Генетична трансформація в рослинних клітинах за допомогою ультразвуку

Опосередкована ультрабактеріями трансформація (SAAT) є ефективним методом інфікування рослинних клітин чужорідними генами з використанням Agrobacterium як транспортера. Ультразвукова кавітація викликає сонопорацію, яку можна охарактеризувати як цілеспрямоване мікрораніння тканин рослин. За допомогою цих ультразвукових утворень мікроран ДНК і ДНК-вектори можуть ефективно транспортуватися в клітинний матрикс.

Сонопорація – Ультразвукове посилення трансформації клітин

Коли низькочастотний ультразвук (приблизно 20 кГц) застосовується до клітинних суспензій, ефекти акустичної кавітації викликають транзиторну проникнення мембрани в клітинні тканини. Цей ультразвуковий ефект відомий як сонопорація і використовується для перенесення генів у клітини або тканини.
Переваги ультразвуку ґрунтуються на його нетермічному механічному принципі роботи, що робить ультразвук часто більш універсальним і менш залежним від типів клітин. Різнобічне застосування сонопорації відкриває можливість для використання трансгенних рослин, які мають значний потенціал у біовиробництві складних терапевтичних білків людини. Такі біореактори на рослинній основі можуть бути легко генетично маніпульовані, запобігають потенційному забрудненню патогенами людини, не пошкоджують бактерії, що опосередковують трансформацію (наприклад, Agrobacterium) і є недорогим та ефективним методом біосинтезу.

Трансформація клітин за допомогою ультразвуку

Ультразвукова хвороба – це методика, яка застосовує низькочастотні ультразвукові хвилі для перемішування частинок у розчині, для змішування розчинів, тим самим збільшуючи швидкість масопереносу та розчинення. Одночасно ультразвукове дослідження може видаляти розчинені гази з рідин. При перетворенні рослин ультразвук викличе утворення мікроран на тканинах рослин і посилить доставку оголеної ДНК в протопласт рослини.

Для генетичної трансформації перевагою є метод ультразвукової трансформації (SAAT), який має значно вищу ефективність, ніж ультразвукове дослідження, яке використовується для перенесення голих ДНК та ДНК-векторів безпосередньо в протопласт. Численні дослідження продемонстрували, що ультразвукова трансформація за допомогою Agrobacterium-опосередкованої трансформації (SAAT) може використовуватися для індукції механічного руйнування та утворення ран на клітинах рослин ультразвуковими хвилями та акустичною кавітацією, що виникає. При нетривалому ультразвуковому лікуванні на поверхні експлантів утворюються мікрорани. Так як поранені клітини дозволять проникнути агробактерії в більш глибоку частину тканин рослин, тим самим підвищуючи ймовірність зараження рослинних клітин. Крім того, фенольні сполуки, що виділяються, підсилюють перетворення. Мікрорани, що генеруються ультразвуком, також роблять більш можливим проникнення бактерій в експлант. SAAT був успішно використаний для генетичної трансформації видів рослин, які особливо вважаються стійкими до Agrobacterium.
Будучи дуже простим і недорогим методом, а також значне посилення перенесення генів, опосередкованих Agrobacterium, є основними перевагами SAAT. Окрім успішного застосування SAAT у трансформації Chenopodium rubrum L. та Beta vulgaris L., цей підхід також був застосований у виробництві рекомбінантних ад'ювантів до термолабільного голотоксину дикого типу Escherichia coli та мутантних LT вакцин Escherichia coli у Nicotiana tabacum, в яких у птахів були виявлені найвищі системні титри IgG, специфічні для LT-B.
(пор. Laere et al., 2016; М. Клімек-Ходацька та Р. Баранський, 2014)

Загальний порядок перенесення генів шляхом сонопорації в рослинних клітинах

1. Підготовка генетичного матеріалу: Почніть з підготовки генетичного матеріалу, який ви хочете ввести в рослинні клітини. Це може бути плазмідна ДНК, РНК або інші нуклеїнові кислоти.
2. Виділення рослинних клітин: Ізолюйте рослинні клітини, на які ви хочете націлитися. Залежно від вашого експерименту, ці клітини можуть бути виділені з рослинних тканин або культур.
3. Суспензія клітин: Підвісьте клітини рослини в підходящому середовищі або буфері. Це важливо для забезпечення того, щоб клітини були здоровими та перебували у стані, сприятливому для засвоєння генів.
4. Налаштуйте свій Sonicator: Підготуйте свій ультразвуковий апарат, попередньо встановивши параметри ультразвуку, такі як амплітуда, час, енергія та температура. Занурте ультразвуковий зонд в підвіску клітини.
5. Ультразвукова хвороба: Приступайте до процедури ультразвукового дослідження. Швидке коливання кінчика зонда створює кавітаційні бульбашки в рідині. Ці бульбашки розширюються і руйнуються під дією ультразвукових хвиль, створюючи механічні сили і мікропотоки в підвісці.
6. Сонопорація: Механічні сили та мікропотоки, що виникають під час кавітації, створюють тимчасові пори та отвори в мембранах рослинних клітин. Генетичний матеріал, присутній в суспензії, може через ці пори потрапляти в клітини рослин.
7. Інкубаційний: Після процедури сонопорації проведіть інкубацію клітин рослини, щоб дозволити їм відновитися і стабілізувати мембрани. Це важливий крок для забезпечення виживання клітин та успішного перенесення генів.

Перенесення генів через агробактерії або ліпосоми

Існує дві поширені форми трансфектації рослинної клітини. Вони використовують або агробактерію, рід грамнегативних бактерій, або ліпосоми як носій генетичного матеріалу.

• Сонопорація, опосередкована агробактеріями: Agrobacterium tumefaciens — бактерія, яка широко використовується в генній інженерії рослин. При цьому методі в Agrobacterium вводиться плазмідна ДНК, що містить потрібний ген, який потім змішується з рослинними клітинами. Клітинну суспензію піддають сонопорації за допомогою зондового типу ультразвукового апарату. Ультразвукова енергія підсилює перенесення генетичного матеріалу від Agrobacterium до клітин рослин. Цей метод широко використовується для генетичної модифікації рослин.
• Сонопорація, опосередкована ліпосомами: Ліпосоми – це везикули на основі ліпідів, які можуть переносити генетичний матеріал. У цьому методі ліпосоми, завантажені плазмідною ДНК або іншими нуклеїновими кислотами, змішуються з рослинними клітинами. Сонопорація за допомогою сонікатора зондового типу використовується для полегшення поглинання ліпосом рослинними клітинами. Ультразвук порушує ліпідні бішари ліпосом, вивільняючи генетичний матеріал в рослинні клітини. Цей підхід корисний для вивчення транзиторної експресії генів у рослинних клітинах.

Науково доведені переваги трансформації, опосередкованої агробактеріями за допомогою ультразвуку (SAAT)

Опосередкована ультразвуком трансформація агробактерій (SAAT) була застосована до багатьох видів рослин. Коротка і відносно м'яка ультразвукова обробка культур рослинних клітин викликає сонопорацію, що згодом дозволяє глибоко проникнути в організм Agrobacterium як транспортер генів. Нижче ви можете ознайомитися з зразковими дослідженнями, що демонструють сприятливий вплив SAAT.

Ультразвукова трансформація ашваганди

З метою підвищення ефективності трансформації W. somnifera (відомої як ашваганда або зимова вишня) Дехдашті та його колеги (2016) досліджували використання ацетосирингону (АС) та ультразвукову діагностику.
Ацетосирингон (АС) вводили в три етапи: рідку культуру Agrobacterium, інфекцію Agrobacterium та спільну культуру експлантів з Agrobacterium. Додавання 75 мкМ АС до рідкої культури Agrobacterium було визнано оптимальним для індукції вірусних генів.
Додаткове застосування ультразвукової діагностики (SAAT) призвело до найвищої експресії генів. Було виявлено, що експресія гена gusA у волохатих коренях найкраща, коли листя та кінчики пагонів були ультразвуковими протягом 10 та 20 років відповідно. Ефективність трансформації вдосконаленого протоколу була зафіксована 66,5 та 59,5% у випадку експлантів листя та верхівок пагонів відповідно. При порівнянні з іншими протоколами, ефективність трансформації цього вдосконаленого протоколу виявилася в 2,5 рази вище для листя і в 3,7 рази більше для кінчиків пагонів. Аналіз південних блот підтвердив 1–2 копії трансгена gusA у лініях W1-W4, тоді як 1–4 трансгенні копії були виявлені в лінії W5, згенерованій удосконаленим протоколом.

Вплив тривалості опосередкованої ультразвуком трансформації Agrobacterium-опосередкованої трансформації (SAAT) на частоту трансформації експлантів листка W. somnifera (a) та кінчика пагона (b)
(дослідження та графіка: © Dehdashti et al., 2016)

Ультразвукова трансформація бавовни

Hussain et al. (2007) демонструють сприятливий вплив трансформації бавовни за допомогою ультразвуку. Акустична кавітація, викликана низькочастотним ультразвуком, створює мікрорани на поверхні рослинної тканини та під нею (сонопорація) і дозволяє Agrobacterium подорожувати глибше та повністю по всій тканині рослини. Такий спосіб поранення збільшує ймовірність інфікування клітин рослин, що залягають глибше в тканинах. Для того, щоб оцінити ефективність трансформації SAAT, було виміряно експресію гена GUS. Репортерна система GUS — це репортерна генна система, особливо корисна в молекулярній біології рослин та мікробіології. Регулюючи різні параметри SAAT, транзиторна експресія GUS у бавовні з використанням зрілих ембріонів як експланту була значно посилена. GUS вперше був виявлений через 24 години після інкубації експлантів, а до 48 год експресія GUS була дуже інтенсивною, що служило корисним показником успішної трансформації бавовняного експланта після ультразвукової трансформації за допомогою Agrobacterium, опосередкованої трансформацією (SAAT). Порівняння різних методів трансформації (а саме біологічної, Agro, BAAT, SAAT), ультразвукової Agrobacterium-опосередкованої трансформації (SAAT) показало на сьогоднішній день найкращі результати трансформації.

Вибір процедури перетворення на основі перехідної експресії ГУС. Трансформація Agrobacterium, опосередкована ультразвуком (SAAT), демонструє значно вищу транзиторну експресію.
(дослідження та графіка: © Hussain et al., 2007)

Високоефективні ультразвукові рішення для сонопорації та SAAT

Компанія Hielscher Ultrasonics має багаторічний досвід у розробці та виробництві високопродуктивних ультразвукових апаратів для лабораторій, науково-дослідних установ, а також промислового виробництва з дуже високою пропускною здатністю. Для мікробіології та наук про життя компанія Hielscher пропонує різні рішення для задоволення різних вимог, необхідних для конкретних тканин та їх лікування. Для одночасного ультразвукового дослідження численних зразків компанія Hielscher пропонує UIP400MTP для багатолункових пластин, VialTweeter для ультразвукового дослідження до 10 флаконів (наприклад, трубки Eppendorf) або ультразвуковий CupHorn. Ультразвукові апарати зондового типу випускаються від 50 до 400 Вт як лабораторні гомогенізатори, тоді як промислові системи охоплюють діапазон потужності від 500 Вт до 16 кВт.
Будь ласка, зв'яжіться з нами та повідомте нам про вимоги до вашої заявки та процесу. Наш досвідчений персонал з радістю порекомендує найбільш підходящий ультразвуковий апарат для вашого біологічного процесу.
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну потужність обробки наших ультразвукових апаратів: