Повышение качества ВЭЖХ-анализа за счет надежной пробоподготовки
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) остается одним из важнейших аналитических методов для идентификации и количественного определения соединений в сложных матрицах. Методы ВЭЖХ ценятся за их чувствительность, селективность и воспроизводимость - от контроля качества фармацевтической продукции до мониторинга окружающей среды и анализа продуктов питания. Однако достоверность хроматографических данных в значительной степени зависит от одного важнейшего этапа: пробоподготовки ВЭЖХ.
Исследования и практика подготовки проб показывают, что экстракция и пробоподготовка с помощью соникации значительно повышают эффективность, точность и скорость ВЭЖХ-анализа. Используя ультразвуковую энергию для разрушения матриц и улучшения переноса аналитов в растворители, лаборатории могут получить более высокие коэффициенты извлечения, сократить время экстракции и получить более воспроизводимые результаты анализа.
Почему пробоподготовка имеет значение в ВЭЖХ
Во многих аналитических процессах матрица образца – например, растительный материал, биологическая ткань, почва или вода – содержит сложные смеси соединений, которые могут мешать хроматографическому разделению. Поэтому требуется эффективная пробоподготовка для выделения аналитов, удаления мешающих веществ и концентрирования целевых соединений перед введением в систему ВЭЖХ.
Традиционные методы экстракции часто включают в себя длительные процедуры, большие объемы органических растворителей и множество этапов очистки. Эти методы могут вносить вариабельность, увеличивать эксплуатационные расходы и увеличивать общее время анализа.
Ультразвуковая пробоподготовка - эффективная альтернатива. При ультразвуковой обработке в жидкую среду подается высокочастотная акустическая энергия, в результате чего образуются микроскопические кавитационные пузырьки. Когда эти пузырьки схлопываются, они генерируют локальные сдвиговые силы и эффекты микроперемешивания, которые разрушают твердые матрицы и ускоряют массоперенос. Этот процесс значительно повышает эффективность экстракции.
UIP400MTP высокопроизводительный ультразвуковой аппарат со стойкой для пробирок для флаконов автосамплера
Научные данные: Запекание улучшает аналитические показатели
Несколько рецензируемых исследований продемонстрировали преимущества ультразвуковой экстракции в рабочих процессах ВЭЖХ.
Например, в методе, разработанном для мониторинга остаточных количеств пестицидов в образцах воды, для определения концентрации пестицида карбарила использовалась соникация в сочетании с ЖХ-МС/МС анализом. В этом методе образцы воды перед хроматографическим анализом экстрагировались ацетонитрилом при ультразвуковой обработке. Метод показал высокие аналитические результаты, включая извлечение от 89,53% до 101,72%, что подтверждает точность и надежность процедуры ультразвуковой пробоподготовки.
Ультразвуковая экстракция позволяет эффективно переносить аналиты из водной матрицы в органический растворитель, сокращая расход растворителя и устраняя необходимость в обширных процедурах очистки. Валидированный аналитический метод продемонстрировал отличную линейность, точность и пределы количественного определения, что подчеркивает эффективность соникации в современных хроматографических рабочих процессах. (см. Roudani et al., 2018)
В другом исследовании для определения олеуропеина в листьях оливы методом ВЭЖХ была применена матричная твердофазная дисперсия с ультразвуковым воздействием (UA-MSPD). В этой методике растительный порошок и сорбент смешивались, а затем подвергались воздействию ультразвуковых волн во время этапа элюирования. Ультразвук усиливал десорбцию аналита с поверхности сорбента и одновременно улучшал экстракцию из матрицы образца. (см. Rashidipour and Heydari, 2018)
Оптимизированная ультразвуковая процедура позволила добиться значительных аналитических улучшений, в том числе:
- Линейные калибровочные кривые с R² = 0,9979
- Пределы обнаружения не более 0,03 мкг мл-¹
- Показатели восстановления от 90,2% до 96,7%
Эти результаты подтверждают, что экстракция с помощью ультразвука не только ускоряет подготовку образцов, но и повышает эффективность экстракции по сравнению с классическими методами твердофазного диспергирования матриц.
Ультразвуковая аппарат зондового типа УП200Ст для пробоподготовки ВЭЖХ
Основные преимущества ультразвуковой пробоподготовки для ВЭЖХ
Растущее применение ультразвуковой экстракции в аналитических лабораториях обусловлено рядом ощутимых преимуществ.
- Повышенная эффективность извлечения
Акустическая кавитация разрушает твердые матрицы и улучшает проникновение растворителя. Это улучшает высвобождение аналитов и повышает скорость извлечения, особенно для следовых соединений в сложных образцах. - Сокращение времени подготовки образцов
Ультразвуковая экстракция часто позволяет завершить пробоподготовку в течение нескольких секунд или минут. Например, оптимизированные параметры ультразвуковой экстракции в UA-MSPD позволили добиться эффективного извлечения аналитов примерно за 30 секунд соникации, продемонстрировав, насколько значительно можно ускорить рабочие процессы анализа. - Низкий расход растворителей
Поскольку ультразвук усиливает массоперенос, обычно требуется меньший объем растворителя. Сокращение использования растворителей повышает устойчивость лаборатории и снижает эксплуатационные расходы. - Улучшенная воспроизводимость
Равномерное распределение ультразвуковой энергии обеспечивает постоянное разрушение и извлечение образца в разных копиях, что приводит к повышению точности аналитических измерений. - Совместимость с современными хроматографическими методами
Ультразвуковая экстракция легко интегрируется с системами ВЭЖХ, УВЭЖХ и ЖХ-МС, что делает ее подходящей для аналитических сред с высокой пропускной способностью.
ВЭЖХ-хроматограмма фенольных соединений из ультразвуково выделенного экстракта листьев Annona muricata с помощью ультразвукового аппарата UP400S.
(Исследование и график: ©Ноласко-Гонсалес и др., 2022)
Практические решения для соникации при подготовке проб для ВЭЖХ
В лабораториях, где применяется ультразвуковая экстракция, соникаторы Hielscher обеспечивают точный контроль над такими параметрами, как амплитуда, время и режим импульса. Поэтому лабораторные соникаторы Hielscher особенно подходят для аналитических лабораторий.
Выберите наиболее подходящий лабораторный звуковой излучатель для ВЭЖХ-проб
| Модель Sonicator | Преимущества для ВЭЖХ | Лучшее применение в подготовке проб для ВЭЖХ |
| VialTweeter Многоламповый ультразвуковой аппарат |
- Одновременное сонирование до 10 герметичных флаконов с одинаковой ультразвуковой энергией - Стерильно: перекрестное загрязнение исключено, так как образцы остаются закрытыми - Высокая воспроизводимость условий экстракции в разных партиях - Эффективная кавитация для аналитических образцов малого объема |
- Высокопроизводительная подготовка образцов окружающей среды, пищевых продуктов или фармацевтических препаратов - Извлечение следовых аналитов перед ВЭЖХ, УВЭЖХ или ЖХ-МС анализом - Стандартизированные рабочие процессы, требующие идентичной обработки нескольких образцов |
| Ультразвуковой аппарат для микропланшетов UIP400MTP |
- Бесконтактное озвучивание целых микропланшетов (форматы 96 и 384 лунок) - Равномерное распределение ультразвуковой энергии по всем скважинам - Обеспечивает автоматизацию и роботизированную интеграцию аналитических рабочих процессов - Высокая производительность с точным контролем амплитуды и времени соникации |
- Высокопроизводительные рабочие процессы UHPLC-скрининга - Библиотеки фармацевтических соединений и подготовка образцов для метаболомики - Экстракция на основе пластин для аналитических конвейеров ЖХ-МС или УВЭЖХ |
| Лабораторные соникаторы с микронаконечником (прямое сонирование) |
- Максимальная интенсивность ультразвука для эффективного разрушения матрицы - Очень быстрое извлечение аналитов из твердых, вязких или неоднородных образцов - Регулируемые параметры амплитуды и импульса для оптимизации условий экстракции - Высокая энергия кавитации улучшает извлечение аналитов и производительность экстракции |
- Извлечение из сложных матриц, таких как растительные ткани, пищевые образцы или полимеры - Гомогенизация перед SPE, фильтрацией или жидкостно-жидкостной экстракцией - Разработка метода ультразвуковой ВЭЖХ пробоподготовки |
| горн (“высокоинтенсивная ванна” для стаканов и пробирок) |
- Непрямое сонирование предотвращает загрязнение зонда - Равномерное ультразвуковое поле для нескольких трубок одновременно - Идеально подходит для стерильных, опасных или летучих образцов, которые должны оставаться герметичными - Упрощает управление, сохраняя сильную кавитационную энергию |
- Параллельное извлечение нескольких образцов ВЭЖХ в запаянные центрифужные пробирки - Подготовка биологических, фармацевтических или экологических образцов - Рабочие процессы, в которых требуется непрямое сонирование без загрязнений |
Научное значение для аналитической химии
По мере того как аналитическая химия переходит к более быстрым и устойчивым лабораторным методам, ультразвуковая пробоподготовка становится мощной технологией. Ультразвуковая обработка позволяет разрабатывать быстрые аналитические методы с меньшим расходом растворителей, повышенной эффективностью экстракции и надежными параметрами валидации.
Растущий объем литературы по ультразвуковой экстракции показывает, что пробоподготовка в ВЭЖХ с помощью ультразвука - это не просто удобство. – Это научно обоснованный подход, который повышает эффективность анализа. Сочетая ультразвуковую экстракцию с современными хроматографическими методами, лаборатории могут добиться надежного обнаружения следовых аналитов во все более сложных матрицах образцов.
Рабочие процессы ВЭЖХ с усиленным сонированием
С постоянным развитием аналитического оборудования и технологий пробоподготовки ультразвуковая экстракция, вероятно, будет играть еще большую роль в хроматографических лабораториях. Ее способность оптимизировать рабочие процессы, улучшать качество данных и снижать воздействие на окружающую среду вполне соответствует меняющимся требованиям современной аналитической науки.
Для химиков-аналитиков и промышленных лабораторий, стремящихся оптимизировать подготовку проб для ВЭЖХ, ультразвуковая экстракция - проверенное, масштабируемое и научно обоснованное решение. Интегрировав ультразвуковую экстракцию в рутинные протоколы пробоподготовки, лаборатории могут значительно повысить эффективность и надежность хроматографического анализа.
Проектирование, производство и консалтинг – Качество «Сделано в Германии»
Ультразвуковые аппараты Hielscher хорошо известны своими высочайшими стандартами качества и дизайна. Надежность и простота в эксплуатации позволяют без проблем интегрировать наши ультразвуковые аппараты в промышленные объекты. Ультразвуковые аппараты Hielscher легко справляются с суровыми условиями и требовательными условиями окружающей среды.
Hielscher Ultrasonics является компанией, сертифицированной по стандарту ISO, и уделяет особое внимание высокопроизводительным ультразвуковым аппаратам, отличающимся самыми современными технологиями и удобством в использовании. Конечно, ультразвуковые аппараты Hielscher соответствуют требованиям CE и соответствуют требованиям UL, CSA и RoHs.
Литература / Литература
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Часто задаваемые вопросы
Что такое ВЭЖХ?
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - это аналитический метод разделения, используемый для идентификации, количественного определения и очистки компонентов в смеси. В ВЭЖХ жидкая подвижная фаза переносит растворенные аналиты через колонку, заполненную неподвижной фазой, под высоким давлением. Различия во взаимодействии между аналитами, неподвижной фазой и подвижной фазой приводят к разделению соединений при прохождении через колонку. Детекторы, такие как УФ-Вис, флуоресцентный или масс-спектрометрический, измеряют разделенные соединения, обеспечивая точный качественный и количественный анализ.
Какие существуют типы жидкостной хроматографии?
Жидкостную хроматографию можно классифицировать в зависимости от механизма разделения аналита, неподвижной и подвижной фаз. Наиболее распространенными типами являются обращенно-фазовая хроматография, в которой неполярная стационарная фаза разделяет соединения на основе гидрофобных взаимодействий; нормально-фазовая хроматография, в которой используется полярная стационарная фаза и соединения разделяются в зависимости от полярности; ионообменная хроматография, в которой заряженные стационарные фазы разделяют аналиты на основе ионных взаимодействий; и размерно-эксклюзионная хроматография, которая разделяет молекулы в зависимости от их гидродинамического размера и молекулярной массы. Дополнительные специализированные методы включают аффинную хроматографию и хроматографию гидрофильного взаимодействия (HILIC), которые направлены на специфические молекулярные взаимодействия или полярные соединения.
Какие флаконы используются для ВЭЖХ?
Для ВЭЖХ-анализа обычно используются небольшие стеклянные или полимерные флаконы, предназначенные для хранения подготовленных образцов перед введением в хроматографическую систему. Наиболее распространенным форматом является 2-мл пробирка для автосамплера, совместимая с большинством автосамплеров для ВЭЖХ. Эти флаконы обычно изготавливаются из боросиликатного стекла для обеспечения химической стойкости и минимального взаимодействия с растворителями и аналитами. В зависимости от типа образца флаконы могут иметь вставки для малых объемов проб, завинчивающиеся или обжимные крышки, а также септы из таких материалов, как тефлон/силикон, для сохранения целостности образца.
Что такое флаконы для автодозатора?
Флаконы для автосамплера - это специализированные контейнеры для проб, предназначенные для систем автоматического впрыска в приборы ВЭЖХ и УВЭЖХ. Они содержат подготовленный раствор пробы и помещаются в лоток автодозатора прибора, откуда система автоматически отбирает определенный объем для введения в хроматографическую колонку. Флаконы для автосамплера имеют точные размеры, обеспечивающие совместимость с роботизированными пробоотборными иглами и минимизирующие испарение, загрязнение или адсорбцию образца. Их конструкция позволяет проводить воспроизводимые высокопроизводительные анализы в современных хроматографических лабораториях.
Каковы этапы ВЭЖХ?
Типичный рабочий процесс высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) состоит из нескольких последовательных этапов, которые обеспечивают надежное разделение и обнаружение аналитов.
- Сначала проводится пробоподготовка, чтобы растворить аналит, удалить твердые частицы и часто извлечь или сконцентрировать целевые соединения из матрицы образца. Этот этап может включать фильтрацию, разбавление или методы экстракции, такие как ультразвуковая экстракция, твердофазная экстракция или экстракция жидкость-жидкость.
- Затем подготовленный образец помещается в пробирку для ВЭЖХ и загружается в автодозатор. Автодозатор вводит точный объем образца в текущую подвижную фазу.
- На этапе подачи подвижной фазы инжектируемый образец проходит через систему с помощью насоса высокого давления. Подвижная фаза переносит аналиты через хроматографическую колонку с контролируемой скоростью потока.
- Внутри хроматографической колонки происходит разделение. Колонка содержит стационарную фазу, обычно упакованные частицы с определенными химическими свойствами. Когда аналиты проходят через колонку, они по-разному взаимодействуют со стационарной и подвижной фазой, в результате чего элюируются в разное время.
- После разделения соединения проходят через детектор, например, УФ-Вид, флуоресцентный или масс-спектрометрический детектор. Детектор измеряет наличие и концентрацию элюирующих соединений и преобразует сигнал в электронные данные.
- Наконец, сбор и анализ данных осуществляется с помощью программного обеспечения для хроматографии. Система генерирует хроматограмму, на которой пики соответствуют отдельным соединениям. Время удерживания пиков позволяет идентифицировать аналиты, а площадь или высота пиков - количественно определить их концентрацию.
Hielscher Ultrasonics производит высокопроизводительные ультразвуковые гомогенизаторы от лаборатория Кому промышленного размера.