Genetická transformácia v rastlinných bunkách pomocou ultrazvuku

Sonikáciou asistovaná transformácia agrobaktériami (SAAT) je účinná metóda na infikovanie rastlinných buniek cudzími génmi pomocou agrobaktérie ako transportéra. Ultrazvuková kavitácia spôsobuje sonoporáciu, ktorú možno opísať ako cielené mikro-poranenie rastlinného tkaniva. Prostredníctvom týchto ultrazvukom vznikajú mikro-rany, DNA a DNA vektory môžu byť efektívne transportované do bunkovej matrice.

Sonoporation – Ultrazvukom vylepšená transformácia buniek

Ultrasonicator UP100H je laboratórny homogenizátor, ktorý sa často používa na prípravu vzoriek dosiek bunkových kultúr.Keď sa nízkofrekvenčný ultrazvuk (cca 20 kHz) aplikuje na bunkové suspenzie, účinky akustickej kavitácie spôsobujú prechodnú membránovú permeabilizáciu na bunkových tkanivách. Tento ultrazvukový účinok je známy ako sonoporácia a používa sa na prenos génov do buniek alebo tkanív.
Výhody ultrazvukom sú založené na jeho netepelnom mechanickom pracovnom princípe, vďaka ktorému je ultrazvukom často všestrannejšia a menej závislá od typov buniek. Všestranné uplatnenie sonoporácie otvára možnosť využitia transgénnych rastlín, ktoré majú významný potenciál v bioprodukcii komplexných ľudských terapeutických proteínov. Takéto rastlinné bioreaktory sa dajú ľahko geneticky manipulovať, zabrániť potenciálnej kontaminácii ľudskými patogénmi, nepoškodzovať transformačné sprostredkujúce baktérie (napr. Agrobacterium) a sú lacnou a účinnou metódou bioelektenzy.

Žiadosť o informácie





Video ukazuje ultrazvukový systém prípravy vzoriek UIP400MTP, ktorý umožňuje spoľahlivú prípravu vzoriek akýchkoľvek štandardných multi-well dosiek pomocou ultrazvuku s vysokou intenzitou. Typické aplikácie UIP400MTP zahŕňajú bunkovú lýzu, DNA, RNA a strihanie chromatínu, ako aj extrakciu bielkovín.

Ultrasonicator UIP400MTP pre multi-well dosky ultrazvukom

Ultrazvukom asistovaná bunková transformácia

Ultrazvukové prístroje typu sondy, ako je UP200St, sú spoľahlivé tkanivové homogenizátory a široko používané na prípravu vzoriek v genetike, napr. na ultrazvukom asistovanú transformáciu agrobaktérií (SAAT).Ultrazvukom je technika, ktorá aplikuje nízkofrekvenčné ultrazvukové vlny na miešanie častíc v roztoku, na miešanie roztokov, čím sa zvyšuje rýchlosť prenosu a rozpúšťania hmoty. Súčasne môže ultrazvukom odstrániť rozpustené plyny z kvapalín. Pri transformácii rastlín sonikácia spôsobí tvorbu mikrovlákien na rastlinnom tkanive a zvýši dodávku nahej DNA do protoplastu rastliny.

Pre genetickú transformáciu je preferovanou metódou Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation (SAAT) a má výrazne vyššiu účinnosť ako ultrazvukom používaný na prenos nahých vektorov DNA a DNA priamo do protoplastu. Početné štúdie preukázali, že ultrazvukom asistovaná transformácia sprostredkovaná agrobaktériou (SAAT) sa môže použiť na vyvolanie mechanického narušenia a tvorby rán na rastlinných bunkách ultrazvukovými vlnami a výslednou akustickou kavitáciou. Krátke ultrazvukové ošetrenie vytvára mikro-rany na povrchu explantátov. Pretože zranené bunky umožnia prenikanie Agrobaktérie do hlbšej časti rastlinných tkanív, čím sa zvýši pravdepodobnosť infikovania rastlinných buniek. Okrem toho vylučované fenolové zlúčeniny zvyšujú transformáciu. Ultrazvukom generované mikro-rany robia explant penetráciu baktériami tiež uskutočniteľnejšou. SAAT bol úspešne použitý na genetickú transformáciu u rastlinných druhov, ktoré sa považujú najmä za rezistentné voči agrobaktériám.
Veľmi jednoduchá a lacná metóda, ako aj výrazné zlepšenie prenosu génov sprostredkovaných agrobaktériami sú hlavnými výhodami SAAT. Okrem úspešnej aplikácie SAAT pri transformácii Chenopodium rubrum L. a Beta vulgaris L. sa tento prístup uplatnil aj pri výrobe rekombinantných escherichia coli divokého tepelne labilného holotoxínu a mutantných adjuvansov LT vakcíny Escherichia coli v Nicotiana tabacum, v ktorých boli u vtákov zistené najvyššie systémové titre IgG špecifické pre LT-B.
(porov. Laere a kol., 2016; M. Klimek-Chodacka a R. Baranski, 2014)

VialTweeter sa môže použiť na dna infekciu plánovacích buniek, napr. pomocou sonikáciou asistovanej agrobaktériovej sprostredkovanej transformácie (SAAT)

VialTweeter pre súčasnú sonikáciu skúmaviek s viacerými vzorkami, napr. pre sonikáciou asistovanú transformáciu sprostredkovanú agrobaktériami (SAAT)

Vedecky dokázané výhody transformácie sprostredkovanej sonikáciou agrobaktériou (SAAT)

Sonikačno-asistovaná transformácia agrobaktérií (SAAT) bola aplikovaná na mnohé druhy rastlín. Krátke a relatívne mierne ultrazvukové ošetrenie rastlinných bunkových kultúr spôsobuje sonoporáciu, ktorá následne umožňuje hlbokú penetráciu Agrobacterium ako transportéra génov. Nižšie si môžete prečítať príkladné štúdie demonštrujúce priaznivé účinky SAAT.

Ultrazvukom asistovaná transformácia Ashwagandhy

S cieľom zlepšiť účinnosť transformácie u W. somnifera (známa ako ashwagandha alebo zimná čerešňa) Dehdashti a kolegovia (2016) skúmali použitie acetosyringónu (AS) a sonikácie.
Acetosyringón (AS) bol pridaný v troch fázach: tekutá kultúra Agrobacterium, infekcia Agrobacterium a kokultivácia explantantov s Agrobacterium. Zistilo sa, že pridanie 75 μM AS do tekutej kultúry Agrobacterium je optimálne pre indukciu virových génov.
Dodatočná aplikácia sonikácie (SAAT) viedla k najvyššej génovej expresii. Zistilo sa, že expresia génu gusA v chlpatých koreňoch je najlepšia, keď sa listy a špičky výhonkov sonikovali 10 a 20 s. Účinnosť transformácie vylepšeného protokolu bola zaznamenaná 66,5 a 59,5% v prípade listových a výhonkových hrotov. V porovnaní s inými protokolmi sa zistilo, že účinnosť transformácie tohto vylepšeného protokolu je 2,5-krát vyššia pre listy a 3,7-násobne vyššia pre špičky výhonkov. Analýzy južných škvŕn potvrdili 1–2 kópie transgénu gusA v líniách W1-W4, zatiaľ čo 1–4 transgénové kópie boli detegované v riadku W5 generovanom vylepšeným protokolom.

Trvanie ultrazvuku (čas vystavený ultrazvuku) ovplyvňuje sonikačne asistovanú transformáciu agrobaktériou (SAAT) pri transformácii vo W. somnifera

Vplyv trvania sonikáciou asistovanej transformácie agrobaktériami (SAAT) na frekvenciu transformácie listov W. somnifera (a) a hrotov výhonkov b)
(štúdia a grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Žiadosť o informácie





Ultrazvukom asistovaná transformácia bavlny

Hussain et al. (2007) demonštrujú priaznivé účinky transformácie bavlny asistovanej ultrazvukom. Akustická kavitácia spôsobená nízkofrekvenčným ultrazvukom vytvára mikro-rany na povrchu a pod povrchom rastlinného tkaniva (sonoporácia) a umožňuje Agrobacterium cestovať hlbšie a úplne cez rastlinné tkanivo. Tento spôsob poranenia zvyšuje pravdepodobnosť infikovania rastlinných buniek ležiacich hlbšie v tkanive. S cieľom vyhodnotiť účinnosť transformácie SAAT sa merala génová expresia GUS. Systém reportérov GUS je génový systém reportéra, obzvlášť užitočný v molekulárnej biológii rastlín a mikrobiológii. Úpravou rôznych parametrov SAAT sa výrazne zlepšila prechodná expresia GUS v bavlne s použitím zrelých embryí ako explantácie. GUS bol prvýkrát detegovaný 24 hodín po inkubácii explantantov a do 48 hodín bola expresia GUS veľmi intenzívna, čo slúžilo ako užitočný indikátor úspešnej transformácie explantu bavlny po sonikačnej asistovanej transformácii agrobaktériou (SAAT). Porovnanie rôznych transformačných techník (konkrétne biolistických, Agro, BAAT, SAAT), sonikáciou asistovanej transformácie agrobaktériami (SAAT) ukázalo zďaleka najlepšie výsledky transformácie.

Sonikáciou asistovaná transformácia agrobaktériami (SAAT) vykazuje významne vyššiu prechodnú expresiu v porovnaní s alternatívnymi infekčnými metódami.

Výber transformačného postupu na základe prechodného prejavu GUS. Sonikáciou asistovaná transformácia agrobaktériou (SAAT) vykazuje významne vyššiu prechodnú expresiu.
(štúdia a grafika: © Hussain et al., 2007)

Vysoko výkonné ultrazvukové riešenia pre sonoporáciu a SAAT

Hielscher Ultrasonics má dlhoročné skúsenosti s vývojom a výrobou vysokovýkonných ultrazvukových prístrojov pre laboratóriá, výskumné zariadenia, ako aj priemyselnú výrobu s veľmi vysokou priepustnosťou. Pre mikrobiológiu a vedu o živej prírode ponúka Hielscher rôzne riešenia na splnenie rôznych požiadaviek potrebných pre konkrétne tkanivá a ich liečbu. Pre súčasné ultrazvukom mnohých vzoriek Hielscher ponúka UIP400MTP pre viacbunkové platne, VialTweeter na sonikáciu až 10 injekčných liekoviek (napr. Eppendorfove trubice) alebo ultrazvukový CupHorn. Ultrazvukové prístroje typu sondy sú k dispozícii od 50 do 400 wattov ako laboratórne homogenizátory, zatiaľ čo priemyselné systémy pokrývajú rozsah výkonu od 500 wattov do 16 kW.
Kontaktujte nás a dajte nám vedieť o vašej žiadosti a požiadavkách na proces. Náš skúsený personál vám rád odporučí najvhodnejší ultrasonicator pre váš biologický proces.
Nasledujúca tabuľka vám uvádza približnú spracovateľskú kapacitu našich ultrazvukov:

Objem šarže prietok Odporúčané Devices
multiwell / mikrotiterové platne neuv UIP400MTP (UIP400MTP)
až 10 injekčných liekoviek neuv VialTweeter
až 5 injekčných liekoviek/skúmaviek alebo 1 väčšia nádoba neuv CupHorn
1 až 500mL 10 až 200mL/min UP100H
10 až 2000mL 20 až 400mL/min UP200Ht, UP400St
0.1 až 20L 02 až 4 l / min UIP2000hdT
10 až 100L 2 až 10 l / min UIP4000hdT
neuv 10 až 100 l / min UIP16000
neuv väčšia strapec UIP16000

Kontaktuj nás! / Opýtajte sa nás!

Požiadajte o ďalšie informácie

Vyplňte formulár nižšie a požiadajte o ďalšie informácie o našich ultrazvukových prístrojoch, ich aplikáciách a cene. Radi s vami prediskutujeme váš proces a ponúkneme vám ultrazvukový systém spĺňajúci vaše požiadavky!









Vezmite prosím na vedomie naše Zásady ochrany osobných údajov,



Ultrazvukové high-shear homogenizers sa používajú v laboratóriu, bench-top, pilotné a priemyselné spracovanie.

Hielscher Ultrazvukom vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizátory pre miešanie aplikácií, disperzie, emulgácie a extrakcie na laboratórne, pilotné a priemyselné meradle.



Literatúra/referencie


Vysoko výkonné ultrazvukom! Hielscherov sortiment pokrýva celé spektrum od kompaktného laboratórneho ultrasonicatora cez bench-top jednotky až po plne priemyselné ultrazvukové systémy.

Hielscher Ultrasonics vyrába vysokovýkonné ultrazvukové homogenizers z laboratórium na priemyselnej veľkosti.