Genetická transformácia v rastlinných bunkách pomocou ultrazvuku

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) je účinná metóda na infikovanie rastlinných buniek cudzími génmi pomocou Agrobacterium ako transportéra. Ultrazvuková kavitácia spôsobuje sonoporáciu, ktorú možno opísať ako cielené mikroporanenie rastlinného tkaniva. Prostredníctvom nich ultrazvukom vytvára mikrorany sa DNA a vektory DNA môžu efektívne transportovať do bunkovej matrice.

Sonoporácia – Ultrazvukom vylepšená bunková transformácia

Keď sa na bunkové suspenzie aplikuje nízkofrekvenčný ultrazvuk (približne 20 kHz), účinky akustickej kavitácie spôsobujú prechodnú membránovú permeabilizáciu na bunkové tkanivá. Tento ultrazvukový efekt je známy ako sonoporácia a používa sa na prenos génov do buniek alebo tkanív.
Výhody ultrazvuku sú založené na jej netepelnom mechanickom princípe fungovania, vďaka ktorému je sonikácia často univerzálnejšia a menej závislá od typov buniek. Všestranná aplikácia sonoporácie otvára možnosť využitia transgénnych rastlín, ktoré majú významný potenciál v bioprodukcii komplexných ľudských terapeutických proteínov. Takéto rastlinné bioreaktory sa dajú ľahko geneticky manipulovať, zabraňujú potenciálnej kontaminácii ľudskými patogénmi, nepoškodzujú baktérie sprostredkúvajúce transformáciu (napr. Agrobacterium) a sú lacnou a účinnou metódou biosyntézy.

Ultrazvukom asistovaná bunková transformácia

Sonikácia je technika, ktorá aplikuje nízkofrekvenčné ultrazvukové vlny na miešanie častíc v roztoku, na miešanie roztokov, čím sa zvyšuje rýchlosť prenosu a rozpúšťania hmoty. Súčasne môže sonikacia odstrániť rozpustené plyny z kvapalín. Pri transformácii rastlín spôsobí sonikácia tvorbu mikrorán na rastlinnom tkanive a zvýši dodanie nahej DNA do rastlinného protoplastu.

Pre genetickú transformáciu je preferovanou metódou Sonication-Assisted Agrobacterium-Transitionated Transformation (SAAT), ktorá má výrazne vyššiu účinnosť ako sonikácia používaná na prenos nahej DNA a vektorov DNA priamo do protoplastu. Početné štúdie preukázali, že sonikáciou asistovaná transformácia sprostredkovaná Agrobacterium (SAAT) sa môže použiť na vyvolanie mechanického narušenia a tvorby rán na rastlinných bunkách ultrazvukovými vlnami a výslednou akustickou kavitáciou. Krátke ultrazvukové ošetrenie vytvára mikrorany na povrchu explantátov. Pretože poranené bunky umožnia prenikanie Agrobacterium do hlbšej časti rastlinných tkanív, čím sa zvyšuje pravdepodobnosť infikovania rastlinných buniek. Okrem toho vylučované fenolové zlúčeniny zvyšujú transformáciu. Ultrazvukom generované mikrorany sú tiež uskutočniteľnejšie prenikanie baktérií do explantátu. SAAT bol úspešne použitý na genetickú transformáciu u druhov rastlín, ktoré sa považujú najmä za rezistentné voči Agrobacterium.
Keďže ide o veľmi jednoduchú a lacnú metódu, ako aj výrazné zlepšenie prenosu génov sprostredkovaného Agrobacterium sú hlavnými výhodami SAAT. Okrem úspešnej aplikácie SAAT pri transformácii Chenopodium rubrum L. a Beta vulgaris L. sa tento prístup uplatnil aj pri výrobe rekombinantných tepelne labilných holotoxínov divokého typu Escherichia coli a adjuvantov s mutantom LT vakcíny Escherichia coli v Nicotiana tabacum, v ktorých boli u vtákov zistené najvyššie systémové titre IgG špecifické pre LT-B.
(porovnaj Laere a kol., 2016; M. Klimek-Chodacka a R. Baranski, 2014)

Všeobecný postup prenosu génov prostredníctvom sonoporácie v rastlinných bunkách

1. Príprava genetického materiálu: Začnite prípravou genetického materiálu, ktorý chcete zaviesť do rastlinných buniek. Môže to byť plazmidová DNA, RNA alebo iné nukleové kyseliny.
2. Izolácia rastlinných buniek: Izolujte rastlinné bunky, na ktoré sa chcete zamerať. V závislosti od vášho experimentu môžu byť tieto bunky izolované z rastlinných tkanív alebo kultúr.
3. Bunková suspenzia: Rastlinné bunky suspendujte vo vhodnom médiu alebo tlmivom roztoku. Je to nevyhnutné na zabezpečenie toho, aby boli bunky zdravé a v stave priaznivom pre absorpciu génov.
4. Nastavte svoj Sonicator: Pripravte si sondový sonikátor prednastavením parametrov sonikácie, ako je amplitúda, čas, energia a teplota. Ponorte ultrazvukovú sondu do bunkovej suspenzie.
5. Ultrazvukom: Spustite procedúru sonikácie. Rýchla oscilácia hrotu sondy vytvára v kvapaline kavitačné bubliny. Tieto bubliny sa rozširujú a zrútia v dôsledku ultrazvukových vĺn, čím vytvárajú mechanické sily a mikroprúdenie v suspenzii.
6. Sonoporácia: Mechanické sily a mikroprúdenie generované kavitáciou vytvárajú dočasne póry a otvory v membránach rastlinných buniek. Genetický materiál prítomný v suspenzii môže cez tieto póry vstúpiť do rastlinných buniek.
7. Inkubačná: Po sonoporačnom ošetrení inkubujte rastlinné bunky, aby sa mohli zotaviť a stabilizovať svoje membrány. Ide o zásadný krok k zabezpečeniu prežitia buniek a úspešného prenosu génov.

Prenos génov prostredníctvom agrobaktérií alebo lipozómov

Existujú dve bežné formy na transfekciu rastlinnej bunky. Ako nosič genetického materiálu používajú buď agrobaktériu, rod gramnegatívnych baktérií, alebo lipozómy.

• Sonoporácia sprostredkovaná agrobaktériami: Agrobacterium tumefaciens je baktéria bežne používaná v genetickom inžinierstve rastlín. Pri tejto metóde sa plazmidová DNA obsahujúca požadovaný gén zavádza do Agrobacterium, ktorá sa potom zmieša s rastlinnými bunkami. Bunková suspenzia sa podrobí sonoporácii pomocou sondového sonikátora. Ultrazvuková energia zvyšuje prenos genetického materiálu z Agrobacterium do rastlinných buniek. Táto metóda je široko používaná na genetickú modifikáciu rastlín.
• Sonoporácia sprostredkovaná lipozómami: Lipozómy sú vezikuly na báze lipidov, ktoré môžu niesť genetický materiál. Pri tejto metóde sa lipozómy nabité plazmidovou DNA alebo inými nukleovými kyselinami zmiešajú s rastlinnými bunkami. Sonoporácia pomocou sondového ultrazvuku sa používa na uľahčenie absorpcie lipozómov rastlinnými bunkami. Ultrazvuk narúša lipidové dvojvrstvy lipozómov a uvoľňuje genetický materiál do rastlinných buniek. Tento prístup je užitočný pre štúdie prechodnej génovej expresie v rastlinných bunkách.

Vedecky dokázané výhody transformácie sprostredkovanej agrobaktériami pomocou sonikácie (SAAT)

Transformácia sprostredkovaná agrobaktériami (SAAT) bola aplikovaná na mnohé druhy rastlín. Krátke a relatívne mierne ultrazvukové ošetrenie rastlinných bunkových kultúr spôsobuje sonoporáciu, ktorá následne umožňuje hlboké prenikanie Agrobacterium ako génového transportéra. Nižšie si môžete prečítať príkladné štúdie preukazujúce priaznivé účinky SAAT.

Ultrazvukom asistovaná transformácia Ashwagandhy

S cieľom zlepšiť účinnosť transformácie u W. somnifera (známej ako ashwagandha alebo zimná čerešňa) Dehdashti a kolegovia (2016) skúmali použitie acetosyringónu (AS) a sonikácie.
Acetosyringón (AS) bol pridaný v troch fázach: tekutá kultúra Agrobacterium, infekcia Agrobacterium a kokultúra explantátov s Agrobacterium. Zistilo sa, že pridanie 75 μM AS do tekutej kultúry Agrobacterium je optimálne pre indukciu génov vírusu.
Dodatočná aplikácia sonikácie (SAAT) viedla k najvyššej génovej expresii. Zistilo sa, že expresia génu gusA vo chlpatých koreňoch je najlepšia, keď boli listy a špičky výhonkov sonikované 10 a 20 rokov. Transformačná účinnosť vylepšeného protokolu bola zaznamenaná 66,5 % a 59,5 % v prípade explantátov hrotov listov a výhonkov. V porovnaní s inými protokolmi sa zistilo, že transformačná účinnosť tohto vylepšeného protokolu je 2,5-krát vyššia pre listy a 3,7-krát vyššia pre špičky výhonkov. Analýza Southern blot potvrdila 1–2 kópie transgénu gusA v líniách W1-W4, zatiaľ čo 1–4 kópie transgénu boli zistené v línii W5 generovanej vylepšeným protokolom.

Vplyv trvania sonikáciou asistovanej transformácie sprostredkovanej agrobaktériami (SAAT) na frekvenciu transformácie explantátov listov (a) a hrotu výhonku (b) W. somnifera
(štúdia a grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrazvukom asistovaná transformácia bavlny

Hussain et al. (2007) demonštrujú priaznivé účinky sonikácie asistovanej transformácie bavlny. Akustická kavitácia spôsobená nízkofrekvenčným ultrazvukom vytvára mikrorany na povrchu rastlinného tkaniva a pod ním (sonoporácia) a umožňuje Agrobacterium cestovať hlbšie a úplne cez rastlinné tkanivo. Tento spôsob zranenia zvyšuje pravdepodobnosť infikovania rastlinných buniek ležiacich hlbšie v tkanive. Na vyhodnotenie transformačnej účinnosti SAAT bola meraná expresia génu GUS. Reportérový systém GUS je reportérový génový systém, obzvlášť užitočný v molekulárnej biológii a mikrobiológii rastlín. Úpravou rôznych parametrov SAAT sa výrazne zvýšila prechodná expresia GUS v bavlne pomocou zrelých embryí ako explantátu. GUS bol prvýkrát zistený 24 hodín po inkubácii explantátov a do 48 hodín bola expresia GUS veľmi intenzívna, čo slúžilo ako užitočný indikátor úspešnej transformácie explantátu bavlny po sonikácii asistovanej transformáciou sprostredkovanou Agrobacterium (SAAT). Porovnanie rôznych transformačných techník (menovite biolistické, Agro, BAAT, SAAT), sonikáciou asistovanej transformácie sprostredkovanej Agrobacterium (SAAT) ukázalo zďaleka najlepšie výsledky transformácie.

Voľba transformačného postupu na základe prechodnej expresie GUS. Transformácia sprostredkovaná agrobaktériami (SAAT) s pomocou sonikácie vykazuje výrazne vyššiu prechodnú expresiu.
(štúdia a grafika: © Hussain et al., 2007)

Vysokovýkonné ultrazvukové riešenia pre sonoporáciu a SAAT

Spoločnosť Hielscher Ultrasonics má dlhoročné skúsenosti s vývojom a výrobou vysokovýkonných ultrazvukových prístrojov pre laboratóriá, výskumné zariadenia, ako aj priemyselnú výrobu s veľmi vysokou priepustnosťou. Pre mikrobiológiu a biologické vedy ponúka spoločnosť Hielscher rôzne riešenia na prispôsobenie sa rôznym požiadavkám potrebným pre konkrétne tkanivá a ich ošetrenie. Pre súčasnú ultrazvukovú ultrazvukovú nahrávku mnohých vzoriek ponúka spoločnosť Hielscher UIP400MTP pre viacjamkové platničky, VialTweeter pre sonikáciu až 10 injekčných liekoviek (napr. Eppendorfove trubice) alebo ultrazvukový CupHorn. Ultrazvukové sondy sú k dispozícii od 50 do 400 W ako laboratórne homogenizátory, zatiaľ čo priemyselné systémy pokrývajú rozsah výkonu od 500 W do 16 kW.
Kontaktujte nás a dajte nám vedieť o svojich požiadavkách na aplikáciu a proces. Náš skúsený personál vám rád odporučí najvhodnejší ultrazvuk pre váš biologický proces.
Nasledujúca tabuľka vám poskytuje približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových prístrojov: