UIP400MTP Sonikatörü ile Prionların Yüksek Numune İşleme Kapasitesiyle Tespiti için PMCA

UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü, protein yanlış katlanmasının döngüsel amplifikasyonunda (PMCA) yüksek numune işleme kapasiteli numune hazırlama için güçlü bir çözüm sunar. Birden fazla kuyucuğa eşit enerji dağılımı sağlayarak ve hassas sonikasyon parametrelerini koruyarak bu sistem, çok sayıda numunenin olağanüstü tekrarlanabilirlikle eş zamanlı olarak işlenmesini mümkün kılar. Bu yetenekler, analiz inhibitörlerinin sonuçları belirsizleştirebildiği tükürük gibi zorlu biyolojik numunelerde düşük konsantrasyonlardaki prionları tespit etmek üzere PMCA’nın optimize edilmesi için kritik öneme sahiptir.

Geyikgillerde kronik zayıflama hastalığı (CWD) ve insanlarda Creutzfeldt-Jakob hastalığı (CJD) gibi prion hastalıkları, yanlış katlanmış prion proteinlerinin (PrP^Sc) neden olduğu nörodejeneratif bozukluklardır. Bu hastalıklarda tükürük, kan ve idrar gibi vücut sıvılarında enfeksiyöz prionlar sıklıkla düşük düzeylerde bulunur; bu da tanı ve araştırmayı zorlaştırır. CWD’nin çevresel matrikslere yayılan prionlar yoluyla yatay bulaşması, yaban hayatı yönetimi ve ekolojik sağlık açısından özellikle önemli sonuçlar doğurur. Benzer şekilde, Creutzfeldt-Jakob hastalığı gibi hastalıklarda insan numunelerindeki yanlış katlanmış prion proteinlerinin güvenilir biçimde çoğaltılması, tanı yöntemlerinin geliştirilmesi ve hastalığın ilerleyişinin anlaşılması için kritik öneme sahiptir.

UIP400MTP mikroplaka sonikatörüyle güvenilir ve hızlı biyofilm sökme işlemi uygulayarak MBEC analizlerini kolaylaştırın. UIP400MTP sonikatörü, her türlü standart analiz plakasını işleyebilir ve hücreleri ve biyofilmleri verimli biçimde ayırır.

Modifiye edilmiş bir PMCA protokolünün uygulanması, yaygın analiz inhibitörlerinin (örn., tükürükteki müsinler) etkisinin aşılmasını ve aksi takdirde gerçek zamanlı sarsma ile indüklenen dönüşüm (RT-QuIC) gibi tekniklerle tespit edilemeyecek veya tespit sonuçları belirsiz olacak prionların saptanmasında yüksek duyarlılık elde edilmesini mümkün kılar. Bu ilerlemeler, çeşitli hastalıklarda prion tespitini iyileştirerek PMCA’yı prion araştırmaları ve tanısı için vazgeçilmez bir araç hâline getirir. UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü, mikroplakalardaki (örn., 6, 24 veya 96 kuyucuklu plakalar) ya da tüp rafındaki flakonlarda bulunan çok sayıda numuneye sonikasyon uygulayarak yüksek numune işleme kapasiteli PMCA’yı kolaylaştırır.

Yüksek Numune İşleme Kapasiteli Protein Yanlış Katlanmasının Döngüsel Amplifikasyonu (PMCA) Protokolü

Aşağıdaki protokol, sağlam araştırma sonuçları elde etmek için çok sayıda numunenin tamamen aynı koşullar altında verimli biçimde işlenmesini mümkün kılar.

Numune Hazırlama

Başlangıç Materyali:
Numuneleri şu işlemlerle hazırlayın:

Sarkosil ekstraksiyonu peletlerinin PMCA substratında yeniden süspanse edilmesi.
Beyin homojenatlarına veya kan numunelerine doğrudan prion tohumları eklenmesi.

Substrat:

Kullanacağınız %10 (wt/vol) beyin homojenatı, PrP^C proteinini aşırı eksprese eden transgenik farelerden (örn., Tg fareleri) hazırlanmış olmalıdır.
Beyin dokusunu şu ortamda homojenize edin:
– 1× PBS.
– 150 mM NaCl.
– %1 Triton X-100.
Substratı kullanılana kadar -80ºC sıcaklıkta saklayın.

Mikroplaka veya Tüplerde Numune Düzeni:
Tüpler:

90 μL beyin homojenatı substratı ekleyin ve 10 μL numune (örn., kan, beyin homojenatı veya sarkosil peleti) ile tohumlayın.
Her 0,2 mL tüpe 3 Teflon boncuk (1,59-mm veya 2,38-mm çapında) yerleştirin.
Tüpleri UIP400MTP sonikatörüyle uyumlu bir rafa yerleştirin.

6 Kuyucuklu Mikroplaka:

Her kuyucuğa 5 mL beyin homojenatı substratı ekleyin ve 500 μL numune ile tohumlayın.
Her kuyucuğa 3 Teflon boncuk ekleyin.

PMCA İşlemi

Yerleştirme:
Tüp rafını veya 6 kuyucuklu mikroplakayı üreticinin talimatlarına göre UIP400MTP sonikatörüne yerleştirin.

Döngü Programı:
144 PMCA döngüsünü aşağıdaki şekilde gerçekleştirin:

İnkübasyon: 37°C sıcaklıkta 29 dakika 30 saniye.
Sonikasyon: %60 genlikte 30 saniye.
Sıcaklığı izleyin: Numune sıcaklığını izlemek için takılabilir sıcaklık sensörünü kullanın ve UIP400MTP sonikatörünü maksimum 48–50°C sıcaklığa programlayın.

Sonraki Turlar:
144 döngüden oluşan ilk turu tamamladıktan sonra, çoğaltılan materyalin bir alikotunu aktarın:

Taze transgenik fare beyin homojenatı substratında 10 kat seyreltin.
Sonraki turlarda aynı sonikasyon parametrelerini koruyarak 96 PMCA döngüsü gerçekleştirin.
İstenen tur sayısına kadar devam edin (genellikle en fazla 5).

Tespit: PrP^Sc

Proteinaz K ile Sindirim:
– Numuneleri 37°C sıcaklıkta 1 saat boyunca Proteinaz K (50 μg/mL) ile işleyin.
– SDS numune tamponu ekleyip 10 dakika kaynatarak sindirimi sonlandırın.
Western Blot Analizi:
– Sindirilmiş numuneleri şu antikorları kullanarak analiz edin:
– 6H4 veya PRC1 anti-PrP antikorları.
– Tespit için SDS-PAGE uygulayın ve PVDF membranlarına aktarın.

Hielscher UIP400MTP, çok kuyucuklu plakalarınız, PCR plakalarınız veya numune tüpleriniz için en esnek sonikatördür. 400 watt sürekli sonikasyon çıkış gücüyle hücre lizisi, emülsifikasyon, protein ekstraksiyonu, DNA / RNA parçalama, deaglomerasyon, FFPE ekstraksiyonu, hücre ve biyofilm ayırma veya emülsifikasyon gibi uygulamalar için tasarlanmıştır. UIP400MTP bir ultrasonik banyo değildir. Odaklanmış sonikasyon için yüksek yoğunluklu, kap tipi bir sonotrottur. Bu güçlü, temassız sonikatör, standart kuyucuklu plakanızın tüm kuyucuklarında eşit sonikasyon sağlar. Genlik, güç ve darbeli çalışma üzerinde hassas kontrol sunar. Dahili zamanlayıcı ve sıcaklık probu, tutarlı sonuçlar sağlar. UIP400MTP plaka sonikatörü, numuneleri su banyosuyla soğutur (harici soğutucu isteğe bağlıdır).

Daha Sağlam Sonuçlar için Daha Fazla Numune İşleyin

UIP400MTP çok kuyucuklu plaka sonikatörü, protein yanlış katlanmasının döngüsel amplifikasyonunun (PMCA) verimliliğini ve ölçeklenebilirliğini önemli ölçüde artırarak işlemin geleneksel olarak zaman alan yapısına çözüm sunar. Sistem, 96 kuyucuklu bir plakada 96 numuneye kadar eş zamanlı işleme olanağı sağlayarak tüm kuyucuklarda hassas ve eşit sonikasyon koşullarını korurken PMCA iş akışlarını kolaylaştırır. Bu yüksek numune işleme kapasitesi, elle yapılan işlemleri en aza indirir, yoğun emek gerektiren adımları azaltır ve tekrarlanabilirlik sağlayarak sistemi prion araştırmaları için vazgeçilmez bir araç hâline getirir. İster kronik zayıflama hastalığı ister Creutzfeldt-Jakob hastalığı araştırılsın, UIP400MTP sonikatörü büyük ölçekli çalışmaların daha yüksek verimlilikle yürütülmesini kolaylaştırarak araştırmacıların modern tanı ve bilimsel uygulamaların gereksinimlerini karşılamasını mümkün kılar.

İlgili Konular

Literatür / Kaynaklar

FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.

Sıkça Sorulan Sorular

Prionlar Nedir?

Prionlar, özellikle beyinde normal hücresel proteinlerin anormal katlanmasını indükleyebilen yanlış katlanmış proteinlerdir. Bakterilerin veya virüslerin aksine prionlar nükleik asit içermez ve kendilerini şablon olarak kullanan bir mekanizmayla çoğalarak Creutzfeldt-Jakob hastalığı, sığır süngerimsi ensefalopatisi (deli dana hastalığı) ve koyunlarda scrapie gibi ilerleyici nörodejeneratif hastalıklara yol açar. Standart sterilizasyon işlemlerine karşı dirençleri, kendilerine özgü patojenitelerini vurgular ve tıbbi ortamlarda ve araştırma ortamlarında önemli zorluklar doğurur.

PMCA Tekniği Nedir?

Protein yanlış katlanmasının döngüsel amplifikasyonu (PMCA), yanlış katlanmış prion proteinlerini (PrP^Sc) in vitro ortamda çoğaltmak için kullanılan bir laboratuvar tekniğidir. Normal hücresel prion proteininin (PrP^C), prion hastalıklarının ayırt edici bir özelliği olan yanlış katlanmış enfeksiyöz formuna (PrP^Sc) dönüşümünü taklit eder. İşlem, PrP^Sc’nin agregasyonunu hızlandırmak için inkübasyon ve sonikasyon döngüleri içerir; bu da onu düşük düzeylerdeki prionları tespit etmek için güçlü bir araç hâline getirir.

Hangi Proteinin Yanlış Katlanması Creutzfeldt Jakob Hastalığına Neden Olur?

Creutzfeldt-Jakob hastalığına (CJD), prion proteininin (PrP) yanlış katlanması neden olur. Normal izoform (PrP^C) anormal, β-tabaka bakımından zengin bir konformasyona (PrP^Sc) geçerek enfeksiyöz hâle gelir ve beyinde amiloid agregatları oluşturarak nörodejenerasyona yol açar.

Enfeksiyöz Prionların Protein Yanlış Katlanmasının Döngüsel Amplifikasyonu Nedir?

Protein yanlış katlanmasının döngüsel amplifikasyonu (PMCA), prionların enfeksiyöz formunu (PrP^Sc) çoğaltmaya yönelik bir yöntemdir; bu yöntemde normal PrP^C ile küçük miktarlarda PrP^Sc tekrar tekrar inkübe edilir. Her döngüde PrP^Sc , PrP^C‘nin yanlış katlanmasını katalizler ve sonikasyon, agregatları parçalayarak daha fazla tohumlanma bölgesi oluşturur. Bu, prionların in vivo çoğalmasını taklit eder ve biyolojik numunelerde hassas prion tespitine olanak tanır.

PrP’nin Yanlış Katlanmasına Ne Neden Olur?

PrP’nin yanlış katlanarak patojenik PrP^Sc formuna dönüşümü şu etkenlerle tetiklenebilir:

Sporadik prion hastalıklarında kendiliğinden yanlış katlanma.
PRNP genindeki genetik mutasyonlar (örn., ailesel prion hastalıkları).
Enfeksiyöz PrP^Sc proteinine kontamine gıdalar, tıbbi işlemler veya başka yollarla maruz kalma.
pH, metal iyonları veya kofaktörler gibi çevresel ya da yapısal faktörler – bunların kararsızlaştırdığı protein PrP^C.

RT-QuIC Testi Nedir?

Gerçek zamanlı sarsma ile indüklenen dönüşüm (RT-QuIC), prion hastalıkları için oldukça duyarlı bir tanı analizidir. PrP^Sc proteininin rekombinant PrP^C proteinini yanlış katlanmış agregatlara dönüştürme yeteneğini amplifiye ederek PrP^Sc’yi tespit eder. Test, amiloid fibril oluşumunun floresansa dayalı tespitini kullanır; bu da onu beyin omurilik sıvısında (CSF) veya diğer dokularda CJD gibi hastalıkların tanısı için yararlı kılar.