Ultrazvuková príprava lipozómov

Lipozómy vyrobené ultrazvukom vykazujú veľmi vysokú účinnosť zachytávania, vysokú kapacitu plnenia a rovnomerne malú veľkosť pri guľovitom tvare. Vďaka tomu ponúkajú ultrazvukovo pripravené lipozómy vynikajúcu biologickú dostupnosť. Hielscher Ultrasonics ponúka ultrazvukové prístroje na spoľahlivú výrobu lipozómov vo farmaceutickej kvalite v dávkovom aj kontinuálnom režime.

Výhody ultrazvukovej výroby lipozómov

Ultrazvuková enkapsulácia do lipozómov je technika používaná na zapuzdrenie liečiv alebo iných terapeutických látok do lipozómov pomocou ultrazvukovej energie. V porovnaní s inými metódami enkapsulácie do lipozómov má ultrazvuková enkapsulácia niekoľko výhod, ktoré z nej robia lepšiu výrobnú techniku.

• Vysoký obsah účinných látok, vysoká účinnosť zachytávania: Ultrazvuková výroba lipozómov je dobre známa tým, že umožňuje vyrábať lipozómy s vysokým obsahom účinných látok, napr. vitamínu C, molekúl liečiv atď. Metóda sonikácie zároveň vykazuje vysokú účinnosť zachytávania. To znamená, že ultrazvukom sa zapuzdrí vysoké percento účinnej látky. Vďaka tomu je ultrazvukové spracovanie vysoko účinnou metódou výroby lipozómov.
• Rovnomerne malé lipozómy: Jednou z výhod ultrazvukovej enkapsulácie do lipozómov je jej schopnosť vytvárať vysoko rovnomerné lipozómy s úzkou distribúciou veľkostí. Ultrazvukovú energiu možno použiť na rozrušenie väčších lipozómov alebo lipidových agregátov na menšie, rovnomernejšie lipozómy. To vedie k väčšej jednotnosti veľkosti a tvaru lipozómov, čo môže byť dôležité pri aplikáciách zameraných na podávanie liečiv, pri ktorých môže veľkosť častíc ovplyvniť ich farmakokinetiku a účinnosť.
• Použiteľná na akékoľvek molekuly: Ďalšou výhodou ultrazvukovej enkapsulácie do lipozómov je jej schopnosť zapuzdriť širokú škálu liečiv a iných terapeutických látok. Túto techniku možno použiť na zapuzdrenie hydrofilných aj hydrofóbnych liečiv, čo môže byť pri iných metódach náročné. Ultrazvukovú energiu možno navyše použiť na zapuzdrenie makromolekúl a nanočastíc, ktoré môžu byť príliš veľké na zapuzdrenie inými metódami.
• Rýchla a spoľahlivá: Ultrazvuková enkapsulácia do lipozómov je tiež pomerne jednoduchý a rýchly proces. Nevyžaduje použitie agresívnych chemikálií ani vysokých teplôt, ktoré môžu poškodiť zapuzdrované terapeutické látky.
• Zväčšenie výrobného rozsahu: Túto techniku možno navyše ľahko prispôsobiť veľkovýrobe, vďaka čomu je nákladovo efektívnou možnosťou pre aplikácie zamerané na podávanie liečiv.

Celkovo je ultrazvuková enkapsulácia do lipozómov lepšou technikou enkapsulácie do lipozómov vďaka svojej schopnosti vytvárať rovnomerné lipozómy s úzkou distribúciou veľkostí, zapuzdrovať širokú škálu terapeutických látok, ako aj vďaka svojej jednoduchosti a možnosti zväčšenia výrobného rozsahu.

Po vytvorení lipidového filmu a následnej rehydratácii sa sonikácia používa na podporu zachytávania účinných látok v lipozóme. Sonikáciou sa navyše dosahuje požadovaná veľkosť lipozómov.

Ultrazvuková príprava lipozómov pre farmaceutické a kozmetické prípravky

Lipozómy (vezikuly na báze lipidov), transferozómy (ultradeformovateľné lipozómy), etozómy (ultradeformovateľné vezikuly s vysokým obsahom alkoholu) a niozómy (syntetické vezikuly) sú mikroskopické vezikuly, ktoré možno umelo pripraviť ako guľovité nosiče, do ktorých možno zapuzdriť účinné molekuly. Tieto vezikuly s priemerom od 25 do 5000 nm sa často používajú ako nosiče liečiv vo farmaceutickom a kozmetickom priemysle, napríklad pri perorálnom alebo lokálnom podávaní liečiv, génovej terapii a imunizácii. Ultrazvukové spracovanie je vedecky overenou metódou vysoko účinnej výroby lipozómov. Ultrazvukové prístroje Hielscher vyrábajú lipozómy s vysokým obsahom účinných látok a lepšou biologickou dostupnosťou.

Lipozómy a lipozomálne formulácie

Lipozómy sú unilamelárne, oligolamelárne alebo multilamelárne vezikulárne systémy a pozostávajú z rovnakého materiálu ako bunková membrána (lipidová dvojvrstva). Podľa zloženia a veľkosti sa lipozómy rozlišujú takto:

• multilamelárne vezikuly (MLV, 0,1–10μm)
• malé unilamelárne vezikuly (SUV, <100 nm)
• veľké unilamelárne vezikuly (LUV, 100–500 nm)
• obrovské unilamelárne vezikuly (GUV, ≥1 μm)

Základnú štruktúru lipozómov tvoria fosfolipidy. Fosfolipidy majú hydrofilnú hlavovú skupinu a hydrofóbnu chvostovú skupinu, ktorú tvorí dlhý uhľovodíkový reťazec.
Membrána lipozómov má veľmi podobné zloženie ako kožná bariéra, takže lipozómy sa môžu ľahko začleniť do ľudskej kože. Keď lipozómy splynú s kožou, môžu uvoľniť zachytené látky priamo na cieľovom mieste, kde môžu účinné látky plniť svoje funkcie. Lipozómy tak zvyšujú priepustnosť kože pre zachytené farmaceutické a kozmetické látky. Aj lipozómy bez zapuzdrených látok, teda prázdne vezikuly, sú pre kožu účinnými aktívnymi látkami, pretože fosfatidylcholín obsahuje dve esenciálne zložky, ktoré si ľudský organizmus nedokáže sám vytvoriť: kyselinu linolovú a cholín.
Lipozómy sa používajú ako biokompatibilné nosiče liečiv, peptidov, proteínov, plazmidovej DNA, antisense oligonukleotidov alebo ribozýmov na farmaceutické, kozmetické a biochemické účely. Mimoriadna variabilita veľkosti častíc a fyzikálnych parametrov lipidov ponúka atraktívny potenciál na vytváranie nosičov prispôsobených širokej škále aplikácií. (Ulrich 2002)

Tvorba lipozómov pomocou ultrazvuku

Lipozómy možno vytvárať pomocou ultrazvuku. Základným materiálom na prípravu lipozómov sú amfifilné molekuly odvodené od lipidov biologických membrán alebo založené na týchto lipidoch. Na tvorbu malých unilamelárnych vezikúl (SUV) sa lipidová disperzia šetrne sonikuje – napr. ručným ultrazvukovým prístrojom UP50H (50W, 30kHz), prístrojom VialTweeter alebo ultrazvukovým reaktorom CupHorn – v ľadovom kúpeli. Takéto ultrazvukové spracovanie trvá približne 5 – 15 minút. Ďalšou metódou výroby malých unilamelárnych vezikúl je sonikácia multilamelárnych lipozómových vezikúl.
Dinu-Pirvu et al. (2010) uvádzajú získavanie transferozómov sonikáciou MLV pri izbovej teplote.
Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové prístroje, sonotródy a príslušenstvo, a preto dokáže poskytnúť najvhodnejšiu ultrazvukovú zostavu na vysoko účinné zapuzdrovanie do lipozómov v akomkoľvek meradle.

Ultrazvukové zapuzdrovanie účinných látok do lipozómov

Lipozómy slúžia ako nosiče účinných látok, ako sú vitamíny, terapeutické molekuly, peptidy atď. Ultrazvuk je účinným nástrojom na prípravu a tvorbu lipozómov na zachytávanie účinných látok. Sonikácia súčasne podporuje proces zapuzdrovania a zachytávania, takže vznikajú lipozómy s vysokým obsahom účinných látok. Pred zapuzdrovaním majú lipozómy tendenciu vytvárať zhluky v dôsledku vzájomného pôsobenia povrchových nábojov polárnych hláv fosfolipidov (porov. Míckova et al. 2008), navyše sa musia otvoriť. Napríklad Zhu et al. (2003) opisujú zapuzdrovanie biotínového prášku do lipozómov pomocou ultrazvuku. Po pridaní biotínového prášku do suspenzného roztoku vezikúl sa roztok sonikoval. Po tomto spracovaní bol biotín zachytený v lipozómoch.
Prečítajte si viac o ultrazvukovom zapuzdrovaní peptidov GLP-1 (napr. semaglutidu) do lipozómov!

Lipozomálne emulzie pomocou ultrazvuku

Na zvýšenie ošetrujúceho účinku hydratačných krémov alebo krémov proti starnutiu, telových mliek, gélov a iných kozmeceutických prípravkov sa do lipozomálnych disperzií pridávajú emulgátory, ktoré stabilizujú väčšie množstvá lipidov. Výskumy však ukázali, že kapacita lipozómov je vo všeobecnosti obmedzená. Pri pridaní emulgátorov sa tento účinok prejaví skôr a dodatočné emulgátory oslabujú afinitu fosfatidylcholínu ku kožnej bariére. Riešením tohto problému sú nanočastice – zložené z fosfatidylcholínu a lipidov. Tieto nanočastice tvorí kvapôčka oleja pokrytá monovrstvou fosfatidylcholínu. Použitie nanočastíc umožňuje vytvárať prípravky, ktoré dokážu prijať viac lipidov a zostať stabilné, takže ďalšie emulgátory nie sú potrebné.
Sonikácia je osvedčená metóda výroby nanoemulzií a nanodisperzií. Ultrazvuk s vysokou intenzitou poskytuje výkon potrebný na dispergovanie kvapalnej fázy (dispergovanej fázy) vo forme malých kvapôčok v druhej fáze (kontinuálnej fáze). V dispergačnej zóne spôsobujú implodujúce kavitačné bubliny intenzívne rázové vlny v okolitej kvapaline a vedú k vzniku prúdov kvapaliny s vysokou rýchlosťou. Na stabilizáciu novovzniknutých kvapôčok dispergovanej fázy proti koalescencii sa do emulzie pridávajú emulgátory (povrchovo aktívne látky, tenzidy) a stabilizátory. Keďže koalescencia kvapôčok po ich rozbití ovplyvňuje výslednú distribúciu veľkosti kvapôčok, používajú sa účinne stabilizujúce emulgátory, aby sa výsledná distribúcia veľkosti kvapôčok udržala na úrovni zodpovedajúcej distribúcii bezprostredne po rozbití kvapôčok v ultrazvukovej dispergačnej zóne.

Lipozomálne disperzie pomocou sonikácie

Lipozomálne disperzie na báze nenasýteného fosfatidylcholínu nemajú dostatočnú stabilitu voči oxidácii. Stabilizáciu disperzie možno dosiahnuť pomocou antioxidantov, napríklad komplexu vitamínov C a E.
 

Tvorba lipozómov metódou odparovania z reverznej fázy pomocou sonikácie

 
Ortan et al. (2002) dosiahli dobré výsledky vo svojej štúdii ultrazvukovej prípravy lipozómov s éterickým olejom z Anethum graveolens. Po sonikácii sa veľkosť lipozómov pohybovala medzi 70–150 nm a pri MLV medzi 230–475 nm; tieto hodnoty zostali približne konštantné aj po 2 mesiacoch, ale po 12 mesiacoch sa zvýšili, najmä v disperzii SUV (pozri histogramy nižšie). Meranie stability týkajúce sa straty éterického oleja a distribúcie veľkosti tiež ukázalo, že lipozomálne disperzie si zachovali obsah prchavého oleja. To naznačuje, že zachytenie éterického oleja v lipozómoch zvýšilo stabilitu oleja.

Ortan et al. (2009): Stabilita disperzií MLV a SUV po 1 roku. Lipozomálne prípravky sa skladovali pri 4±1 ºC.

Ultrazvukové procesory Hielscher sú ideálnymi zariadeniami na použitie v kozmetickom a farmaceutickom priemysle. Systémy pozostávajúce z viacerých ultrazvukových procesorov, z ktorých každý má výkon až 16 000 wattov, poskytujú kapacitu potrebnú na premenu tejto laboratórnej aplikácie na účinnú výrobnú metódu na získavanie jemne dispergovaných emulzií v kontinuálnom prietoku alebo v dávke – pričom dosahujú výsledky porovnateľné s najlepšími v súčasnosti dostupnými vysokotlakovými homogenizátormi, ako sú štrbinové ventily. Okrem tejto vysokej účinnosti pri kontinuálnej emulgácii vyžadujú ultrazvukové zariadenia Hielscher veľmi malú údržbu a veľmi ľahko sa obsluhujú a čistia. Ultrazvuk skutočne podporuje čistenie a oplachovanie. Ultrazvukový výkon je nastaviteľný a možno ho prispôsobiť konkrétnym produktom a požiadavkám na emulgáciu. K dispozícii sú aj špeciálne prietokové reaktory, ktoré spĺňajú náročné požiadavky CIP (čistenie na mieste) a SIP (sterilizácia na mieste).

Často kladené otázky o lipozómoch

Aké typy lipozómov rozlišujeme?

Lipozómy sa klasifikujú do rôznych typov podľa ich veľkosti a počtu dvojvrstiev, ktoré obsahujú. Medzi tieto kategórie patria:

• Malé unilamelárne vezikuly (SUV): Sú to najmenšie lipozómy s jedinou lipidovou dvojvrstvou.
• Veľké unilamelárne vezikuly (LUV): Sú väčšie ako SUV a takisto majú jedinú dvojvrstvu.
• Multilamelárne vezikuly (MLV): Obsahujú viacero koncentrických dvojvrstiev.
• Multivezikulárne vezikuly (MVV): Pozostávajú z viacerých menších vezikúl vo vnútri väčšej vezikuly.

 
Medzi ďalšie špecializované typy patria:

• PEGylované lipozómy: Lipozómy modifikované polyetylénglykolom (PEG) na zvýšenie stability a predĺženie času cirkulácie.
• Nanolipozómy: Veľmi malé lipozómy, ktoré sa zvyčajne používajú na cielené dodávanie liečiv.

Aké vezikulárne štruktúry môžu mať lipozómy?

Lipozómy sa ďalej podľa svojej vezikulárnej štruktúry delia na sedem hlavných typov:

• Veľké multilamelárne vezikuly (MLV): Obsahujú viacero dvojvrstiev.
• Oligolamelárne vezikuly (OLV): Majú niekoľko dvojvrstiev.
• Malé unilamelárne vezikuly (SUV): Najmenšie vezikuly s jedinou dvojvrstvou.
• Stredne veľké unilamelárne vezikuly (MUV): Vezikuly strednej veľkosti s jedinou dvojvrstvou.
• Veľké unilamelárne vezikuly (LUV): Väčšie vezikuly s jedinou dvojvrstvou.
• Obrovské unilamelárne vezikuly (GUV): Veľmi veľké vezikuly s jedinou dvojvrstvou.
• Multivezikulárne vezikuly (MVV): Viacero vezikúl vo vnútri jednej veľkej vezikuly.

Aké sú rozdiely medzi lipozómami a niozómami?

Lipozómy a niozómy sa líšia najmä svojím zložením:
Lipozómy: Sú vyrobené z dvojreťazcových fosfolipidov, ktoré môžu byť neutrálne alebo elektricky nabité.
Niozómy: Sú vyrobené z nenabitých jednoreťazcových povrchovo aktívnych látok a cholesterolu.
Obe štruktúry vznikajú sonikáciou, ktorá podporuje usporiadanie molekúl do dvojvrstvových vezikúl.

Aká je ideálna veľkosť lipozómu?

Na terapeutické dodávanie je ideálna veľkosť lipozómu teoreticky v rozmedzí priemerov 50 až 200 nanometrov. Tento rozsah veľkostí optimalizuje stabilitu a biologickú dostupnosť. Na zmenšenie vezikuly na požadovanú veľkosť sa bežne používa sonikácia.

Môžu lipozómy prenášať hydrofilné liečivá?

Áno, lipozómy môžu prenášať hydrofilné liečivá. V biomedicínskych aplikáciách sú cenené pre svoju schopnosť enkapsulovať hydrofóbne aj hydrofilné látky. Okrem toho sa vyznačujú vysokou biokompatibilitou a biologickou odbúrateľnosťou, vďaka čomu sú účinnými systémami na dodávanie liečiv.

Ako pripraviť lipozómy?

Najbežnejšími technikami prípravy lipozómov sú metóda tenkého filmu a metóda odparovania z reverznej fázy.
Metóda hydratácie tenkého filmu:

1. Rozpustite lipidy v organickom rozpúšťadle.
2. Odparte rozpúšťadlo, aby vznikol tenký lipidový film.
3. Hydratujte film vodným roztokom za použitia sonikácie, aby vznikli multilamelárne vezikuly.

Metóda odparovania z reverznej fázy:

1. Rozpustite lipidy vo vode a etanole.
2. Sonikujte roztok pri 60°C približne 10 minút, aby vznikla lipidová pasta.
3. Ochlaďte lipidovú kašu a za miešania pridávajte po kvapkách vodu alebo tlmivý roztok.
4. Hydratujte suspenziu 1 hodinu, aby vznikli multilamelárne vezikuly.
5. Ďalšou sonikáciou zmenšite veľkosť lipozómov.

Čo sú archeozómy?

Archeozómy sú lipozómy vyrobené z lipidov archeónov, ktoré sú známe svojou stabilitou a odolnosťou voči extrémnym podmienkam. Vďaka týmto vlastnostiam sú archeozómy obzvlášť užitočné na dodávanie liečiv a vývoj vakcín v náročných prostrediach.

Ako sa pripravujú archeozómy?

Postup sonikácie podľa Pise (2022): Archeozómy možno pripraviť z polárnej lipidovej frakcie „PLF“ organizmu Sulfolobussolfataricus sonikáciou pri 60°C bez potreby dopĺňania lipidov z vonkajšieho zdroja. Pri 0°C boli polárne lipidy z organizmu Sulfolobusacidocaldarius účinne sonikované za vzniku archeozómov. Archeozómy naplnené BMD a konvenčné lipozómy, ako aj archeálne lipidy izolované z archeí H. salinarum a obohatené fosfatidylcholínom, boli pripravené pomocou sonikačných techník. Sonikované vezikuly na topické podávanie boli vytvorené sonikáciou disperzií MLV pri 80 percentách amplitúdy počas 4 minút pomocou sondového sonikátora Hielscher UP50H (pozri obrázok vľavo).

Literatúra/Referencie

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.