Sonikáciou asistovaná transformácia agrobaktériami (SAAT) je účinná metóda na infikovanie rastlinných buniek cudzími génmi pomocou agrobaktérie ako transportéra. Ultrazvuková kavitácia spôsobuje sonoporáciu, ktorú možno opísať ako cielené mikro-poranenie rastlinného tkaniva. Prostredníctvom týchto ultrazvukom vznikajú mikro-rany, DNA a DNA vektory môžu byť efektívne transportované do bunkovej matrice.

Sonoporation – Ultrazvukom vylepšená transformácia buniek

Keď sa nízkofrekvenčný ultrazvuk (cca 20 kHz) aplikuje na bunkové suspenzie, účinky akustickej kavitácie spôsobujú prechodnú membránovú permeabilizáciu na bunkových tkanivách. Tento ultrazvukový účinok je známy ako sonoporácia a používa sa na prenos génov do buniek alebo tkanív.
Výhody ultrazvukom sú založené na jeho netepelnom mechanickom pracovnom princípe, vďaka ktorému je ultrazvukom často všestrannejšia a menej závislá od typov buniek. Všestranné uplatnenie sonoporácie otvára možnosť využitia transgénnych rastlín, ktoré majú významný potenciál v bioprodukcii komplexných ľudských terapeutických proteínov. Takéto rastlinné bioreaktory sa dajú ľahko geneticky manipulovať, zabrániť potenciálnej kontaminácii ľudskými patogénmi, nepoškodzovať transformačné sprostredkujúce baktérie (napr. Agrobacterium) a sú lacnou a účinnou metódou bioelektenzy.

Ultrazvukom asistovaná bunková transformácia

Ultrazvukom je technika, ktorá aplikuje nízkofrekvenčné ultrazvukové vlny na miešanie častíc v roztoku, na miešanie roztokov, čím sa zvyšuje rýchlosť prenosu a rozpúšťania hmoty. Súčasne môže ultrazvukom odstrániť rozpustené plyny z kvapalín. Pri transformácii rastlín sonikácia spôsobí tvorbu mikrovlákien na rastlinnom tkanive a zvýši dodávku nahej DNA do protoplastu rastliny.

Pre genetickú transformáciu je preferovanou metódou Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) a má výrazne vyššiu účinnosť ako ultrazvukom používaný na prenos nahých vektorov DNA a DNA priamo do protoplastu. Početné štúdie preukázali, že ultrazvukom asistovaná transformácia sprostredkovaná agrobaktériou (SAAT) sa môže použiť na vyvolanie mechanického narušenia a tvorby rán na rastlinných bunkách ultrazvukovými vlnami a výslednou akustickou kavitáciou. Krátke ultrazvukové ošetrenie vytvára mikro-rany na povrchu explantátov. Pretože zranené bunky umožnia prenikanie Agrobaktérie do hlbšej časti rastlinných tkanív, čím sa zvýši pravdepodobnosť infikovania rastlinných buniek. Okrem toho vylučované fenolové zlúčeniny zvyšujú transformáciu. Ultrazvukom generované mikro-rany robia explant penetráciu baktériami tiež uskutočniteľnejšou. SAAT bol úspešne použitý na genetickú transformáciu u rastlinných druhov, ktoré sa považujú najmä za rezistentné voči agrobaktériám.
Veľmi jednoduchá a lacná metóda, ako aj výrazné zlepšenie prenosu génov sprostredkovaných agrobaktériami sú hlavnými výhodami SAAT. Okrem úspešnej aplikácie SAAT pri transformácii Chenopodium rubrum L. a Beta vulgaris L. sa tento prístup uplatnil aj pri výrobe rekombinantných escherichia coli divokého tepelne labilného holotoxínu a mutantných adjuvansov LT vakcíny Escherichia coli v Nicotiana tabacum, v ktorých boli u vtákov zistené najvyššie systémové titre IgG špecifické pre LT-B.
(porov. Laere a kol., 2016; M. Klimek-Chodacka a R. Baranski, 2014)

Všeobecný postup prenosu génov prostredníctvom sonoporácie v rastlinných bunkách

1. Príprava genetického materiálu: Začnite prípravou genetického materiálu, ktorý chcete zaviesť do rastlinných buniek. Môže to byť plazmidová DNA, RNA alebo iné nukleové kyseliny.
2. Izolácia rastlinných buniek: Izolujte rastlinné bunky, na ktoré chcete zacieliť. V závislosti od experimentu môžu byť tieto bunky izolované z rastlinných tkanív alebo kultúr.
3. Bunková suspenzia: Rastlinné bunky suspendujte vo vhodnom médiu alebo tlmivom roztoku. Je to nevyhnutné na zabezpečenie toho, aby boli bunky zdravé a v stave vedúcom k absorpcii génov.
4. Nastavte si Sonicator: Pripravte si sondový sonikátor prednastavením parametrov ultrazvukom, ako je amplitúda, čas, energia a teplota. Ponorte ultrazvukovú sondu do bunkovej suspenzie.
5. Ultrazvukom: Začnite postup ultrazvukom. Rýchla oscilácia hrotu sondy vytvára kavitačné bubliny v kvapaline. Tieto bubliny sa rozširujú a zrútia v dôsledku ultrazvukových vĺn, vytvárajú mechanické sily a mikrostreaming v suspenzii.
6. Sonoporácia: Mechanické sily a mikroprúdenie generované kavitáciou vytvárajú dočasne póry a diery v membránach rastlinných buniek. Genetický materiál prítomný v suspenzii môže vstúpiť do rastlinných buniek cez tieto póry.
7. Inkubačná: Po sonoporačnej kúre inkubujte rastlinné bunky, aby sa mohli zotaviť a stabilizovať svoje membrány. Toto je kľúčový krok na zabezpečenie prežitia buniek a úspešného prenosu génov.

Prenos génov prostredníctvom agrobaktérií alebo lipozómov

Existujú dve bežné formy na transfekciu rastlinných buniek. Používajú buď agrobaktérie, rod gramnegatívnych baktérií, alebo lipozómy ako nosič genetického materiálu.

• Sonoporácia sprostredkovaná agrobaktériami: Agrobacterium tumefaciens je baktéria bežne používaná v rastlinnom genetickom inžinierstve. Pri tejto metóde sa plazmidová DNA obsahujúca požadovaný gén zavádza do Agrobacterium, ktorá sa potom zmieša s rastlinnými bunkami. Bunková suspenzia sa podrobí sonoporácii pomocou sondového sonikátora. Ultrazvuková energia zvyšuje prenos genetického materiálu z Agrobacterium do rastlinných buniek. Táto metóda sa široko používa na genetickú modifikáciu rastlín.
• Sonoporácia sprostredkovaná lipozómami: Lipozómy sú vezikuly na báze lipidov, ktoré môžu niesť genetický materiál. Pri tejto metóde sa lipozómy nabité plazmidovou DNA alebo inými nukleovými kyselinami zmiešajú s rastlinnými bunkami. Sonoporácia pomocou sondového sonikátora sa používa na uľahčenie absorpcie lipozómov rastlinnými bunkami. Ultrazvuk narúša lipidové dvojvrstvy lipozómov a uvoľňuje genetický materiál do rastlinných buniek. Tento prístup je užitočný pre štúdie prechodnej génovej expresie v rastlinných bunkách.

Vedecky dokázané výhody transformácie sprostredkovanej sonikáciou agrobaktériou (SAAT)

Sonikačno-asistovaná transformácia agrobaktérií (SAAT) bola aplikovaná na mnohé druhy rastlín. Krátke a relatívne mierne ultrazvukové ošetrenie rastlinných bunkových kultúr spôsobuje sonoporáciu, ktorá následne umožňuje hlbokú penetráciu Agrobacterium ako transportéra génov. Nižšie si môžete prečítať príkladné štúdie demonštrujúce priaznivé účinky SAAT.

Ultrazvukom asistovaná transformácia Ashwagandhy

S cieľom zlepšiť účinnosť transformácie u W. somnifera (známa ako ashwagandha alebo zimná čerešňa) Dehdashti a kolegovia (2016) skúmali použitie acetosyringónu (AS) a sonikácie.
Acetosyringón (AS) bol pridaný v troch fázach: tekutá kultúra Agrobacterium, infekcia Agrobacterium a kokultivácia explantantov s Agrobacterium. Zistilo sa, že pridanie 75 μM AS do tekutej kultúry Agrobacterium je optimálne pre indukciu virových génov.
Dodatočná aplikácia sonikácie (SAAT) viedla k najvyššej génovej expresii. Zistilo sa, že expresia génu gusA v chlpatých koreňoch je najlepšia, keď sa listy a špičky výhonkov sonikovali 10 a 20 s. Účinnosť transformácie vylepšeného protokolu bola zaznamenaná 66,5 a 59,5% v prípade listových a výhonkových hrotov. V porovnaní s inými protokolmi sa zistilo, že účinnosť transformácie tohto vylepšeného protokolu je 2,5-krát vyššia pre listy a 3,7-násobne vyššia pre špičky výhonkov. Analýzy južných škvŕn potvrdili 1–2 kópie transgénu gusA v líniách W1-W4, zatiaľ čo 1–4 transgénové kópie boli detegované v riadku W5 generovanom vylepšeným protokolom.

Vplyv trvania sonikáciou asistovanej transformácie agrobaktériami (SAAT) na frekvenciu transformácie listov W. somnifera (a) a hrotov výhonkov b)
(štúdia a grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvukom asistovaná transformácia bavlny

Hussain et al. (2007) demonštrujú priaznivé účinky transformácie bavlny asistovanej ultrazvukom. Akustická kavitácia spôsobená nízkofrekvenčným ultrazvukom vytvára mikro-rany na povrchu a pod povrchom rastlinného tkaniva (sonoporácia) a umožňuje Agrobacterium cestovať hlbšie a úplne cez rastlinné tkanivo. Tento spôsob poranenia zvyšuje pravdepodobnosť infikovania rastlinných buniek ležiacich hlbšie v tkanive. S cieľom vyhodnotiť účinnosť transformácie SAAT sa merala génová expresia GUS. Systém reportérov GUS je génový systém reportéra, obzvlášť užitočný v molekulárnej biológii rastlín a mikrobiológii. Úpravou rôznych parametrov SAAT sa výrazne zlepšila prechodná expresia GUS v bavlne s použitím zrelých embryí ako explantácie. GUS bol prvýkrát detegovaný 24 hodín po inkubácii explantantov a do 48 hodín bola expresia GUS veľmi intenzívna, čo slúžilo ako užitočný indikátor úspešnej transformácie explantu bavlny po sonikačnej asistovanej transformácii agrobaktériou (SAAT). Porovnanie rôznych transformačných techník (konkrétne biolistických, Agro, BAAT, SAAT), sonikáciou asistovanej transformácie agrobaktériami (SAAT) ukázalo zďaleka najlepšie výsledky transformácie.

Výber transformačného postupu na základe prechodného prejavu GUS. Sonikáciou asistovaná transformácia agrobaktériou (SAAT) vykazuje významne vyššiu prechodnú expresiu.
(štúdia a grafika: © Hussain et al., 2007)

Vysoko výkonné ultrazvukové riešenia pre sonoporáciu a SAAT

Hielscher Ultrasonics má dlhoročné skúsenosti s vývojom a výrobou vysokovýkonných ultrazvukových prístrojov pre laboratóriá, výskumné zariadenia, ako aj priemyselnú výrobu s veľmi vysokou priepustnosťou. Pre mikrobiológiu a vedu o živej prírode ponúka Hielscher rôzne riešenia na splnenie rôznych požiadaviek potrebných pre konkrétne tkanivá a ich liečbu. Pre súčasné ultrazvukom mnohých vzoriek Hielscher ponúka UIP400MTP pre viacbunkové platne, VialTweeter na sonikáciu až 10 injekčných liekoviek (napr. Eppendorfove trubice) alebo ultrazvukový CupHorn. Ultrazvukové prístroje typu sondy sú k dispozícii od 50 do 400 wattov ako laboratórne homogenizátory, zatiaľ čo priemyselné systémy pokrývajú rozsah výkonu od 500 wattov do 16 kW.
Kontaktujte nás a dajte nám vedieť o vašej žiadosti a požiadavkách na proces. Náš skúsený personál vám rád odporučí najvhodnejší ultrasonicator pre váš biologický proces.
Nasledujúca tabuľka vám uvádza približnú spracovateľskú kapacitu našich ultrazvukov: