Перетворення агробактерій, опосередкованих ультразвуковою системою (SAAT), є ефективним методом зараження клітин рослин чужорідними генами, використовуючи Агробактерію як транспортер. Ультразвукова кавітація викликає сонопоратацію, яку можна охарактеризувати як цілеспрямоване мікромотування рослинної тканини. За допомогою них ультразвуково створюються мікрорани, вектори ДНК і ДНК можуть бути ефективно транспортовані в клітинну матрицю.

сонопоратизація – Ультразвукове розширене перетворення клітин

При застосуванні низькочастотного ультразвуку (приблизно 20кГц) до клітинних суспензій ефекти акустичної кавітації викликають транзиторну проникність мембрани на клітинних тканинах. Цей ультразвуковий ефект відомий як сонопоратизація і використовується для перенесення генів у клітини або тканини.
Переваги ультразвуку засновані на його нетермічному механічному принципі роботи, що робить ультразвукову обробку часто більш універсальною і менш залежною від типів клітин. Різнобічне застосування сонопоратації відкриває можливість утилізації трансгенних рослин, які мають значний потенціал у біопродукції складних лікувальних білків людини. Такими біореакторами на рослинній основі можна легко генетично маніпулювати, запобігати потенційному забрудненню патогенами людини, не пошкоджувати бактерії-носії трансформації (наприклад, Агробактерії) та є недорогим, ефективним методом біосинтезу.

Ультразвукова трансформація клітин

Ультразвукова обробка - це методика, яка застосовує низькочастотні ультразвукові хвилі для збовтування частинок в розчині, для змішування розчинів, тим самим збільшуючи швидкість масообміну і розчинення. Одночасно ультразвукова обробка може видаляти розчинені гази з рідин. У трансформації рослин ультразвукова обробка спричинить утворення мікромоундів на тканині рослин і посилить доставку голої ДНК у протопласт рослини.

Для генетичної трансформації, Sonication-Assisted Agrobacterium-опосередкована трансформація (SAAT) є кращим методом і має значно вищу ефективність, ніж ультразвукова обробка, що використовується для передачі оголених векторів ДНК і ДНК безпосередньо в протопласт. Численні дослідження продемонстрували, що ультразвукова обробка, опосередкована агробактеріями трансформація (SAAT), може використовуватися для індукції механічного порушення та утворення ран на клітинах рослин ультразвуковими хвилями та отриманою акустичною кавітацією. Коротка ультразвукова обробка створює мікрорани на поверхні експлантів. Оскільки поранені клітини дозволять проникнути Агробактерії в більш глибоку частину тканин рослин, тим самим підвищуючи ймовірність зараження клітин рослин. Додатково виділяються фенольні сполуки підсилюють трансформацію. Ультразвуково генеровані мікрорани роблять проникнення експлантатів бактеріями також більш здійсненним. СААТ успішно використовувався для генетичної трансформації у видах рослин, які особливо вважалися стійкими до агробактерій.
Будучи дуже простим і недорогим методом, а також значне посилення переносу генів, опосередкованих агробактеріями, є основними перевагами SAAT. Крім успішного застосування СААТ при трансформації Chenopodium rubrum L. і Beta vulgaris L., цей підхід також був застосований у виробництві рекомбінантних Escherichia coli дикого типу термолабільного голотоксину і Escherichia coli мутантних LT-вакцин ад'ювантів в Nicotiana tabacum, в яких найвищі системні ЛТ-В-специфічні титри IgG були виявлені у птахів.
(пор. Лаер та ін., 2016; М. Климек-Ходацька та Р. Баранський, 2014)

Загальна процедура перенесення генів через сонпорацію в рослинних клітинах

1. Підготовка генетичного матеріалу: Почніть з підготовки генетичного матеріалу, який ви хочете ввести в клітини рослин. Це може бути плазмідна ДНК, РНК або інші нуклеїнові кислоти.
2. Виділення рослинних клітин: Ізолюйте рослинні клітини, на які ви хочете націлитися. Залежно від експерименту, ці клітини можуть бути виділені з рослинних тканин або культур.
3. Клітинна суспензія: Підвісьте клітини рослини у відповідному середовищі або буфері. Це важливо для того, щоб клітини були здоровими і перебували в стані, сприятливому для поглинання генів.
4. Налаштуйте свій Sonicator: Підготуйте свій ультразвуковий пристрій типу зонда, попередньо встановивши параметри ультразвукової обробки, такі як амплітуда, час, енергія та температура. Занурте ультразвуковий зонд в клітинну суспензію.
5. Удосконалення: Почніть процедуру ультразвукової обробки. Швидке коливання наконечника зонда генерує кавітаційні бульбашки в рідині. Ці бульбашки розширюються і руйнуються за рахунок ультразвукових хвиль, створюючи механічні сили і мікропотік в суспензії.
6. Сонопорація: Механічні сили і мікропотік, що генеруються кавітацією, створюють тимчасово пори і отвори в мембранах рослинних клітин. Генетичний матеріал, присутній в суспензії, може потрапляти в клітини рослин через ці пори.
7. Інкубаційний: Після сонопораційного лікування інкубують рослинні клітини, щоб вони могли відновитися і стабілізувати свої мембрани. Це найважливіший крок для забезпечення виживання клітин і успішного перенесення генів.

Передача генів через Agrobacterium або ліпосоми

Існує дві поширені форми трансфекту рослинної клітини. Вони використовують або агробактерію, рід грамнегативних бактерій, або ліпосоми як носія генетичного матеріалу.

• Агробактерія-опосередкована сонопорація: Agrobacterium tumefaciens — бактерія, яка зазвичай використовується в генній інженерії рослин. При цьому методі плазмідна ДНК, що містить потрібний ген, вводиться в Agrobacterium, яка потім змішується з рослинними клітинами. Клітинна суспензія піддається сонопорації за допомогою ультразвукового апарату зондового типу. Ультразвукова енергія підсилює передачу генетичного матеріалу від Agrobacterium до клітин рослин. Цей метод широко використовується для генетичної модифікації рослин.
• Ліпосомно-опосередкована сонопорація: Ліпосоми - це бульбашки на основі ліпідів, які можуть переносити генетичний матеріал. У цьому методі ліпосоми, завантажені плазмідною ДНК або іншими нуклеїновими кислотами, змішуються з рослинними клітинами. Сонопорація з використанням зондового звукового апарату використовується для полегшення поглинання ліпосом рослинними клітинами. Ультразвук порушує ліпідні бішари ліпосом, вивільняючи генетичний матеріал у клітини рослин. Цей підхід корисний для досліджень експресії транзиторних генів у рослинних клітинах.

Науково доведені переваги трансформації агробактерій, опосередкованої ультразвуковою обробкою (SAAT)

Перетворення, опосередковане обробкою агробактерій за допомогою ультразвукової обробки (SAAT), було застосовано до численних видів рослин. Коротка і відносно м'яка ультразвукова обробка культур рослинних клітин викликає сонопоратацію, що згодом дозволяє глибоко проникнути Агробактерії як транспортера генів. Нижче ви можете прочитати зразкові дослідження, що демонструють благотворний вплив SAAT.

Ультразвукова трансформація Ашваганди

З метою підвищення ефективності трансформації у W. somnifera (відомої як ашваганда або зимова вишня), Дехдашті та колеги (2016) досліджували використання ацетосирінгону (AS) та ультразвукової обробки.
Ацетосирингон (АС) додавався в три етапи: рідка культура Агробактерія, Агробактеріональна інфекція і спільне вирощування експлантатів з Агробактерією. Було визнано, що додавання 75 мкМ AS до рідкої культури Agrobacterium є оптимальним для індукції генів vir.
Додаткове застосування ультразвукової обробки (SAAT) призвело до найвищої експресії генів. Експресія гена gusA у волосистих коренях була визнана найкращою, коли листя та кінчики пагонів були ультразвуковими протягом 10 та 20 років відповідно. Ефективність трансформації вдосконаленого протоколу була зафіксована 66,5 і 59,5% у випадку з експлантами листового і стрілчастого наконечника відповідно. У порівнянні з іншими протоколами ефективність трансформації цього вдосконаленого протоколу була виявлена в 2,5 рази вище для листя і в 3,7 рази більше для наконечників пагонів. Аналізи Southern blot підтвердили 1–2 копії трансгену gusA в лініях W1-W4, тоді як 1–4 трансгенні копії були виявлені в лінії W5, згенерованої вдосконаленим протоколом.

Вплив тривалості ультразвукової агробактерії опосередкованої трансформації (СААТ) на частоту трансформації експлантатів W. somnifera leaf (a) та кінчика пагона (b)
(дослідження і графіка: © Дехдашті та ін., 2016)

Ультразвукова трансформація бавовни

Hussain et al. (2007) демонструють сприятливий вплив трансформації бавовни за допомогою ультразвукової обробки. Акустична кавітація, викликана низькочастотним ультразвуком, створює мікрорани на поверхні тканин рослин і під нею (сонопоратація) і дозволяє Агробактерії подорожувати глибше і повністю по всій тканині рослини. Така мода на поранення збільшує ймовірність зараження клітин рослин, що лежать глибше в тканинах. Для того щоб оцінити ефективність трансформації SAAT, була виміряна експресія генів GUS. Репортерська система GUS - це репортерська генна система, особливо корисна в молекулярній біології рослин і мікробіології. Регулюючи різні параметри SAAT, перехідна експресія GUS у бавовні з використанням зрілих ембріонів як експлантата була значно посилена. GUS був вперше виявлений через 24 години після інкубації експлантів і до 48h, експресія GUS була дуже інтенсивною, що послужило корисним показником успішної трансформації бавовняного експлантата після ультразвукової обробки, опосередкованої агробактеріями (SAAT). Порівняння різних методів трансформації (а саме біолістичних, Agro, BAAT, SAAT), ультразвукової трансформації, опосередкованої агробактеріями (SAAT), показало, безумовно, найкращі результати трансформації.

Вибір процедури перетворення на основі перехідного вираження ГУС. Перетворення, опосередковане засобами ультразвукової обробки агробактерій (SAAT), демонструє значно вищу перехідну експресію.
(дослідження і графіка: © Хуссейн та ін., 2007)

Високопродуктивні ультразвукові рішення для сонополяції та SAAT

Hielscher Ultrasonics давно має досвід у розробці та виробництві високопродуктивних ультразвукових апаратів для лабораторій, науково-дослідних установ, а також промислового виробництва з дуже високою пропускною здатністю. Для мікробіології та науки про життя Hielscher пропонує різні рішення для задоволення різних вимог, необхідних для конкретних тканин та їх лікування. Для одночасного ультразвукового дослідження численних зразків Hielscher пропонує UIP400MTP для багатодушних пластин, VialTweeter для ультразвукової обробки до 10 флаконів (наприклад, трубки Еппендорфа) або ультразвуковий CupHorn. Ультразвукові пристрої зондового типу доступні від 50 до 400 Вт як лабораторні гомогенізатори, тоді як промислові системи охоплюють діапазон потужності від 500 Вт до 16 кВт.
Будь ласка, зв'яжіться з нами та повідомте нам про свої вимоги до заявки та процесу. Наш досвідчений персонал буде радий порекомендувати найбільш підходящий ультразвуковий пристрій для вашого біологічного процесу.
У таблиці нижче наведено приблизну потужність обробки наших ультразвукових пристроїв: