UIP400MTP Sonicator kullanarak Prionların Yüksek Verimli Tespiti için PMCA

UIP400MTP çok kuyulu plaka sonikatörü, protein yanlış katlanan döngüsel amplifikasyonda (PMCA) yüksek verimli numune hazırlama için güçlü bir çözüm sunar. Birden fazla kuyu boyunca tek tip enerji dağılımı sağlayarak ve hassas sonikasyon parametrelerini koruyarak, bu sistem olağanüstü tekrarlanabilirlik ile çok sayıda numunenin aynı anda işlenmesini sağlar. Bu yetenekler, tahlil inhibitörlerinin sonuçları gizleyebileceği tükürük gibi zorlu biyolojik örneklerde düşük konsantrasyonlarda prionları tespit etmek için PMCA'yı optimize etmek için kritik öneme sahiptir.

Servidlerde kronik israf hastalığı (CWD) ve insanlarda Creutzfeldt-Jakob hastalığı (CJD) gibi prion hastalıkları, yanlış katlanmış prion proteinlerinin (PrP^Sc). Bu hastalıklar genellikle tükürük, kan ve idrar gibi vücut sıvılarında düşük seviyelerde enfeksiyöz prionlar içerir ve bu da tanı ve araştırmayı zorlaştırır. CWD'nin çevresel matrislerde dökülen prionlar yoluyla yatay iletimi, yaban hayatı yönetimi ve ekolojik sağlık için özellikle önemli etkilere sahiptir. Benzer şekilde, Creutzfeldt-Jakob hastalığı gibi hastalıklarda, insan örneklerinden yanlış katlanmış prion proteinlerinin güvenilir bir şekilde amplifikasyonu, teşhisi ilerletmek ve hastalığın ilerlemesini anlamak için çok önemlidir.

Modifiye edilmiş bir PMCA protokolünün uygulanması, yaygın tahlil inhibitörlerini (örneğin, tükürükteki müsinler) atlamaya ve gerçek zamanlı sarsıntı kaynaklı dönüşüm (RT-QuIC) gibi teknikler kullanılarak aksi takdirde tespit edilemeyen veya belirsiz olan prionları tespit etmede yüksek hassasiyet elde etmeye izin verir. Bu gelişmeler, çeşitli hastalıklar için prion tespitini geliştirerek, PMCA'yı prion araştırması ve teşhisi için vazgeçilmez bir araç haline getirir. Çok kuyulu plakalı sonikatör UIP400MTP, mikroplakalarda (örneğin 6, 24 veya 96 oyuklu plakalar) veya bir tüp rafındaki şişelerde çok sayıda numuneyi sonikleştiren yüksek verimli PMCA'yı kolaylaştırır.

Yüksek Verimli Protein Yanlış Katlama Döngüsel Amplifikasyonu (PMCA) Protokolü

Aşağıdaki protokol, sağlam araştırma sonuçları için yüksek numune sayısının tam olarak aynı koşullar altında verimli bir şekilde işlenmesine izin verir.

Numune Hazırlama

Başlangıç malzemesi:
Numuneleri şu şekilde hazırlayın:

• PMCA substratında sarkosil ekstraksiyon peletlerinin yeniden askıya alınması.
• Doğrudan iğneli beyin homojenatları veya prion tohumları ile kan örnekleri.

Substrat:

• Aşırı PrP eksprese eden transgenik farelerden hazırlanan% 10 (ağırlıkça / hacim) beyin homojenatı kullanın^C (örneğin, Tg fareleri).
• Beyin dokusunu şu şekilde homojenize edin:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – % 1 Triton X-100.
• Alt tabakayı kullanana kadar -80ºC'de saklayın.

Mikroplaka veya tüplerde numune kurulumu:
Tüp:

• 90 μL beyin homojenat substratı ekleyin ve 10 μL numune ile tohumlayın (örn. kan, beyin homojenatı veya sarkosil peleti).
• Her 0,2 mL'lik tüpe 3 Teflon boncuk (1,59 mm veya 2,38 mm çap) yerleştirin.
• Tüpleri UIP400MTP sonikatörü ile uyumlu bir rafa monte edin.

6 Kuyulu Mikroplaka:

• 5 mL beyin homojenat substratı ekleyin ve kuyucuk başına 500 μL numune ile tohumlayın.
• Her oyuğa 3 Teflon boncuk ekleyin.

PMCA Prosedürü

Yerleştirme:
Tüp rafını veya 6 oyuklu mikroplakayı, üreticinin talimatlarına göre UIP400MTP sonikatörüne yerleştirin.

Bisiklet Programı:
144 PMCA döngüsünü aşağıdaki gibi gerçekleştirin:

• Kuluçka: 37 ° C'de 29 dakika 30 saniye.
• Sonikasyon:% 60 genlikte 30 saniye.
• Sıcaklığı izleyin: Numune sıcaklığını izlemek ve UIP400MTP maksimum 48–50°C sıcaklığa programlamak için tak-çıkar sıcaklık sensörünü kullanın.

Sonraki Turlar:
144 döngünün ilk turunu tamamladıktan sonra, güçlendirilmiş malzemenin bir alikotunu aktarın:

• Taze transgenik fare beyni homojenat substratına 10 kat seyreltin.
• Aynı sonikasyon parametrelerini koruyarak sonraki turlar için 96 PMCA döngüsü gerçekleştirin.
• İstenilen tur sayısı için devam edin (genellikle 5'e kadar).

Prp'nin Tespiti^Sc

1. Proteinaz K Sindirimi:
   – Numuneleri Proteinaz K (50 μg/mL) ile 37°C'de 1 saat muamele edin.
   – SDS numune tamponu ekleyerek ve 10 dakika kaynatarak sindirimi sonlandırın.
2. Western Blot Analizi:
   – Aşağıdakileri kullanarak sindirilmiş örnekleri analiz edin:
   – 6H4 veya PRC1 anti-PrP antikorları.
   – SDS-PAGE gerçekleştirin ve algılama için PVDF membranlarına aktarın.

 

 

Daha sağlam sonuçlar için daha fazla numune işleyin

UIP400MTP çok kuyulu plaka sonikatörü, prosedürün geleneksel olarak zaman alıcı doğasını ele alarak, protein yanlış katlanan döngüsel amplifikasyonun (PMCA) verimliliğini ve ölçeklenebilirliğini önemli ölçüde artırır. Sistem, 96 oyuklu bir plakada 96 adede kadar numunenin aynı anda işlenmesine izin vererek, tüm kuyucuklarda hassas ve tek tip sonikasyon koşullarını korurken PMCA iş akışlarını düzene sokar. Bu yüksek verim özelliği, manuel kullanımı en aza indirir, emek yoğun adımları azaltır ve tekrarlanabilirliği sağlayarak onu prion araştırması için vazgeçilmez bir araç haline getirir. İster kronik israf hastalığını ister Creutzfeldt-Jakob hastalığını araştırıyor olsun, UIP400MTP, araştırmacıların modern teşhis ve bilimsel uygulamaların taleplerini karşılamasını sağlayarak büyük ölçekli çalışmaları daha verimli bir şekilde kolaylaştırır.

---

---

Literatür / Referanslar

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.