Генетическая трансформация растительных клеток с помощью ультразвука

Трансформация, опосредованная Agrobacterium и поддерживаемая обработкой ультразвуком (SAAT), – эффективный метод инфицирования растительных клеток чужеродными генами с использованием Agrobacterium в качестве переносчика. Ультразвуковая кавитация вызывает сонопорацию, которую можно описать как целенаправленное нанесение микроповреждений растительной ткани. Через эти микроповреждения, созданные ультразвуком, ДНК и ДНК-векторы могут эффективно переноситься в клеточный матрикс.

Сонопорация – трансформация клеток, усиленная ультразвуком

При воздействии низкочастотного ультразвука (прибл. 20kHz) на клеточные суспензии эффекты акустической кавитации вызывают временное повышение проницаемости мембран клеток тканей. Этот ультразвуковой эффект известен как сонопорация и используется для переноса генов в клетки или ткани.
Преимущества обработки ультразвуком основаны на её нетепловом механическом принципе действия, благодаря которому она часто оказывается более универсальной и менее зависимой от типов клеток. Разнообразные применения сонопорации открывают возможность использования трансгенных растений, обладающих значительным потенциалом для биопроизводства сложных терапевтических белков человека. Такие биореакторы на основе растений легко поддаются генетическим манипуляциям, предотвращают возможную контаминацию патогенами человека, не повреждают бактерии, опосредующие трансформацию (например, Agrobacterium), и представляют собой недорогой и эффективный метод биосинтеза.

Трансформация клеток с помощью ультразвука

Обработка ультразвуком – метод, при котором низкочастотные ультразвуковые волны используются для приведения частиц в растворе в движение и смешивания растворов, что увеличивает скорость массопереноса и растворения. Одновременно обработка ультразвуком может удалять растворённые газы из жидкостей. При трансформации растений обработка ультразвуком вызывает образование микроповреждений растительной ткани и усиливает доставку свободной ДНК в растительный протопласт.

Для генетической трансформации предпочтительным методом является трансформация, опосредованная Agrobacterium и поддерживаемая обработкой ультразвуком (SAAT); её эффективность значительно выше, чем у обработки ультразвуком, используемой для переноса свободной ДНК и ДНК-векторов непосредственно в протопласт. Многочисленные исследования показали, что трансформацию, опосредованную Agrobacterium и поддерживаемую обработкой ультразвуком (SAAT), можно использовать для механического разрушения и образования повреждений растительных клеток посредством ультразвуковых волн и возникающей акустической кавитации. Кратковременная обработка ультразвуком создаёт микроповреждения на поверхности эксплантов. Повреждённые клетки позволяют Agrobacterium проникать в более глубокие участки растительных тканей, тем самым повышая вероятность инфицирования растительных клеток. Кроме того, выделяемые фенольные соединения усиливают трансформацию. Микроповреждения, создаваемые ультразвуком, также облегчают проникновение бактерий в экспланты. SAAT успешно применялась для генетической трансформации видов растений, считающихся особенно устойчивыми к Agrobacterium.
Основные преимущества SAAT – простота и низкая стоимость метода, а также значительное усиление переноса генов, опосредованного Agrobacterium. Помимо успешного применения SAAT для трансформации Chenopodium rubrum L. и Beta vulgaris L., этот подход также использовался для получения рекомбинантного термолабильного холотоксина Escherichia coli дикого типа и вакцинных адъювантов на основе мутантного LT Escherichia coli в Nicotiana tabacum, при этом у птиц были обнаружены самые высокие системные титры LT-B-специфических IgG.
(см. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Общая процедура переноса генов в растительные клетки посредством сонопорации

1. Подготовка генетического материала: Начните с подготовки генетического материала, который вы хотите ввести в растительные клетки. Это может быть плазмидная ДНК, РНК или другие нуклеиновые кислоты.
2. Выделение растительных клеток: Выделите растительные клетки, на которые вы хотите воздействовать. В зависимости от вашего эксперимента эти клетки могут быть выделены из растительных тканей или культур.
3. Клеточная суспензия: Суспендируйте растительные клетки в подходящей среде или буферном растворе. Это необходимо для поддержания клеток в здоровом состоянии, благоприятном для поглощения генов.
4. Настройка ультразвукового аппарата: Подготовьте ультразвуковой аппарат зондового типа, предварительно задав такие параметры обработки ультразвуком, как амплитуда, время, энергия и температура. Погрузите ультразвуковой зонд в клеточную суспензию.
5. Обработка ультразвуком: Начните процедуру обработки ультразвуком. Быстрые колебания наконечника зонда создают в жидкости кавитационные пузырьки. Под действием ультразвуковых волн эти пузырьки расширяются и схлопываются, создавая механические силы и микропотоки в суспензии.
6. Сонопорация: Механические силы и микропотоки, создаваемые кавитацией, формируют временные поры и отверстия в мембранах растительных клеток. Генетический материал, присутствующий в суспензии, может проникать в растительные клетки через эти поры.
7. Инкубация: После сонопорации инкубируйте растительные клетки, чтобы дать им возможность восстановиться и стабилизировать мембраны. Это важнейший этап для обеспечения выживания клеток и успешного переноса генов.

Перенос генов с помощью Agrobacterium или липосом

Существуют два распространённых способа трансфекции растительных клеток. В качестве переносчика генетического материала в них используются либо Agrobacterium – род грамотрицательных бактерий, либо липосомы.

• Сонопорация, опосредованная Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens – бактерия, широко используемая в генетической инженерии растений. В этом методе плазмидную ДНК, содержащую нужный ген, вводят в Agrobacterium, которую затем смешивают с растительными клетками. Клеточную суспензию подвергают сонопорации с помощью ультразвукового аппарата зондового типа. Ультразвуковая энергия усиливает перенос генетического материала из Agrobacterium в растительные клетки. Этот метод широко используется для генетической модификации растений.
• Сонопорация, опосредованная липосомами: Липосомы – везикулы на основе липидов, способные переносить генетический материал. В этом методе липосомы, содержащие плазмидную ДНК или другие нуклеиновые кислоты, смешивают с растительными клетками. Сонопорацию с помощью ультразвукового аппарата зондового типа применяют для облегчения поглощения липосом растительными клетками. Ультразвук разрушает липидные бислои липосом, высвобождая генетический материал в растительные клетки. Этот подход полезен для исследований транзиентной экспрессии генов в растительных клетках.

Научно доказанные преимущества трансформации, опосредованной Agrobacterium и поддерживаемой обработкой ультразвуком (SAAT)

Трансформация, опосредованная Agrobacterium и поддерживаемая обработкой ультразвуком (SAAT), применялась к многочисленным видам растений. Кратковременная и относительно мягкая обработка культур растительных клеток ультразвуком вызывает сонопорацию, которая впоследствии обеспечивает глубокое проникновение Agrobacterium как переносчика генов. Ниже вы можете ознакомиться с примерами исследований, демонстрирующих положительные эффекты SAAT.

Трансформация ашваганды с помощью ультразвука

Для повышения эффективности трансформации W. somnifera (известной как ашваганда или зимняя вишня) Dehdashti и коллеги (2016) исследовали применение ацетосирингона (AS) и обработки ультразвуком.
Ацетосирингон (AS) добавляли на трёх этапах: в жидкую культуру Agrobacterium, при инфицировании Agrobacterium и при совместном культивировании эксплантов с Agrobacterium. Было установлено, что добавление 75 μM AS в жидкую культуру Agrobacterium оптимально для индукции генов vir.
Дополнительное применение обработки ультразвуком (SAAT) обеспечило самую высокую экспрессию генов. Наилучшая экспрессия гена gusA в волосовидных корнях наблюдалась при обработке листьев и верхушек побегов ультразвуком в течение 10 и 20s соответственно. Эффективность трансформации по усовершенствованному протоколу составила 66,5 и 59,5% для эксплантов листьев и верхушек побегов соответственно. По сравнению с другими протоколами эффективность трансформации по этому усовершенствованному протоколу оказалась в 2,5 раза выше для листьев и в 3,7 раза выше для верхушек побегов. Саузерн-блот-анализ подтвердил наличие 1–2 копий трансгена gusA в линиях W1–W4, тогда как в линии W5, полученной по усовершенствованному протоколу, было обнаружено 1–4 копии трансгена.

Влияние продолжительности трансформации, опосредованной Agrobacterium и поддерживаемой обработкой ультразвуком (SAAT), на частоту трансформации эксплантов листьев (a) и верхушек побегов (b) W. somnifera
(исследование и график: © Dehdashti et al., 2016)

Трансформация хлопчатника с помощью ультразвука

Hussain et al. (2007) демонстрируют положительные эффекты трансформации хлопчатника с помощью ультразвука. Акустическая кавитация, вызываемая низкочастотным ультразвуком, создаёт микроповреждения на поверхности и под поверхностью растительной ткани (сонопорация) и позволяет Agrobacterium проникать глубже и распространяться по всей растительной ткани. Такой способ повреждения повышает вероятность инфицирования растительных клеток, расположенных глубже в ткани. Для оценки эффективности трансформации SAAT измеряли экспрессию гена GUS. Репортёрная система GUS – система репортёрного гена, особенно полезная в молекулярной биологии растений и микробиологии. Благодаря настройке различных параметров SAAT транзиентная экспрессия GUS в хлопчатнике при использовании зрелых зародышей в качестве эксплантов была значительно усилена. GUS впервые обнаруживали через 24h после инкубации эксплантов, а к 48h экспрессия GUS была очень интенсивной, что служило полезным показателем успешной трансформации экспланта хлопчатника после трансформации, опосредованной Agrobacterium и поддерживаемой обработкой ультразвуком (SAAT). При сравнении различных методов трансформации (а именно биолистического, Agro, BAAT, SAAT) трансформация, опосредованная Agrobacterium и поддерживаемая обработкой ультразвуком (SAAT), показала лучшие результаты трансформации с большим отрывом.

Выбор процедуры трансформации на основе транзиентной экспрессии GUS. Трансформация, опосредованная Agrobacterium и поддерживаемая обработкой ультразвуком (SAAT), демонстрирует значительно более высокую транзиентную экспрессию.
(исследование и график: © Hussain et al., 2007)

Высокопроизводительные ультразвуковые решения для сонопорации и SAAT

Hielscher Ultrasonics обладает многолетним опытом разработки и производства высокопроизводительных ультразвуковых аппаратов для лабораторий, исследовательских учреждений, а также промышленного производства с очень высокой производительностью. Для микробиологии и наук о жизни Hielscher предлагает различные решения, соответствующие разнообразным требованиям, обусловленным конкретными тканями и способами их обработки. Для одновременной обработки ультразвуком многочисленных образцов Hielscher предлагает UIP400MTP для многолуночных планшетов, VialTweeter для обработки ультразвуком до 10 флаконов (например, пробирок Eppendorf) или ультразвуковой CupHorn. Мощность ультразвуковых аппаратов зондового типа составляет от 50 до 400 ватт для лабораторных гомогенизаторов и от 500 ватт до 16kW для промышленных систем.
Свяжитесь с нами и расскажите о вашей области применения и требованиях к процессу. Наши опытные сотрудники будут рады порекомендовать наиболее подходящий ультразвуковой аппарат для вашего биологического процесса.
Таблица ниже даёт представление о приблизительной производительности наших ультразвуковых аппаратов: