UIP400MTP Mikroplaka Sonikatörü kullanılarak Amiloid Fibril Oluşumu

Amiloid fibriller, kristaller gibi, bir çekirdeklenme ve ardından büyüme süreci ile oluşur. Bununla birlikte, çekirdeklenmenin yüksek serbest enerji bariyeri nedeniyle, spontan amiloid fibril oluşumu ancak uzun süreli bir gecikme evresinden sonra meydana gelir. Ultrasonication, amiloid nükleasyonunu indüklemek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır, böylece fibril oluşumunu önemli ölçüde hızlandırır. Thioflavin T (ThT) floresan kullanan bir mikroplaka okuyucu ile birleştirildiğinde, ultrasonikasyon aynı anda birden fazla örnekte amiloid fibrillerin yüksek verimli tespitini sağlar.

UIP400MTP Mikroplaka Sonikatör ile Ultrasonik Olarak İndüklenen Amiloid Fibril Oluşumu

UIP400MTP çok kuyulu plaka sonikatörü ile, büyük miktarlarda aynı kalitede amiloid fibriller araştırma amacıyla hızlı bir şekilde sentezlenebilir. Bu verimli yaklaşım, protein amiloidojenitesinin incelenmesine izin verir. Bu teknik, diyalize bağlı amiloidoz ile ilişkili bir amiloidojenik protein olan β2-mikroglobulin (β2-m) ile gösterildiği gibi hızlı ve tekrarlanabilir amiloid fibrilasyonunu kolaylaştırır.

Basit Deneysel Yaklaşım: Ultrasonik İndüklenmiş Amiloid Fibrilasyon

Fibril oluşumunu indüklemek için, tüm kuyucuklarda tek tip ultrasonik maruziyet sağlayan UIP400MTP çok kuyulu plaka sonikatörünün merkezine 96 oyuklu bir mikroplaka yerleştirildi. Deney koşulları aşağıdaki gibidir:

1. Her kuyucuk, 5 μM ThT ile desteklenmiş 0.2 ml β2-mikroglobulin çözeltisi (0.3 mg / ml, pH 2.5) içeriyordu.
2. Plaka, 1 dakikalık ultrasonikasyon ve ardından 9 dakikalık duraklama gibi ultrasonikasyon döngülerine tabi tutuldu.
3. Sonikasyon sonrası, ThT floresan bir mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü.

(bkz. So ve diğerleri, 2011)

Konvansiyonel Ajitasyon ile Karşılaştırma

Geleneksel ajitasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, ultrasonikasyon fibril oluşumunun gecikme fazını büyük ölçüde azalttı. Geleneksel mikroplaka çalkalama koşulları altında, 10 kuyudan sadece 1'i 20 saat sonra artan ThT floresansı sergiledi. Buna karşılık, döngüsel ultrasonikasyon (15 dakika sonikasyon ve ardından 5 dakika sessizlik) kullanılarak, ilk sonikasyon tedavisinden hemen sonra önemli bir ThT floresan artışı tespit edildi.

Fibrilasyon Kinetiğinin Hızlı İvmesi

So ve ark. (2011), pH 2.5'te β2-mikroglobulinin spontan fibril oluşumunun ultrasonikasyon ile birkaç saatten sadece 10-15 dakikaya kadar hızlandırılabileceğini göstermiştir.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntüleri, her 15 dakikada bir 10 dakikalık ultrasonikasyon ile oluşturulan fibrillerin, her 10 dakikada bir 1 dakikalık ultrasonikasyon kullanılarak oluşturulanlardan morfolojik olarak ayırt edilemez olduğunu doğruladı. Bu, ultrasonik olarak indüklenen amiloid fibrilasyonun tekrarlanabilirliğini ve sağlamlığını vurgular.

Her 10 dakikada bir 1 dakikalık ultrasonikasyon (i), her 15 dakikada bir 10 dakikalık sonikasyon (ii) ve ultrasonikasyon olmadan tohumlama reaksiyonu (iii) ile üretilen amiloid fibrillerin AFM görüntüleri. Beyaz ölçek çubuğu 1 μm'yi temsil eder.
Çalışma ve görüntüler: ©So ve ark., 2011

Nötr pH Koşullarında Fibrilasyon

Nötr pH koşulları altında bile, fibril oluşumu 1.5 saatlik bir gecikme süresinden sonra elde edildi, bu da ultrasonikasyonun çekirdeklenme ve büyümeye yönelik enerjik bariyeri önemli ölçüde azalttığını gösterdi. Bu, amiloid fibrilasyonun esas olarak, ultrasonikasyonun etkili bir şekilde azalttığı çekirdeklenme enerji bariyeri tarafından büyük ölçüde kısıtlanan fiziksel bir reaksiyon olduğu hipotezini desteklemektedir.

Amiloid ile İlgili Hastalık Araştırmaları Üzerindeki Etkisi

UIP400MTP mikroplaka sonikatör kullanılarak amiloid fibrillerin kolay ve güvenilir oluşumu, Alzheimer hastalığı (AD) araştırmaları ve Parkinson hastalığı, tip II diyabet ve sistemik amiloidozlar gibi amiloid ile ilgili diğer bozukluklar için önemli etkilere sahiptir. AD'de, amiloid-β (Aβ) agregasyonu önemli bir patolojik özelliktir, ancak fibrilasyon kinetiğini incelemek, uzun gecikme fazları ve geleneksel yöntemlerdeki değişkenlik nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Ultrasonikasyon güdümlü fibril oluşumu çekirdeklenmeyi hızlandırır, yüksek tekrarlanabilirlik ve azaltılmış değişkenlik sağlar, bu da potansiyel inhibitörleri taramak ve amiloidojenik mekanizmaları anlamak için çok önemlidir. Ayrıca, UIP400MTP'nin yüksek verim kapasitesi, protein yanlış katlanması ve agregasyonu ile ilgili büyük ölçekli araştırmalara olanak tanıyarak, fibril oluşumunu modüle edebilen ve potansiyel olarak nörodejeneratif ilerlemeyi azaltabilen terapötik ajanların keşfini kolaylaştırır.

Bu çalışma, amiloid fibril oluşumunu hızlandırmak için oldukça verimli bir yöntem olarak UIP400MTP çok kuyulu plaka sonikatörünü kullanarak ultrasonikasyon kurar. Bu yaklaşımın temel avantajları şunlardır:

• Fibrilasyon için gecikme süresinde dramatik azalma.
• Tüm kuyucuklarda tek tip ultrason maruziyeti, tekrarlanabilir fibril oluşumunu mümkün kılar.
• Yüksek verimli tarama yeteneği, onu genom çapında protein amiloidojenitesi aramaları için uygun hale getirir.

Ultrasonication'ı ThT floresan algılama ile entegre ederek, bu yöntem amiloid fibrilasyonunu incelemek için hızlı, ölçeklenebilir ve güvenilir bir platform sağlar. Verimliliği ve yüksek verim potansiyeli göz önüne alındığında, bu yaklaşım, biyofiziksel ve farmasötik araştırmalar için amiloid fibrillerinin kolay sentezini kolaylaştırabilir ve amiloid ile ilgili çalışmalar ve ilaç taraması için umut verici bir araç sunar.