarni hosil qiladi. Suspenziyada mavjud bo'lgan genetik material bu teshiklar orqali o'simlik hujayralariga kirishi mumkin.
- Inkubatsiya: Sonoporatsiyani davolashdan so'ng, o'simlik hujayralarini tiklash va membranalarini barqarorlashtirish uchun ularni inkubatsiya qiling. Bu hujayraning omon qolishi va genlarning muvaffaqiyatli o'tkazilishini ta'minlash uchun muhim qadamdir.
Agrobakteriyalar yoki lipozomalar orqali genlarni uzatish
O'simlik hujayrasini transfektsiya qilishning ikkita umumiy shakli mavjud. Ular irsiy materialning tashuvchisi sifatida Gram-manfiy bakteriyalar jinsi bo'lgan agrobakteriyalardan yoki lipozomalardan foydalanadilar.
- Agrobacterium vositachiligida sonoporatsiya: Agrobacterium tumefaciens - o'simlik genetik muhandisligida keng qo'llaniladigan bakteriya. Ushbu usulda kerakli genni o'z ichiga olgan plazmid DNK Agrobacteriumga kiritiladi, keyin u o'simlik hujayralari bilan aralashtiriladi. Hujayra suspenziyasi prob tipidagi sonikator yordamida sonoporatsiyaga uchraydi. Ultrasonik energiya genetik materialning Agrobacteriumdan o'simlik hujayralariga o'tishini kuchaytiradi. Bu usul o'simliklarning genetik modifikatsiyasi uchun keng qo'llaniladi.
- Liposoma vositachiligida sonoporatsiya: Liposomalar genetik materialni olib yurishi mumkin bo'lgan lipidga asoslangan pufakchalardir. Ushbu usulda plazmid DNK yoki boshqa nuklein kislotalar bilan yuklangan lipozomalar o'simlik hujayralari bilan aralashtiriladi. Prob tipidagi sonikator yordamida sonoporatsiya o'simlik hujayralari tomonidan lipozomalarning o'zlashtirilishini osonlashtirish uchun qo'llaniladi. Ultratovush lipozomalarning lipid ikki qatlamlarini buzadi, genetik materialni o'simlik hujayralariga chiqaradi. Ushbu yondashuv o'simlik hujayralarida vaqtinchalik gen ekspressiyasini o'rganish uchun foydalidir.
Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) ning ilmiy jihatdan tasdiqlangan afzalliklari
Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) ko'plab o'simlik turlariga qo'llanilgan. O'simlik hujayralari madaniyatini qisqa va nisbatan yumshoq ultratovush bilan davolash sonoporatsiyani keltirib chiqaradi, bu keyinchalik Agrobakteriyaning gen tashuvchisi sifatida chuqur kirib borishiga imkon beradi. Quyida SAAT ning foydali ta'sirini ko'rsatadigan namunali tadqiqotlarni o'qishingiz mumkin.
Sonicator UP200Ht sonoporatsiya orqali gen transfeksiyasi uchun
Ashwagandhaning ultratovush yordamida o'zgarishi
W. somniferada (ashwagandha yoki qishki gilos sifatida tanilgan) transformatsiya samaradorligini oshirish uchun Dehdashti va uning hamkasblari (2016) asetosiringon (AS) va sonikatsiyadan foydalanishni o'rgandilar.
Asetosiringon (AS) uch bosqichda qo'shildi: Agrobacterium suyuq madaniyati, Agrobacterium infektsiyasi va Agrobacterium bilan eksplantlarning birgalikda madaniyati. Agrobacterium suyuq madaniyatiga 75 mkM AS qo'shilishi vir genlarini induktsiya qilish uchun maqbul deb topildi.
Sonikatsiyaning qo'shimcha qo'llanilishi (SAAT) eng yuqori gen ekspressiyasiga olib keldi. Barglar va kurtaklar uchlari mos ravishda 10 va 20 soniya davomida sonikatsiyalanganda tukli ildizlardagi gusA genining ifodasi eng yaxshi ekanligi aniqlandi. Yaxshilangan protokolning transformatsiya samaradorligi barg va kurtak uchi eksplantlarida mos ravishda 66,5 va 59,5% ni tashkil etdi. Boshqa protokollar bilan solishtirganda, ushbu takomillashtirilgan protokolning transformatsiya samaradorligi barglar uchun 2,5 baravar va otish uchlari uchun 3,7 baravar yuqori ekanligi aniqlandi. Southern blot tahlillari W1-W4 qatorlarida gusA transgenining 1-2 nusxasini tasdiqladi, takomillashtirilgan protokol tomonidan yaratilgan W5 liniyasida esa 1-4 transgen nusxasi aniqlandi.
Somnifera bargi (a) va kurtak uchi (b) eksplantlarining transformatsiya chastotasiga sonikatsiya yordamida Agrobakteriya vositachiligidagi transformatsiya (SAAT) davomiyligining ta'siri
(o'rganish va grafik: © Dehdashti va boshqalar, 2016)
UP200St zond tipidagi gomogenizator sonoporatsiya va gen transfeksiyasi uchun
Paxtani ultratovush yordamida o'zgartirish
Hussain va boshqalar. (2007) sonikatsiya yordamida paxta transformatsiyasining foydali ta'sirini ko'rsatadi. Past chastotali ultratovushdan kelib chiqqan akustik kavitatsiya o'simlik to'qimalari yuzasida va ostida mikro yaralar hosil qiladi (sonoporatsiya) va Agrobacteriumning o'simlik to'qimalari bo'ylab chuqurroq va to'liq harakatlanishiga imkon beradi. Ushbu yaralanish modasi to'qimalarda chuqurroq joylashgan o'simlik hujayralarini yuqtirish ehtimolini oshiradi. SAAT ning transformatsiya samaradorligini baholash uchun GUS gen ifodasi o'lchandi. GUS reportyor tizimi reportyor gen tizimi bo'lib, ayniqsa o'simliklar molekulyar biologiyasi va mikrobiologiyasida foydalidir. Turli SAAT parametrlarini sozlash, eksplant sifatida etuk embrionlardan foydalangan holda paxtada GUS vaqtinchalik ifodasi sezilarli darajada yaxshilandi. GUS birinchi marta eksplantlar inkubatsiyasidan 24 soat o'tgach aniqlandi va 48 soat ichida GUS ifodasi juda kuchli bo'ldi, bu sonikatsiya yordamida Agrobacterium vositachiligidagi transformatsiyadan (SAAT) keyin paxta eksplantining muvaffaqiyatli transformatsiyasining foydali ko'rsatkichi bo'lib xizmat qildi. Turli transformatsiya usullarini (masalan, biolistik, Agro, BAAT, SAAT), sonikatsiya yordamida Agrobacterium vositachiligidagi transformatsiyani (SAAT) taqqoslash transformatsiyaning eng yaxshi natijalarini ko'rsatdi.
GUSning vaqtinchalik ifodasi asosida transformatsiya protsedurasini tanlash. Sonication-assisted Agrobacterium-vositali transformatsiya (SAAT) sezilarli darajada yuqori vaqtinchalik ifodani ko'rsatadi.
(o'rganish va grafik: © Hussain va boshqalar, 2007)
Sonoporation va SAAT uchun yuqori samarali ultratovushli echimlar
Hielscher Ultrasonics laboratoriyalar, tadqiqot ob'ektlari, shuningdek, juda yuqori o'tkazuvchanlikka ega bo'lgan sanoat ishlab chiqarishi uchun yuqori samarali ultrasonikatorlarni ishlab chiqish va ishlab chiqarishda uzoq vaqt tajribaga ega. Mikrobiologiya va hayot fanlari uchun Hielscher muayyan to'qimalar va ularni davolash uchun zarur bo'lgan turli talablarni qondirish uchun turli xil echimlarni taklif qiladi. Ko'p sonli namunalarni bir vaqtning o'zida ultratovush qilish uchun Hielscher ko'p teshikli plitalar uchun UIP400MTP, 10 flakongacha (masalan, Eppendorf naychalari) sonication uchun VialTweeter yoki ultratovushli CupHorn ni taklif qiladi. Prob tipidagi ultrasonikatorlar laboratoriya gomogenizatorlari sifatida 50 dan 400 vattgacha, sanoat tizimlari esa 500 vattdan 16 kVtgacha bo'lgan quvvat oralig'ini qamrab oladi.
Iltimos, biz bilan bog'laning va arizangiz va jarayoningiz talablari haqida bizga xabar bering. Bizning tajribali xodimlarimiz sizning biologik jarayoningiz uchun eng mos ultratovush apparatini tavsiya qilishdan mamnun bo'lishadi.
Quyidagi jadvalda ultrasonikatorlarimizning taxminiy qayta ishlash quvvati ko'rsatilgan:
| To'plam hajmi | Oqim darajasi | Tavsiya etilgan qurilmalar |
|---|---|---|
| ko'p teshikli / mikrotitrli plitalar | na | UIP400MTP |
| 10 flakongacha | na | VialTweeter |
| 5 flakon/naychagacha yoki 1 ta kattaroq idish | na | chashka |
| 1 dan 500 ml gacha | 10 dan 200 ml / min | UP100H |
| 10 dan 2000 ml gacha | 20 dan 400 ml / min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 dan 20 L gacha | 0.2 dan 4L/min gacha | UIP2000hdT |
| 10 dan 100 l gacha | 2 dan 10 l / min | UIP4000hdT |
| na | 10 dan 100 l / min | UIP16000 |
| na | kattaroq | ning klasteri UIP16000 |
Biz bilan bog'lanish! / Bizdan so'rang!
Hielscher Ultrasonics laboratoriya, uchuvchi va sanoat miqyosida ilovalar, dispersiya, emulsifikatsiya va ekstraktsiyani aralashtirish uchun yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi.
Adabiyot / Adabiyotlar
- Klimek-Chodacka, Magdalena & Baranski, Rafal (2014): A protocol for sonication-assisted Agrobacterium rhizogenesmediated transformation of haploid and diploid sugar beet (Beta vulgaris L.) explants. Acta biochimica Polonica 2014. 13-17.
- Bing-fu GUO, Yong GUO, Jun WANG, Li-juan ZHANG, Long-guo JIN, Hui-long HONG, Ru-zheng CHANG, Li-juan QIU (2015): Co-treatment with surfactant and sonication significantly improves Agrobacterium-mediated resistant bud formation and transient expression efficiency in soybean. Journal of Integrative Agriculture, Volume 14, Issue 7, 2015. 1242-1250.
- Dehdashti, Sayed Mehdi; Acharjee, Sumita; Kianamiri, Shahla; Deka, Manab (2016): An efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation protocol of Withania somnifera. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 128(1), 2016. 55–65.
- Syed Sarfraz Hussain; Tayyab Husnain; S. Riazuddin (2007): Sonication Assisted Agrobacterium Mediated Transformation (Saat): An Alternative Method For Cotton Transformation. Pak. J. Bot., 39(1), 2007. 223-230.
Hielscher Ultrasonics kompaniyasi yuqori samarali ultratovushli homogenizatorlarni ishlab chiqaradi laboratoriya uchun sanoat hajmi.