Genetická transformácia rastlinných buniek pomocou ultrazvuku

Transformácia sprostredkovaná baktériami rodu Agrobacterium za pomoci sonikácie (SAAT) je účinná metóda infikovania rastlinných buniek cudzími génmi, pri ktorej sa Agrobacterium používa ako prenášač. Ultrazvuková kavitácia spôsobuje sonoporáciu, ktorú možno opísať ako cielené vytváranie mikroporanení rastlinného pletiva. Prostredníctvom týchto mikroporanení vytvorených ultrazvukom možno DNA a vektory DNA účinne prenášať do bunkovej matrice.

Sonoporácia – transformácia buniek zlepšená ultrazvukom

Pri pôsobení nízkofrekvenčného ultrazvuku (približne 20kHz) na bunkové suspenzie spôsobujú účinky akustickej kavitácie dočasné zvýšenie priepustnosti membrán buniek v pletivách. Tento ultrazvukový účinok je známy ako sonoporácia a používa sa na prenos génov do buniek alebo pletív.
Výhody pôsobenia ultrazvuku vychádzajú z jeho netepelného mechanického princípu účinku, vďaka ktorému je sonikácia často všestrannejšia a menej závislá od typu buniek. Všestranné uplatnenie sonoporácie otvára možnosť využívať transgénne rastliny, ktoré majú značný potenciál pri bioprodukcii komplexných ľudských terapeutických proteínov. Takéto rastlinné bioreaktory sa dajú ľahko geneticky upravovať, zabraňujú potenciálnej kontaminácii ľudskými patogénmi, nepoškodzujú baktérie sprostredkujúce transformáciu (napr. Agrobacterium) a predstavujú nenákladnú a účinnú metódu biosyntézy.

Transformácia buniek za pomoci ultrazvuku

Sonikácia je technika, ktorá využíva nízkofrekvenčné ultrazvukové vlny na rozprúdenie častíc v roztoku a miešanie roztokov, čím zvyšuje rýchlosť prenosu hmoty a rozpúšťania. Sonikácia zároveň dokáže odstraňovať rozpustené plyny z kvapalín. Pri transformácii rastlín sonikácia spôsobuje tvorbu mikroporanení na rastlinnom pletive a zlepšuje vnášanie nahej DNA do rastlinného protoplastu.

Pri genetickej transformácii je preferovanou metódou transformácia sprostredkovaná baktériami rodu Agrobacterium za pomoci sonikácie (SAAT), ktorá má výrazne vyššiu účinnosť než sonikácia používaná na priamy prenos nahej DNA a vektorov DNA do protoplastu. Početné štúdie preukázali, že transformáciu sprostredkovanú baktériami rodu Agrobacterium za pomoci sonikácie (SAAT) možno použiť na vyvolanie mechanického narušenia a tvorby poranení rastlinných buniek pôsobením ultrazvukových vĺn a následnej akustickej kavitácie. Krátke ultrazvukové ošetrenie vytvára mikroporanenia na povrchu explantátov. Poranené bunky umožňujú baktériám rodu Agrobacterium preniknúť do hlbších častí rastlinných pletív, čím sa zvyšuje pravdepodobnosť infikovania rastlinných buniek. Vylučované fenolové zlúčeniny navyše zlepšujú transformáciu. Mikroporanenia vytvorené ultrazvukom tiež uľahčujú prenikanie baktérií do explantátov. SAAT sa úspešne použila na genetickú transformáciu rastlinných druhov považovaných za obzvlášť odolné voči baktériám rodu Agrobacterium.
Hlavnými výhodami SAAT sú jej veľká jednoduchosť a nízke náklady, ako aj výrazné zlepšenie prenosu génov sprostredkovaného baktériami rodu Agrobacterium. Okrem úspešného použitia SAAT pri transformácii Chenopodium rubrum L. a Beta vulgaris L. sa tento prístup uplatnil aj pri produkcii rekombinantného termolabilného holotoxínu divokého typu Escherichia coli a vakcinačných adjuvans na báze mutantného LT Escherichia coli v Nicotiana tabacum, pričom najvyššie systémové titre IgG špecifických pre LT-B sa zistili u vtákov.
(porov. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka a R. Baranski, 2014)

Všeobecný postup prenosu génov do rastlinných buniek prostredníctvom sonoporácie

1. Príprava genetického materiálu: Začnite prípravou genetického materiálu, ktorý chcete vniesť do rastlinných buniek. Môže ísť o plazmidovú DNA, RNA alebo iné nukleové kyseliny.
2. Izolácia rastlinných buniek: Izolujte rastlinné bunky, na ktoré sa chcete zamerať. V závislosti od vášho experimentu môžu byť tieto bunky izolované z rastlinných pletív alebo kultúr.
3. Bunková suspenzia: Suspendujte rastlinné bunky vo vhodnom médiu alebo pufri. Je to nevyhnutné na zabezpečenie toho, aby boli bunky zdravé a v stave priaznivom na príjem génov.
4. Nastavenie sonikátora: Pripravte sondový sonikátor prednastavením parametrov sonikácie, ako sú amplitúda, čas, energia a teplota. Ponorte ultrazvukovú sondu do bunkovej suspenzie.
5. Sonikácia: Spustite sonikáciu. Rýchle kmitanie hrotu sondy vytvára v kvapaline kavitačné bubliny. Tieto bubliny sa vplyvom ultrazvukových vĺn rozpínajú a kolabujú, čím v suspenzii vytvárajú mechanické sily a mikroprúdenie.
6. Sonoporácia: Mechanické sily a mikroprúdenie vyvolané kavitáciou vytvárajú dočasné póry a otvory v membránach rastlinných buniek. Genetický materiál prítomný v suspenzii môže cez tieto póry vstúpiť do rastlinných buniek.
7. Inkubácia: Po ošetrení sonoporáciou inkubujte rastlinné bunky, aby sa mohli zotaviť a stabilizovať svoje membrány. Tento krok je kľúčový na zabezpečenie prežitia buniek a úspešného prenosu génov.

Prenos génov prostredníctvom baktérií rodu Agrobacterium alebo lipozómov

Existujú dva bežné spôsoby transfekcie rastlinných buniek. Ako nosič genetického materiálu využívajú buď baktérie rodu Agrobacterium, ktorý patrí medzi gramnegatívne baktérie, alebo lipozómy.

• Sonoporácia sprostredkovaná baktériami rodu Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens je baktéria bežne používaná v genetickom inžinierstve rastlín. Pri tejto metóde sa plazmidová DNA obsahujúca požadovaný gén zavedie do baktérií rodu Agrobacterium, ktoré sa potom zmiešajú s rastlinnými bunkami. Bunková suspenzia sa podrobí sonoporácii pomocou sondového sonikátora. Ultrazvuková energia zlepšuje prenos genetického materiálu z baktérií rodu Agrobacterium do rastlinných buniek. Táto metóda sa široko používa na genetickú modifikáciu rastlín.
• Sonoporácia sprostredkovaná lipozómami: Lipozómy sú vezikuly na báze lipidov, ktoré môžu prenášať genetický materiál. Pri tejto metóde sa lipozómy obsahujúce plazmidovú DNA alebo iné nukleové kyseliny zmiešajú s rastlinnými bunkami. Na uľahčenie príjmu lipozómov rastlinnými bunkami sa používa sonoporácia pomocou sondového sonikátora. Ultrazvuk narúša lipidové dvojvrstvy lipozómov, čím sa genetický materiál uvoľňuje do rastlinných buniek. Tento prístup je užitočný pri štúdiách prechodnej génovej expresie v rastlinných bunkách.

Vedecky preukázané prínosy transformácie sprostredkovanej baktériami rodu Agrobacterium s podporou sonikácie (SAAT)

Transformácia sprostredkovaná baktériami rodu Agrobacterium s podporou sonikácie (SAAT) sa použila pri mnohých rastlinných druhoch. Krátke a relatívne mierne ultrazvukové ošetrenie kultúr rastlinných buniek spôsobuje sonoporáciu, ktorá následne umožňuje hlboké prenikanie baktérií rodu Agrobacterium ako prenášača génov. Nižšie si môžete prečítať príklady štúdií, ktoré preukazujú priaznivé účinky SAAT.

Transformácia ašvagandy s podporou ultrazvuku

S cieľom zlepšiť účinnosť transformácie W. somnifera (známej ako ašvaganda alebo zimná čerešňa) skúmali Dehdashti a kolegovia (2016) použitie acetosyringónu (AS) a sonikácie.
Acetosyringón (AS) sa pridával v troch fázach: do tekutej kultúry Agrobacterium, počas infekcie baktériami Agrobacterium a počas spoločnej kultivácie explantátov s baktériami Agrobacterium. Zistilo sa, že pridanie 75 μM AS do tekutej kultúry Agrobacterium je optimálne na indukciu génov vir.
Dodatočné použitie sonikácie (SAAT) viedlo k najvyššej génovej expresii. Zistilo sa, že expresia génu gusA vo vlasových koreňoch bola najlepšia, keď sa listy sonikovali 10 sekúnd a vrcholy výhonkov 20s. Účinnosť transformácie pri použití zlepšeného protokolu dosiahla 66,5 % v prípade listových explantátov a 59,5% v prípade explantátov vrcholov výhonkov. V porovnaní s inými protokolmi sa zistilo, že účinnosť transformácie pri použití tohto zlepšeného protokolu bola 2,5-násobne vyššia pri listoch a 3,7-násobne vyššia pri vrcholoch výhonkov. Analýzy metódou Southern blot potvrdili 1–2 kópie transgénu gusA v líniách W1-W4, zatiaľ čo v línii W5 vytvorenej pomocou zlepšeného protokolu sa zistili 1–4 kópie transgénu.

Vplyv trvania sonikáciou podporovanej transformácie sprostredkovanej baktériami Agrobacterium (SAAT) na frekvenciu transformácie listových explantátov (a) a explantátov vrcholov výhonkov (b) W. somnifera
(štúdia a grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvukom podporovaná transformácia bavlníka

Hussain et al. (2007) preukazujú priaznivé účinky sonikáciou podporovanej transformácie bavlníka. Akustická kavitácia vyvolaná nízkofrekvenčným ultrazvukom vytvára mikroporanenia na povrchu rastlinného pletiva aj pod ním (sonoporácia) a umožňuje baktériám Agrobacterium preniknúť hlbšie a do celého rastlinného pletiva. Tento spôsob poranenia zvyšuje pravdepodobnosť infekcie rastlinných buniek uložených hlbšie v pletive. Na vyhodnotenie účinnosti transformácie metódou SAAT sa merala expresia génu GUS. Reportérový systém GUS je systém využívajúci reportérový gén, ktorý je obzvlášť užitočný v molekulárnej biológii rastlín a mikrobiológii. Úpravou rôznych parametrov SAAT sa výrazne zvýšila prechodná expresia GUS v bavlníku pri použití zrelých embryí ako explantátov. GUS sa prvýkrát detegoval 24h po inkubácii explantátov a po 48h bola expresia GUS veľmi intenzívna, čo slúžilo ako užitočný ukazovateľ úspešnej transformácie explantátu bavlníka po sonikáciou podporovanej transformácii sprostredkovanej baktériami Agrobacterium (SAAT). Pri porovnaní rôznych transformačných techník (konkrétne biolistickej metódy, Agro, BAAT, SAAT) vykazovala sonikáciou podporovaná transformácia sprostredkovaná baktériami Agrobacterium (SAAT) zďaleka najlepšie výsledky transformácie.

Výber transformačného postupu na základe prechodnej expresie GUS. Sonikáciou podporovaná transformácia sprostredkovaná baktériami Agrobacterium (SAAT) vykazuje výrazne vyššiu prechodnú expresiu.
(štúdia a grafika: © Hussain et al., 2007)

Vysokovýkonné ultrazvukové riešenia na sonoporáciu a SAAT

Hielscher Ultrasonics má dlhoročné skúsenosti s vývojom a výrobou vysokovýkonných ultrazvukových prístrojov pre laboratóriá, výskumné pracoviská aj priemyselnú výrobu s veľmi vysokou kapacitou spracovania. Pre mikrobiológiu a vedy o živej prírode ponúka Hielscher rôzne riešenia, ktoré spĺňajú rozličné požiadavky špecifických tkanív a ich spracovania. Na súčasné ultrazvukové spracovanie mnohých vzoriek ponúka Hielscher prístroj UIP400MTP pre viacjamkové platničky, VialTweeter na sonikáciu až 10 liekoviek (napr. skúmaviek Eppendorf) alebo ultrazvukový CupHorn. Sondové ultrazvukové prístroje sú dostupné s výkonom od 50 do 400 wattov pre laboratórne homogenizátory a od 500 wattov do 16 kW pre priemyselné systémy.
Kontaktujte nás a informujte nás o svojej aplikácii a procesných požiadavkách. Naši skúsení pracovníci vám radi odporučia najvhodnejší ultrazvukový prístroj pre váš biologický proces.
Nasledujúca tabuľka poskytuje orientačný prehľad približnej kapacity spracovania našich ultrazvukových prístrojov: