Генетическая трансформация в клетках растений с помощью ультразвука

Ультразвуковая трансформация агробактерий (SAAT) является эффективным методом заражения клеток растений чужеродными генами с использованием агробактерий в качестве транспортера. Ультразвуковая кавитация вызывает сонопорацию, которую можно охарактеризовать как целенаправленное микроранирование растительной ткани. С помощью этих микроран, создаваемых ультразвуком, ДНК и векторы ДНК могут быть эффективно транспортированы в клеточный матрикс.

Сонопорация – Ультразвуковая трансформация клеток

При воздействии низкочастотного ультразвука (около 20 кГц) на клеточные суспензии эффекты акустической кавитации вызывают переходное проникновение мембраны в клеточные ткани. Этот ультразвуковой эффект известен как сонопорация и используется для переноса генов в клетки или ткани.
Преимущества ультразвуковой обработки основаны на ее нетермическом механическом принципе работы, что делает ультразвук более универсальным и менее зависимым от типов клеток. Универсальное применение сонопорации открывает возможность для утилизации трансгенных растений, обладающих значительным потенциалом в биопродукции сложных терапевтических белков человека. Такие биореакторы на растительной основе могут быть легко генетически модифицированы, предотвращают потенциальное заражение патогенами человека, не повреждают бактерии, опосредующие трансформацию (например, агробактерии), и являются недорогим и эффективным методом биосинтеза.

Ультразвуковая трансформация клеток

Ультразвуковая обработка – это метод, который применяет низкочастотные ультразвуковые волны для взбалтывания частиц в растворе, для смешивания растворов, тем самым увеличивая скорость массопереноса и растворения. В то же время ультразвуковая обработка может удалять растворенные газы из жидкостей. При трансформации растений ультразвук вызывает образование микроран на тканях растений и усиливает доставку обнаженной ДНК в растительный протопласт.

Для генетической трансформации предпочтительным методом является ультразвуковая агробактериальная трансформация (SAAT), которая имеет значительно более высокую эффективность, чем ультразвуковая обработка, используемая для переноса голой ДНК и векторов ДНК непосредственно в протопласт. Многочисленные исследования показали, что агробактериальная трансформация (SAAT) с помощью ультразвука может использоваться для индуцирования механических разрушений и образования ран на клетках растений под действием ультразвуковых волн и последующей акустической кавитации. При короткой ультразвуковой обработке на поверхности эксплантов образуются микрораны. Так как поврежденные клетки позволят агробактериям проникнуть в более глубокие части растительных тканей, тем самым увеличивая вероятность заражения растительных клеток. Кроме того, выделяемые фенольные соединения усиливают трансформацию. Микрораны, генерируемые ультразвуком, также делают проникновение бактерий в эксплант более возможным. SAAT был успешно использован для генетической трансформации у видов растений, особенно устойчивых к агробактериям.
Будучи очень простым и недорогим методом, а также значительное улучшение агробактериально-опосредованного переноса генов являются основными преимуществами SAAT. Помимо успешного применения SAAT в трансформации Chenopodium rubrum L. и Beta vulgaris L., этот подход также был применен при производстве рекомбинантных термолабильного голотоксина дикого типа Escherichia coli и адъювантов мутантной вакцины против Escherichia coli LT у Nicotiana tabacum, в которых у птиц были обнаружены самые высокие системные титры LT-B-специфичных IgG.
(ср. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Общая процедура переноса генов с помощью сонопорации в клетках растений

1. Подготовка генетического материала: Начните с подготовки генетического материала, который вы хотите ввести в клетки растения. Это может быть плазмидная ДНК, РНК или другие нуклеиновые кислоты.
2. Выделение растительных клеток: Изолируйте растительные клетки, на которые вы хотите нацелиться. В зависимости от вашего эксперимента эти клетки могут быть выделены из растительных тканей или культур.
3. Клеточная суспензия: Суспензируйте растительные клетки в подходящей среде или буфере. Это необходимо для того, чтобы клетки были здоровыми и находились в состоянии, способствующем усвоению генов.
4. Настройте ультразвуковой аппарат: Подготовьте ультразвуковой аппарат зондового типа, предварительно установив такие параметры, как амплитуда, время, энергия и температура. Погрузите ультразвуковой зонд в клеточную суспензию.
5. Ультразвуковая обработка: Начните процедуру ультразвуковой обработки. Быстрое колебание наконечника зонда приводит к образованию кавитационных пузырьков в жидкости. Эти пузырьки расширяются и схлопываются под действием ультразвуковых волн, создавая механические силы и микропотоки в суспензии.
6. Сонопорация: Механические силы и микропоток, создаваемые кавитацией, временно создают поры и отверстия в мембранах растительных клеток. Генетический материал, присутствующий в суспензии, может проникать в клетки растения через эти поры.
7. Инкубация: После процедуры сонопорации инкубируйте растительные клетки, чтобы они могли восстановиться и стабилизировать свои мембраны. Это важнейший шаг для обеспечения выживания клеток и успешного переноса генов.

