Генетична трансформація в рослинних клітинах за допомогою ультразвуку

Трансформація за посередництва Agrobacterium, посилена ультразвуковою обробкою (SAAT), є ефективним методом інфікування рослинних клітин чужорідними генами з використанням Agrobacterium як транспортера. Ультразвукова кавітація спричиняє сонопорацію, яку можна описати як цільове мікропошкодження рослинної тканини. Через ці створені ультразвуком мікрорани ДНК та вектори ДНК можуть ефективно транспортуватися в клітинну матрицю.

Сонопорація – трансформація клітин, посилена ультразвуком

Коли низькочастотний ультразвук (прибл. 20kHz) застосовується до суспензій клітин, ефекти акустичної кавітації спричиняють тимчасову пермеабілізацію мембран на клітинних тканинах. Цей ультразвуковий ефект відомий як сонопорація і використовується для перенесення генів у клітини або тканини.
Переваги ультразвукової обробки ґрунтуються на її нетермічному механічному принципі дії, що робить ультразвукову обробку часто більш універсальною та менш залежною від типів клітин. Універсальне застосування сонопорації відкриває можливість використання трансгенних рослин, які мають значний потенціал у біопроцесі складних терапевтичних білків людини. Такі рослинні біореактори можуть бути легко генетично модифіковані, запобігають потенційному забрудненню людськими патогенами, не пошкоджують бактерії, що медіюють трансформацію (наприклад, Agrobacterium), і є недорогим, ефективним методом біосинтезу.

Трансформація клітин за посередництва ультразвуку

Ультразвукова обробка – це техніка, яка застосовує низькочастотні ультразвукові хвилі для перемішування частинок у розчині, змішування розчинів, тим самим збільшуючи швидкість масоперенесення та розчинення. Одночасно ультразвукова обробка може видаляти розчинені гази з рідин. У трансформації рослин ультразвукова обробка спричиняє утворення мікроран на рослинній тканині та покращує доставку голої ДНК у рослинний протопласт.

Для генетичної трансформації трансформація за посередництва Agrobacterium, посилена ультразвуковою обробкою (SAAT), є переважним методом і має значно вищу ефективність, ніж ультразвукова обробка, що використовується для перенесення голої ДНК та векторів ДНК безпосередньо в протопласт. Численні дослідження продемонстрували, що трансформація за посередництва Agrobacterium, посилена ультразвуковою обробкою (SAAT), може використовуватися для індукції механічного руйнування та утворення ран на рослинних клітинах за допомогою ультразвукових хвиль та resulting акустичної кавітації. Коротка ультразвукова обробка створює мікрорани на поверхні експлантів. Оскільки пошкоджені клітини дозволяють проникнення Agrobacterium у глибші частини рослинних тканин, тим самим збільшуючи ймовірність інфікування рослинних клітин. Додатково, секретовані фенольні сполуки посилюють трансформацію. Створені ультразвуком мікрорани роблять проникнення експлантів бактеріями також більш здійсненним. SAAT успішно використовувався для генетичної трансформації у видів рослин, які особливо вважаються стійкими до Agrobacterium.
Будучи дуже простим та недорогим методом, а також значне посилення перенесення генів за посередництва Agrobacterium є основними перевагами SAAT. Окрім успішного застосування SAAT у трансформації Chenopodium rubrum L. та Beta vulgaris L., цей підхід також був застосований у виробництві рекомбінантного термостабільного холотоксину дикого типу Escherichia coli та ад’ювантів вакцини LT-мутантів Escherichia coli у Nicotiana tabacum, у яких були виявлені найвищі системні титри IgG, специфічних до LT-B, у птахів.
(пор. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Загальна процедура перенесення генів через сонопорацію в рослинних клітинах

1. Підготовка генетичного матеріалу: Почніть з підготовки генетичного матеріалу, який ви хочете ввести в рослинні клітини. Це може бути ДНК плазміди, РНК або інші нуклеїнові кислоти.
2. Ізоляція рослинних клітин: Ізолюйте рослинні клітини, які ви хочете цільово обробити. Залежно від вашого експерименту, ці клітини можуть бути ізольовані з рослинних тканин або культур.
3. Суспензія клітин: Суспензуйте рослинні клітини у відповідному середовищі або буфері. Це суттєво для забезпечення того, щоб клітини були здоровими та перебували в стані, сприятливому для поглинання генів.
4. Налаштуйте свій ультразвуковий гомогенізатор: Підготуйте ваш ультразвуковий гомогенізатор зондового типу, попередньо встановивши параметри ультразвукової обробки, такі як амплітуда, час, енергія та температура. Занурьте ультразвуковий зонд у суспензію клітин.
5. Ультразвукова обробка: Розпочніть процедуру ультразвукової обробки. Швидкі коливання кінчика зонда генерують бульбашки кавітації в рідині. Ці бульбашки розширюються та колапсують через ультразвукові хвилі, створюючи механічні сили та мікрострумені в суспензії.
6. Сонопорація: Механічні сили та мікрострумені, що генеруються кавітацією, створюють тимчасові пори та отвори в мембранах рослинних клітин. Генетичний матеріал, присутній у суспензії, може проникати в рослинні клітини через ці пори.
7. Інкубація: Після обробки сонопорацією інкубуйте рослинні клітини, щоб дозволити їм відновитися та стабілізувати свої мембрани. Це критичний етап для забезпечення виживання клітин та успішного переносу генів.

Перенос генів за допомогою Agrobacterium або ліпосом

Існують дві поширені форми трансфекції рослинних клітин. Вони використовують або Agrobacterium, рід грамнегативних бактерій, або ліпосоми як носії генетичного матеріалу.

• Сонопорація, опосередкована Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens – це бактерія, яка широко використовується в генетичній інженерії рослин. У цьому методі плазмідна ДНК, що містить потрібний ген, вводиться в Agrobacterium, який потім змішується з рослинними клітинами. Суспензія клітин піддається сонопорації за допомогою ультразвукового гомогенізатора зондового типу. Ультразвукова енергія посилює перенос генетичного матеріалу з Agrobacterium у рослинні клітини. Цей метод широко використовується для генетичної модифікації рослин.
• Сонопорація, опосередкована ліпосомами: Ліпосоми – це везикули на основі ліпідів, які можуть нести генетичний матеріал. У цьому методі ліпосоми, навантажені плазмідною ДНК або іншими нуклеїновими кислотами, змішуються з рослинними клітинами. Сонопорація за допомогою ультразвукового гомогенізатора зондового типу використовується для полегшення поглинання ліпосом рослинними клітинами. Ультразвук руйнує ліпідні бішари ліпосом, вивільняючи генетичний матеріал у рослинні клітини. Цей підхід корисний для досліджень тимчасової експресії генів у рослинних клітинах.

Науково доведені переваги трансформації, опосередкованої Agrobacterium та асистованої ультразвуковою обробкою (SAAT)

Трансформація, опосередкована Agrobacterium та асистована ультразвуковою обробкою (SAAT), була застосована до численних видів рослин. Коротка та відносно м’яка ультразвукова обробка культур рослинних клітин спричиняє сонопорацію, яка згодом дозволяє глибоке проникнення Agrobacterium як транспортера генів. Нижче ви можете прочитати прикладні дослідження, що демонструють позитивні ефекти SAAT.

Ультразвуково-асистована трансформація Ashwagandha

Щоб підвищити ефективність трансформації у W. somnifera (відомої як ашваганда або зимовий вишневий кущ), Dehdashti та колеги (2016) досліджували використання ацетосирінгону (AS) та ультразвукової обробки.
Ацетосирінгон (AS) додавали на трьох етапах: рідка культура Agrobacterium, інфекція Agrobacterium та ко-культура експлантів з Agrobacterium. Виявлено, що додавання 75 μM AS до рідкої культури Agrobacterium є оптимальним для індукції генів вірулентності (vir).
Додаткове застосування ультразвукової обробки (SAAT) призвело до найвищої експресії генів. Експресію гена gusA у волосоподібних коренях виявлено найкращою, коли листя та верхівки пагонів обробляли ультразвуком протягом 10 та 20 с відповідно. Ефективність трансформації за покращеного протоколу становила 66,5 та 59,5% для експлантів листя та верхівок пагонів відповідно. У порівнянні з іншими протоколами ефективність трансформації за цим покращеним протоколом виявилася у 2,5 раза вищою для листя та у 3,7 раза вищою для верхівок пагонів. Аналізи за методом Саутерн-блоту підтвердили наявність 1–2 копій трансгену gusA у лініях W1-W4, тоді як 1–4 копії трансгену були виявлені у лінії W5, отриманій за покращеним протоколом.

Вплив тривалості трансформації за допомогою Agrobacterium, посиленої ультразвуком (SAAT), на частоту трансформації експлантів листя (a) та верхівок пагонів (b) W. somnifera
(дослідження та графік: © Dehdashti et al., 2016)

Ультразвукова трансформація бавовнику

Hussain et al. (2007) демонструють позитивний вплив трансформації бавовнику, посиленої ультразвуком. Акустична кавітація, спричинена низькочастотним ультразвуком, створює мікрорани на поверхні та під поверхнею рослинної тканини (сонопорація) і дозволяє Agrobacterium проникати глибше та повністю через рослинну тканину. Таке пошкодження збільшує ймовірність інфікування клітин рослин, розташованих глибше в тканині. Для оцінки ефективності трансформації SAAT вимірювали експресію гена GUS. Система репортера GUS є репортерною генною системою, особливо корисною в молекулярній біології рослин та мікробіології. Коригування різних параметрів SAAT значно підвищило тимчасову експресію GUS у бавовнику з використанням зрілих ембріонів як експлантів. GUS було вперше виявлено через 24 год після інкубації експлантів, а через 48 год експресія GUS була дуже інтенсивною, що слугувало корисним індикатором успішної трансформації експлантів бавовнику після трансформації за допомогою Agrobacterium, посиленої ультразвуком (SAAT). Порівняння різних методів трансформації (а саме біолістичного, Agro, BAAT, SAAT) показало, що трансформація за допомогою Agrobacterium, посилена ультразвуком (SAAT), дає значно кращі результати трансформації.

Вибір процедури трансформації на основі тимчасової експресії GUS. Трансформація за допомогою Agrobacterium, посилена ультразвуком (SAAT), демонструє значно вищу тимчасову експресію.
(дослідження та графік: © Hussain et al., 2007)

Високоефективні ультразвукові рішення для сонопорації та SAAT

Hielscher Ultrasonics має багаторічний досвід у розробці та виробництві високоефективних ультразвукових гомогенізаторів для лабораторій, дослідницьких установ, а також промислового виробництва з дуже високою продуктивністю. Для мікробіології та наук про життя Hielscher пропонує різноманітні рішення, що відповідають різним вимогам, необхідним для специфічних тканин та їхньої обробки. Для одночасної ультразвукової обробки численних зразків Hielscher пропонує UIP400MTP для багатолуночних планшетів, VialTweeter для ультразвукової обробки до 10 флаконів (наприклад, пробірок Eppendorf) або ультразвуковий CupHorn. Потужність зондових ультразвукових гомогенізаторів становить від 50 до 400 ват для лабораторних гомогенізаторів і від 500 ват до 16kW для промислових систем.
Зв’яжіться з нами та повідомте про ваші завдання та вимоги до процесу. Наш досвідчений персонал буде радий порекомендувати найбільш підходящий ультразвуковий гомогенізатор для вашого біологічного процесу.
Наведена нижче таблиця дає уявлення про приблизну продуктивність обробки наших ультразвукових гомогенізаторів: