Улучшите анализ методом ВЭЖХ благодаря надёжной подготовке образцов
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, HPLC) остаётся одним из важнейших аналитических методов идентификации и количественного определения соединений в сложных матрицах. От контроля качества фармацевтической продукции до экологического мониторинга и анализа пищевых продуктов – методы ВЭЖХ ценятся за чувствительность, селективность и воспроизводимость. Однако надёжность хроматографических данных во многом зависит от одного ключевого этапа: подготовки образцов для ВЭЖХ.
Исследования и повседневная практика подготовки образцов показывают, что экстракция и подготовка образцов с применением обработки ультразвуком значительно повышают эффективность, точность и скорость анализа методом ВЭЖХ. Используя ультразвуковую энергию для разрушения матриц и усиления переноса аналитов в растворители, лаборатории могут добиться более высокой степени извлечения, сокращения времени экстракции и более воспроизводимых аналитических результатов.
Почему подготовка образцов важна для ВЭЖХ
Во многих аналитических процессах матрица образца – например, растительный материал, биологическая ткань, почва или вода – содержит сложные смеси соединений, которые могут мешать хроматографическому разделению. Поэтому перед введением образца в систему ВЭЖХ необходима эффективная подготовка образцов для выделения аналитов, удаления мешающих веществ и концентрирования целевых соединений.
Традиционные методы экстракции часто предусматривают длительные процедуры, большие объёмы органических растворителей и несколько этапов очистки. Эти методы могут вносить вариабельность, повышать эксплуатационные затраты и увеличивать общее время анализа.
Ультразвуковая подготовка образцов представляет собой эффективную альтернативу. При обработке ультразвуком в жидкую среду вводится высокочастотная акустическая энергия, образующая микроскопические кавитационные пузырьки. При схлопывании этих пузырьков возникают локальные силы сдвига и эффекты микроперемешивания, которые разрушают твёрдые матрицы и ускоряют массоперенос. Этот процесс резко повышает эффективность экстракции.
Высокопроизводительный ультразвуковой аппарат UIP400MTP со штативом для флаконов автосамплера
Научные доказательства: обработка ультразвуком улучшает аналитические характеристики
Несколько рецензируемых исследований продемонстрировали преимущества ультразвуковой экстракции в процессах анализа методом ВЭЖХ.
Например, в методе, разработанном для мониторинга остатков пестицидов в образцах воды, обработку ультразвуком в сочетании с анализом LC–MS/MS использовали для определения концентрации пестицида карбарила. В рамках этого подхода образцы воды перед хроматографическим анализом экстрагировали ацетонитрилом при обработке ультразвуком. Метод обеспечил высокие аналитические характеристики, включая степень извлечения от 89,53% до 101,72%, что подтвердило точность и надёжность процедуры ультразвуковой подготовки образцов.
Этап ультразвуковой экстракции обеспечил эффективный перенос аналитов из водной матрицы в органический растворитель, сократив расход растворителя и устранив необходимость в многоэтапных процедурах очистки. Валидированный аналитический метод продемонстрировал отличную линейность, прецизионность и пределы количественного определения, что подчёркивает эффективность обработки ультразвуком в современных хроматографических процессах. (см. Roudani et al., 2018)
В другом исследовании была предложена дисперсия матрицы в твёрдой фазе с применением ультразвука (UA-MSPD) для определения олеуропеина в листьях оливы методом ВЭЖХ. В этом методе растительный порошок смешивали с сорбентом, а затем подвергали воздействию ультразвуковых волн на этапе элюирования. Ультразвук усиливал десорбцию аналита с поверхности сорбента, одновременно улучшая экстракцию из матрицы образца. (см. Rashidipour and Heydari, 2018)
Оптимизированная ультразвуковая процедура обеспечила значительное улучшение аналитических характеристик, включая:
- Линейные калибровочные кривые с R² = 0,9979
- Пределы обнаружения всего 0,03 µg mL⁻¹
- Степень извлечения от 90,2% до 96,7%
Эти результаты подтверждают, что экстракция с применением ультразвука не только ускоряет подготовку образцов, но и повышает выход экстракции по сравнению с классическими методами дисперсии матрицы в твёрдой фазе.
Ультразвуковой аппарат зондового типа UP200St для подготовки образцов для ВЭЖХ
Основные преимущества ультразвуковой подготовки образцов для ВЭЖХ
Всё более широкое применение ультразвуковой экстракции в аналитических лабораториях обусловлено несколькими измеримыми преимуществами.
- Более высокая эффективность экстракции
Акустическая кавитация разрушает твёрдые матрицы и улучшает проникновение растворителя. Это усиливает высвобождение аналитов и повышает степень извлечения, особенно для соединений, присутствующих в следовых количествах в сложных образцах. - Сокращение времени подготовки образцов
Ультразвуковая экстракция часто позволяет завершить подготовку образцов за секунды или минуты. Например, оптимизированные параметры ультразвуковой экстракции в UA-MSPD обеспечили эффективное извлечение аналита примерно за 30 секунд обработки ультразвуком, демонстрируя, насколько значительно можно ускорить аналитические процессы. - Снижение расхода растворителя
Поскольку ультразвук усиливает массоперенос, обычно требуются меньшие объёмы растворителя. Сокращение использования растворителей повышает экологическую устойчивость лаборатории и снижает эксплуатационные затраты. - Улучшение воспроизводимости
Равномерное распределение ультразвуковой энергии обеспечивает одинаковое разрушение образцов и экстракцию в повторностях, что повышает прецизионность аналитических измерений. - Совместимость с современными хроматографическими методами
Ультразвуковая экстракция легко интегрируется с системами HPLC, UHPLC и LC-MS, что делает её подходящей для высокопроизводительных аналитических процессов.
Хроматограмма ВЭЖХ фенольных соединений из экстракта листьев Annona muricata, полученного методом ультразвуковой экстракции с использованием ультразвукового аппарата UP400S.
(Исследование и графическое изображение: ©Nolasco-González et al., 2022)
Практические решения для подготовки образцов для ВЭЖХ с применением обработки ультразвуком
Для лабораторий, внедряющих ультразвуковую экстракцию, ультразвуковые аппараты Hielscher обеспечивают точный контроль таких параметров, как амплитуда, время и импульсный режим. Поэтому лабораторные ультразвуковые аппараты Hielscher особенно подходят для аналитических лабораторий.
Выберите наиболее подходящий лабораторный ультразвуковой аппарат для ваших образцов для ВЭЖХ
| Модель ультразвукового аппарата | Преимущества для ВЭЖХ | Наиболее подходящее применение при подготовке образцов для ВЭЖХ |
| Ультразвуковой аппарат VialTweeter для нескольких пробирок |
• Одновременная обработка ультразвуком до 10 герметично закрытых флаконов с одинаковой ультразвуковой энергией • Стерильность: отсутствие перекрёстного загрязнения, поскольку образцы остаются закрытыми • Высокая воспроизводимость условий экстракции от партии к партии • Эффективная кавитация для аналитических образцов малого объёма |
• Высокопроизводительная подготовка экологических, пищевых или фармацевтических образцов • Экстракция следовых количеств аналитов перед анализом методами HPLC, UHPLC или LC-MS • Стандартизированные рабочие процессы, требующие одинаковой обработки нескольких образцов |
| Ультразвуковой аппарат UIP400MTP для микропланшетов |
• Бесконтактная обработка ультразвуком целых микропланшетов (96-луночные и 384-луночные форматы) • Равномерное распределение ультразвуковой энергии по всем лункам • Обеспечивает автоматизацию и интеграцию с роботизированными системами для аналитических процессов • Высокая производительность с точным контролем амплитуды и времени обработки ультразвуком |
• Высокопроизводительные процессы скрининга методом UHPLC • Библиотеки фармацевтических соединений и подготовка образцов для метаболомики • Экстракция в планшетах для аналитических процессов LC-MS или UHPLC |
| Лабораторные ультразвуковые аппараты с микронаконечником (прямая обработка ультразвуком) |
• Максимальная интенсивность ультразвука для эффективного разрушения матрицы • Очень быстрая экстракция аналитов из твёрдых, вязких или неоднородных образцов • Регулируемые амплитуда и параметры импульсов для оптимизации условий экстракции • Высокая энергия кавитации повышает степень извлечения аналитов и выход экстракции |
• Экстракция из сложных матриц, таких как растительные ткани, пищевые образцы или полимеры • Гомогенизация перед твердофазной экстракцией (SPE), фильтрацией или экстракцией жидкость–жидкость • Разработка методов ультразвуковой подготовки образцов для ВЭЖХ |
| CupHorn («высокоинтенсивная ванна» для лабораторных стаканов и пробирок) |
• Непрямая обработка ультразвуком предотвращает загрязнение зонда • Равномерное ультразвуковое поле для нескольких пробирок одновременно • Идеально подходит для стерильных, опасных или летучих образцов, которые должны оставаться герметично закрытыми • Упрощает работу с образцами при сохранении высокой энергии кавитации |
• Параллельная экстракция нескольких образцов для ВЭЖХ в герметично закрытых центрифужных пробирках • Подготовка биологических, фармацевтических или экологических образцов • Рабочие процессы, требующие непрямой обработки ультразвуком без загрязнения |
Научная значимость для аналитической химии
По мере перехода аналитической химии к более быстрым и экологически устойчивым лабораторным практикам ультразвуковая подготовка образцов стала мощной технологией, открывающей новые возможности. Обработка ультразвуком способствует разработке быстрых аналитических методов с меньшим расходом растворителя, повышенной эффективностью экстракции и надёжными валидационными характеристиками.
Растущий объём литературы по ультразвуковой экстракции показывает, что подготовка образцов для ВЭЖХ с применением обработки ультразвуком представляет собой не просто удобство – это научно подтверждённый подход, улучшающий аналитические характеристики. Сочетая ультразвуковую экстракцию с современными хроматографическими методами, лаборатории могут добиваться надёжного обнаружения следовых количеств аналитов во всё более сложных матрицах образцов.
Процессы ВЭЖХ, улучшенные благодаря обработке ультразвуком
Благодаря постоянному совершенствованию аналитического оборудования и технологий подготовки образцов ультразвуковая экстракция, вероятно, будет играть ещё более значительную роль в хроматографических лабораториях. Её способность упрощать рабочие процессы, улучшать качество данных и снижать воздействие на окружающую среду хорошо соответствует меняющимся требованиям современной аналитической науки.
Для химиков-аналитиков и промышленных лабораторий, стремящихся оптимизировать подготовку образцов для ВЭЖХ, ультразвуковая экстракция представляет собой проверенное, масштабируемое и научно обоснованное решение. Внедряя обработку ультразвуком в стандартные протоколы подготовки образцов, лаборатории могут значительно повысить как эффективность, так и надёжность хроматографического анализа.
Проектирование, производство и консультирование – качество из Германии
Ультразвуковые аппараты Hielscher известны высочайшими стандартами качества и проектирования. Прочность и простота эксплуатации позволяют без затруднений интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с работой в тяжёлых условиях и сложной производственной среде.
Hielscher Ultrasonics – компания, сертифицированная по ISO, которая уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, сочетающим самые современные технологии и удобство использования. Разумеется, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и отвечают требованиям UL, CSA и RoHs.
Литература / Ссылки
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Часто задаваемые вопросы
Что такое ВЭЖХ?
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, HPLC) – это аналитический метод разделения, используемый для идентификации, количественного определения и очистки компонентов смеси. В ВЭЖХ жидкая подвижная фаза переносит растворённые аналиты под высоким давлением через колонку, заполненную неподвижной фазой. Различия во взаимодействиях между аналитами, неподвижной фазой и подвижной фазой приводят к разделению соединений по мере их прохождения через колонку. Детекторы, например УФ-видимые, флуоресцентные или масс-спектрометрические, измеряют разделённые соединения, обеспечивая точный качественный и количественный анализ.
Какие существуют виды жидкостной хроматографии?
Жидкостную хроматографию можно классифицировать по механизму разделения, основанному на взаимодействиях между аналитом, неподвижной фазой и подвижной фазой. Наиболее распространённые виды – обращённо-фазовая хроматография, в которой неполярная неподвижная фаза разделяет соединения на основе гидрофобных взаимодействий; нормально-фазовая хроматография, в которой используется полярная неподвижная фаза и соединения разделяются по полярности; ионообменная хроматография, в которой заряженные неподвижные фазы разделяют аналиты на основе ионных взаимодействий; и эксклюзионная хроматография, которая разделяет молекулы по их гидродинамическому размеру и молекулярной массе. К дополнительным специализированным методам относятся аффинная хроматография и хроматография гидрофильных взаимодействий (HILIC), ориентированные на специфические молекулярные взаимодействия или полярные соединения.
Какие флаконы используются для ВЭЖХ?
Для анализа методом ВЭЖХ обычно используют небольшие стеклянные или полимерные флаконы, предназначенные для хранения подготовленных образцов перед введением в хроматографическую систему. Наиболее распространённый формат – флакон автосамплера объёмом 2 mL, совместимый с большинством автосамплеров ВЭЖХ. Эти флаконы обычно изготавливают из боросиликатного стекла, чтобы обеспечить химическую стойкость и минимальное взаимодействие с растворителями и аналитами. В зависимости от типа образца флаконы могут оснащаться вставками для образцов малого объёма, винтовыми или обжимными крышками, а также септами из таких материалов, как ПТФЭ/силикон, для сохранения целостности образца.
Что такое флаконы автосамплера?
Флаконы автосамплера – это специализированные ёмкости для образцов, предназначенные для автоматизированных систем введения в приборах HPLC и UHPLC. Они содержат подготовленный раствор образца и устанавливаются в лоток автосамплера прибора, где система автоматически отбирает заданный объём для введения в хроматографическую колонку. Флаконы автосамплера изготавливают с точными размерами, чтобы обеспечить совместимость с роботизированными иглами для отбора проб и свести к минимуму испарение, загрязнение или адсорбцию образца. Их конструкция обеспечивает воспроизводимый высокопроизводительный анализ в современных хроматографических лабораториях.
Какие этапы включает ВЭЖХ?
Типичный рабочий процесс высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, HPLC) состоит из нескольких последовательных этапов, обеспечивающих надёжное разделение и обнаружение аналитов.
- Сначала выполняют подготовку образца, чтобы растворить аналит, удалить частицы и зачастую извлечь или сконцентрировать целевые соединения из матрицы образца. Этот этап может включать фильтрацию, разбавление или такие методы экстракции, как ультразвуковая экстракция, твердофазная экстракция или экстракция жидкость–жидкость.
- Затем подготовленный образец помещают во флакон для ВЭЖХ и загружают в автосамплер. Автосамплер вводит точный объём образца в поток подвижной фазы.
- Далее на этапе подачи подвижной фазы введённый образец перемещается по системе с помощью насоса высокого давления. Подвижная фаза переносит аналиты через хроматографическую колонку при контролируемом расходе.
- Внутри хроматографической колонки происходит разделение. Колонка содержит неподвижную фазу, обычно в виде упакованных частиц с определёнными химическими свойствами. По мере прохождения через колонку аналиты по-разному взаимодействуют с неподвижной и подвижной фазами, в результате чего элюируются в разное время.
- После разделения соединения проходят через детектор, например УФ-видимый, флуоресцентный или масс-спектрометрический. Детектор измеряет наличие и концентрацию элюируемых соединений и преобразует сигнал в электронные данные.
- Наконец, выполняют сбор и анализ данных с помощью программного обеспечения для хроматографии. Система формирует хроматограмму, на которой пики соответствуют отдельным соединениям. Времена удерживания пиков помогают идентифицировать аналиты, а площади или высоты пиков позволяют количественно определить их концентрацию.
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лабораторных до промышленных размеров.