Ultrazvuková príprava lipozómov

Ultrazvukom vyrábané lipozómy vykazujú veľmi vysokú účinnosť zachytávania, vysokú nosnosť a rovnomerne malú sférickú veľkosť. Ultrazvukové lipozómy tak ponúkajú vynikajúcu biologickú dostupnosť. Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka ultrazvukové prístroje na spoľahlivú výrobu lipozómov farmaceutickej kvality v dávkovom a kontinuálnom režime.

Výhody výroby ultrazvukových lipozómov

Ultrazvuková zapuzdrenie lipozómov je technika používaná na zapuzdrenie liekov alebo iných terapeutických látok v lipozómoch pomocou ultrazvukovej energie. V porovnaní s inými metódami zapuzdrenia lipozómov má ultrazvukové zapuzdrenie niekoľko výhod, ktoré z nej robia vynikajúcu výrobnú techniku.

• Vysoké zaťaženie, vysoká účinnosť zachytenia: Je dobre známe, že ultrazvuková výroba lipozómov produkuje lipozómy s vysokým zaťažením účinných látok, napr. vitamínu C, molekúl liečiv atď. Metóda sonikácie zároveň vykazuje vysokú účinnosť zachytávania. To znamená, že vysoké percento účinnej látky je zapuzdrené ultrazvukom. Na záver možno povedať, že ultrazvuk je vysoko účinnou metódou výroby lipozómov.
• Rovnomerne malé lipozómy: Jednou z výhod ultrazvukovej zapuzdrenia lipozómov je jej schopnosť produkovať vysoko rovnomerné lipozómy s úzkou distribúciou veľkosti. Ultrazvukovú energiu možno použiť na rozbitie väčších lipozómov alebo lipidových agregátov na menšie, rovnomernejšie lipozómy. To vedie k väčšej konzistencii vo veľkosti a tvare lipozómov, čo môže byť dôležité pre aplikácie podávania liekov, kde veľkosť častíc môže ovplyvniť ich farmakokinetiku a účinnosť.
• Použiteľné pre všetky molekuly: Ďalšou výhodou ultrazvukovej lipozómovej enkapsulácie je jej schopnosť zapuzdriť širokú škálu liekov a iných terapeutických látok. Táto technika sa môže použiť na zapuzdrenie hydrofilných aj hydrofóbnych liekov, čo môže byť ťažké urobiť inými metódami. Okrem toho je možné ultrazvukovú energiu použiť na zapuzdrenie makromolekúl a nanočastíc, ktoré môžu byť príliš veľké na to, aby sa dali zapuzdriť inými metódami.
• Rýchle a spoľahlivé: Ultrazvukové zapuzdrenie lipozómov je tiež pomerne jednoduchý a rýchly proces. Nevyžaduje použitie agresívnych chemikálií alebo vysokých teplôt, ktoré môžu byť škodlivé pre zapuzdrené terapeutické látky.
• Rozšírenie: Okrem toho je možné túto techniku ľahko rozšíriť na výrobu vo veľkom meradle, čo z nej robí nákladovo efektívnu možnosť pre aplikácie podávania liekov.

Stručne povedané, ultrazvuková zapuzdrenie lipozómov je vynikajúcou technikou na zapuzdrenie lipozómov vďaka svojej schopnosti produkovať rovnomerné lipozómy s úzkou distribúciou veľkostí, zapuzdriť širokú škálu terapeutických látok a svojej jednoduchosti a škálovateľnosti.

Po vytvorení lipidového filmu následná rehydratácia sa používa sonikácia na podporu zachytenia účinných látok v lipozóme. Okrem toho sonikácia dosahuje požadovanú veľkosť lipozómu.

Ultrazvukový lipozómový prípravok pre liečivá a kozmetiku

Lipozómy (vezikuly na báze lipidov), transferozómy (ultradeformovateľné lipozómy), etozómy (ultradeformovateľné vezikuly s vysokým obsahom alkoholu) a niozómy (syntetické vezikuly) sú mikroskopické vezikuly, ktoré môžu byť umelo pripravené ako globulárne nosiče, do ktorých môžu byť zapuzdrené aktívne molekuly. Tieto vezikuly s priemerom medzi 25 a 5000 nm sa často používajú ako nosiče liečiv vo farmaceutickom a kozmetickom priemysle, ako je perorálne alebo lokálne podávanie liekov, genoterapia a imunizácia. Ultrazvuk je vedecky overená metóda na vysoko účinnú produkciu lipozómov. Ultrazvukové prístroje Hielscher produkujú lipozómy s vysokým zaťažením aktívnych zložiek a vynikajúcou biologickou dostupnosťou.

Lipozómy a lipozomálna formulácia

Lipozómy sú jednolamelárne, oligolamelárne alebo multilamelárne vezikulárne systémy a sú zložené z rovnakého materiálu ako bunková membrána (lipidová dvojvrstva). Pokiaľ ide o ich zloženie a veľkosť, lipozómy sa rozlišujú nasledovne:

• multilamelárne vezikuly (MLV, 0,1-10 μm)
• malé jednolamelové vezikuly (SUV, <100 nm)
• veľké jednolamelárne vezikuly (LUV, 100–500 nm)
• obrovské jednolamelárne vezikuly (GUV, ≥1 μm)

Hlavnú štruktúru lipozómov tvoria fosfolipidy. Fosfolipidy majú hydrofilnú skupinu hlavy a hydrofóbnu chvostovú skupinu, ktorá pozostáva z dlhého uhľovodíkového reťazca.
Lipozómová membrána má veľmi podobné zloženie ako kožná bariéra, takže sa dajú ľahko integrovať do ľudskej pokožky. Keď sa lipozómy spájajú s pokožkou, môžu vyložiť zachytené látky priamo na miesto určenia, kde môžu aktívne látky plniť svoje funkcie. Lipozómy tak vytvárajú zvýšenie penetračnosti/priepustnosti pokožky pre zachytené farmaceutické a kozmetické látky. Tiež lipozómy bez zapuzdrených látok, prázdne vezikuly, sú silnými účinnými látkami pre pokožku, pretože fosfatidylcholín obsahuje dve základné látky, ktoré si ľudský organizmus nedokáže sám vyrobiť: kyselinu linolovú a cholín.
Lipozómy sa používajú ako biokompatibilné nosiče liečiv, peptidov, proteínov, plazmickej DNA, antisense oligonukleotidov alebo ribozýmov na farmaceutické, kozmetické a biochemické účely. Obrovská všestrannosť veľkosti častíc a fyzikálnych parametrov lipidov poskytuje atraktívny potenciál pre konštrukciu vozidiel na mieru pre širokú škálu aplikácií. (Ulrich 2002)

Tvorba ultrazvukových lipozómov

Lipozómy môžu byť vytvorené použitím ultrazvuku. Základným materiálom na prípravu lipozómov sú amfitické molekuly odvodené alebo založené na biologických membránových lipidoch. Na tvorbu malých jednolamelárnych vezikúl (SUV) sa lipidová disperzia jemne sonikuje – napr. s ručným ultrazvukovým prístrojom UP50H (50W, 30kHz), VialTweeter alebo ultrazvukovým reaktorom CupHorn – v ľadovom kúpeli. Trvanie takéhoto ultrazvukového ošetrenia trvá cca. 5 – 15 minút. Ďalšou metódou na výrobu malých jednolamelárnych vezikúl je sonikácia lipozómov multilamelárnych vezikúl.
Dinu-Pirvu a kol. (2010) uvádzajú získavanie transferozómov sonikáciou MLV pri izbovej teplote.
Spoločnosť Hielscher Ultrasonics ponúka rôzne ultrazvukové prístroje, sonotródy a príslušenstvo, a preto môže poskytnúť najvhodnejšie ultrazvukové nastavenie pre vysoko efektívne zapuzdrenie lipozómov v akomkoľvek meradle.

Ultrazvuková enkapsulácia účinných látok do lipozómov

Lipozómy fungujú ako nosiče účinných látok, ako sú vitamíny, terapeutické molekuly, peptidy atď. Ultrazvuk je účinný nástroj na prípravu a formovanie lipozómov na zachytávanie účinných látok. Súčasne sonikácia napomáha procesu zapuzdrenia a zachytenia, takže sa vyrábajú lipozómy s vysokou náplňou účinných látok. Pred zapuzdrením majú lipozómy tendenciu vytvárať zhluky v dôsledku interakcie povrchového náboja a náboja fosfolipidových polárnych hláv (porovnaj Mícková et al. 2008), navyše sa musia otvoriť. Ako príklad Zhu et al. (2003) popisujú zapuzdrenie biotínového prášku v lipozómoch ultrazvukom. Keď sa biotínový prášok pridal do suspenzného roztoku vezikúl, roztok bol sonikovaný. Po tejto liečbe bol biotín zachytený v lipozómoch.

Lipozomálne emulzie s ultrazvukom

Na zvýšenie ošetrujúceho účinku hydratačných alebo anti-aging krémov, pleťových vôd, gélov a iných kozmeceutických prípravkov sa do lipozomálnych disperzií pridáva emulgátor na stabilizáciu vyššieho množstva lipidov. Výskumy však ukázali, že schopnosť lipozómov je vo všeobecnosti obmedzená. Po pridaní emulgátorov sa tento účinok prejaví skôr a ďalšie emulgátory spôsobia oslabenie bariérovej afinity fosfatidylcholínu. Nanočastice – zložené z fosfatidylcholínu a lipidov – sú odpoveďou na tento problém. Tieto nanočastice sú tvorené kvapôčkou oleja, ktorá je pokrytá monovrstvou fosfatidylcholínu. Použitie nanočastíc umožňuje formulácie, ktoré sú schopné absorbovať viac lipidov a zostať stabilné, takže nie sú potrebné ďalšie emulgátory.
Ultrazvuk je osvedčená metóda výroby nanoemulzií a nanodisperzií. Vysoko intenzívny ultrazvuk dodáva energiu potrebnú na rozptýlenie kvapalnej fázy (dispergovaná fáza) v malých kvapôčkach v druhej fáze (kontinuálna fáza). V dispergačnej zóne spôsobujú implodujúce kavitačné bubliny intenzívne rázové vlny v okolitej kvapaline a vedú k tvorbe kvapalných prúdov s vysokou rýchlosťou kvapaliny. Na stabilizáciu novovytvorených kvapôčok disperznej fázy proti koalescencii sa do emulzie pridávajú emulgátory (povrchovo aktívne látky, povrchovo aktívne látky) a stabilizátory. Keďže koalescencia kvapiek po narušení ovplyvňuje konečnú distribúciu veľkosti kvapiek, používajú sa účinne stabilizačné emulgátory na udržanie konečnej distribúcie veľkosti kvapiek na úrovni, ktorá sa rovná distribúcii bezprostredne po narušení kvapiek v ultrazvukovej disperzujúcej zóne.

Lipozomálne disperzie pomocou ultrazvuku

Lipozomálne disperzie, ktoré sú založené na nenasýtenom fosfatidylchlóre, nemajú stabilitu proti oxidácii. Stabilizáciu disperzie je možné dosiahnuť pomocou antioxidantov, napríklad komplexom vitamínov C a E.
 

Tvorba lipozómov metódou odparovania reverznou fázou pomocou sonikácie

 
Ortan et al. (2002) dosiahli vo svojej štúdii týkajúcej sa ultrazvukovej prípravy éterického oleja Anethum graveolens v lipozómoch dobré výsledky. Po sonikácii bol rozmer lipozómov medzi 70-150 nm a pre MLV medzi 230-475 nm; tieto hodnoty boli približne konštantné aj po 2 mesiacoch, ale zanikli po 12 mesiacoch, najmä pri disperzii SUV (pozri histogramy nižšie). Meranie stability týkajúce sa straty esenciálneho oleja a distribúcie veľkosti tiež ukázalo, že lipozomálne disperzie udržiavajú obsah prchavého oleja. To naznačuje, že zachytenie éterického oleja v lipozómoch zvýšilo stabilitu oleja.

Ortan et al. (2009): Stabilita disperzií MLV a SUV po 1 roku. Lipozomálne formulácie sa uchovávali pri teplote 4±1 °C.

Ultrazvukové procesory Hielscher sú ideálnymi zariadeniami pre aplikácie v kozmetickom a farmaceutickom priemysle. Systémy pozostávajúce z niekoľkých ultrazvukových procesorov s výkonom až 16 000 wattov poskytujú kapacitu potrebnú na prevedenie tejto laboratórnej aplikácie do efektívnej výrobnej metódy na získanie jemne rozptýlených emulzií v kontinuálnom toku alebo v dávke – dosiahnutie výsledkov porovnateľných s dnešnými najlepšími dostupnými vysokotlakovými homogenizátormi, ako sú clonové ventily. Okrem tejto vysokej účinnosti pri kontinuálnej emulgácii vyžadujú ultrazvukové prístroje Hielscher veľmi nízku údržbu a veľmi ľahko sa ovládajú a čistia. Ultrazvuk v skutočnosti podporuje čistenie a oplachovanie. Ultrazvukový výkon je nastaviteľný a možno ho prispôsobiť konkrétnym produktom a požiadavkám na emulziáciu. K dispozícii sú aj špeciálne reaktory s prietokovými bunkami, ktoré spĺňajú pokročilé požiadavky CIP (čistenie na mieste) a SIP (sterilizácia na mieste).

Často kladené otázky o lipozómoch

Aké typy lipozómov sa líšia?

Lipozómy sú rozdelené do rôznych typov na základe ich veľkosti a počtu dvojvrstiev, ktoré obsahujú. Tieto kategórie zahŕňajú:

• Malé jednolamelové vezikuly (SUV): Jedná sa o najmenšie lipozómy s jednou lipidovou dvojvrstvou.
• Veľké jednolamelárne vezikuly (LUV): Tieto sú väčšie ako SUV a majú tiež jednu dvojvrstvu.
• Multilamelárne vezikuly (MLV): Obsahujú viacero sústredných dvojvrstiev.
• Multivezikulárne vezikuly (MVV): Tie sa skladajú z viacerých menších vezikúl vo väčšom vezikule.

 
Medzi ďalšie špecializované typy patria:

• PEGylované lipozómy: Lipozómy modifikované polyetylénglykolom (PEG) na zvýšenie stability a času cirkulácie.
• Nanolipozómy: Veľmi malé lipozómy, ktoré sa zvyčajne používajú na cielené podávanie liekov.

Aké vezikulárne štruktúry môžu lipozómy vykazovať?

Lipozómy sú ďalej kategorizované na základe štruktúry vezikúl do siedmich hlavných typov:

• Multilamelárne veľké vezikuly (MLV): Obsahujú viacero dvojvrstiev.
• Oligolamelárne vezikuly (OLV): Majte niekoľko dvojvrstiev.
• Malé jednolamelové vezikuly (SUV): Najmenší s jednou dvojvrstvou.
• Stredne veľké jednolamelárne vezikuly (MUV): Stredná veľkosť s jednou dvojvrstvou.
• Veľké jednolamelárne vezikuly (LUV): Väčší s jednou dvojvrstvou.
• Obrovské jednolamelárne vezikuly (GUV): Veľmi veľký s jednou dvojvrstvou.
• Multivezikulárne vezikuly (MVV): Viaceré vezikuly v jednom veľkom vezikule.

Aké sú rozdiely medzi lipozómami a niozómami?

Lipozómy a niozómy sa líšia hlavne svojím zložením:
Lipozómy: Vyrobené z dvojreťazcových fosfolipidov, ktoré môžu byť neutrálne alebo nabité.
Niozómy: Vyrobené z nenabitých jednoreťazcových povrchovo aktívnych látok a cholesterolu.
Obe štruktúry vznikajú sonikáciou, ktorá podporuje zostavovanie dvojvrstvových vezikúl.

Aká je ideálna veľkosť lipozómu?

Pre terapeutické podanie je ideálna veľkosť lipozómu teoreticky medzi priemerom 50 až 200 nanometrov. Tento rozsah veľkostí optimalizuje stabilitu a biologickú dostupnosť. Sonikácia sa bežne používa na zmenšenie vezikuly na požadovanú veľkosť.

Môžu lipozómy prenášať hydrofilné lieky?

Áno, lipozómy môžu prenášať hydrofilné lieky. V biomedicínskych aplikáciách sú cenené pre svoju schopnosť zapuzdriť hydrofóbne aj hydrofilné látky. Okrem toho ponúkajú vysokú biokompatibilitu a biologickú odbúrateľnosť, čo z nich robí efektívne systémy podávania.

Ako vyrobiť lipozómy?

Najbežnejšími technikami prípravy lipozómov sú tenkovrstvová metóda a metóda odparovania reverznou fázou.
Metóda hydratácie tenkého filmu:

1. Lipidy sa rozpustia v organickom rozpúšťadle.
2. Odparte rozpúšťadlo a vytvorte tenký lipidový film.
3. Hydratujte film vodným roztokom pomocou sonikácie, aby sa vytvorili multilamelárne vezikuly.

Metóda odparovania reverznej fázy:

1. Lipidy sa rozpustia vo vode a etanole.
2. Sonikujte roztok pri 60 °C asi 10 minút, aby sa vytvorila lipidová pasta.
3. Ochlaďte lipidovú suspenziu a za stáleho miešania pridajte vodu alebo pufr po kvapkách.
4. Suspenziu hydratujte 1 hodinu, aby sa vytvorili multilamelárne vezikuly.
5. Znížte veľkosť lipozómu ďalšou sonikáciou.

Čo sú archeozómy?

Archeozómy sú lipozómy vyrobené z archaálnych lipidov, ktoré sú známe svojou stabilitou a odolnosťou voči extrémnym podmienkam. Vďaka týmto vlastnostiam sú archeozómy obzvlášť užitočné pri podávaní liekov a vývoji vakcín v náročných prostrediach.

Ako sa pripravujú archeozómy?

Postup sonikácie podľa Pise (2022): Archeozómy môžu byť vyrobené z polárnej lipidovej frakcie “PLF” Sulfolobussolfataricus sonikáciou pri 60 °C bez potreby externého dopĺňania lipidov. Pri 0 °C boli polárne lipidy zo Sulfolobusacidocaldarius účinne sonikované za vzniku archeozómov. Archeozómy nabité BMD a konvenčné lipozómy, ako aj archaeálne lipidy izolované z Archaea H. salinarum a obohatené fosfatidylcholínom, boli vyrobené pomocou sonikačných techník. Sonikované vezikuly boli vytvorené na lokálne podávanie sonikovaním disperzií MLV pri 80 percentnej amplitúde počas 4 minút pomocou sondového typu Hielscher UP50H (pozri obrázok vľavo).

Literatúra/Referencie