Перенос генов через агробактерии или липосомы

Существуют две распространенные формы трансфекции растительных клеток. Они используют либо агробактерии, род грамотрицательных бактерий, либо липосомы в качестве переносчиков генетического материала.

• Агробактериальная сонопорация: Agrobacterium tumefaciens — бактерия, широко используемая в генной инженерии растений. При этом методе плазмидная ДНК, содержащая нужный ген, вводится в агробактерию, которая затем смешивается с растительными клетками. Клеточная суспензия подвергается сонопорации с помощью ультразвуковой аппарата зондового типа. Ультразвуковая энергия усиливает перенос генетического материала от агробактерий к клеткам растений. Этот метод широко используется для генетической модификации растений.
• Липосом-опосредованная сонопорация: Липосомы — это липидные везикулы, которые могут переносить генетический материал. При этом методе липосомы, загруженные плазмидной ДНК или другими нуклеиновыми кислотами, смешиваются с растительными клетками. Сонопорация с использованием ультразвукового аппарата зондового типа используется для облегчения поглощения липосом растительными клетками. Ультразвук разрушает липидные бислои липосом, высвобождая генетический материал в клетки растений. Этот подход полезен для исследований транзиторной экспрессии генов в растительных клетках.

Научно доказанные преимущества трансформации агробактерий (SAAT) с помощью ультразвуковой обработки

Ультразвуковая трансформация агробактерий (SAAT) была применена к многочисленным видам растений. Короткая и относительно щадящая ультразвуковая обработка растительных клеточных культур вызывает сонопорацию, которая впоследствии позволяет глубоко проникнуть в агробактерии в качестве переносчика генов. Ниже вы можете ознакомиться с примерами исследований, демонстрирующих благотворное влияние SAAT.

Ультразвуковая трансформация ашваганды

Чтобы повысить эффективность трансформации у W. somnifera (известной как ашваганда или зимняя вишня), Dehdashti и коллеги (2016) исследовали использование ацетосирингона (AS) и ультразвука.
Ацетосирингон (AS) добавляли в три этапа: жидкая культура агробактерий, инфекция агробактерий и совместное культивирование эксплантов с агробактериями. Добавление 75 мкМ AS в жидкую культуру агробактерий было признано оптимальным для индукции генов vir.
Дополнительное применение ультразвуковой обработки (SAAT) привело к высочайшей экспрессии генов. Было обнаружено, что экспрессия гена gusA в волосистых корнях была наилучшей при ультразвуковой обработке листьев и кончиков побегов в течение 10 и 20 секунд соответственно. Эффективность трансформации по усовершенствованному протоколу составила 66,5 и 59,5% в случае эксплантов листьев и верхушек побегов соответственно. По сравнению с другими протоколами, эффективность преобразования этого улучшенного протокола оказалась в 2,5 раза выше для листьев и в 3,7 раза больше для кончиков побегов. Анализ методом южного блоттинга подтвердил наличие 1–2 копий трансгена gusA в линиях W1–W4, в то время как в линии W5 по усовершенствованному протоколу было обнаружено 1–4 копии трансгена.

Влияние продолжительности ультразвуковой трансформации агробактерий (SAAT) на частоту трансформации эксплантов листьев (а) и верхушек побегов (б) W. somnifera
(исследование и график: © Dehdashti et al., 2016)

Ультразвуковая трансформация хлопка

Hussain et al. (2007) демонстрируют благотворное влияние трансформации хлопка с помощью ультразвука. Акустическая кавитация, вызванная низкочастотным ультразвуком, создает микрораны на поверхности растительной ткани и под ней (сонопорация) и позволяет агробактериям проникать глубже и полностью по всей растительной ткани. Такой способ нанесения ран увеличивает вероятность заражения растительных клеток, лежащих глубже в тканях. С целью оценки эффективности трансформации SAAT измеряли экспрессию гена GUS. Репортерная система GUS — это репортерная генная система, особенно полезная в молекулярной биологии растений и микробиологии. Регулируя различные параметры SAAT, экспрессия GUS transient в хлопке с использованием зрелых эмбрионов в качестве экспланта была значительно усилена. ГУС был впервые обнаружен через 24 часа после инкубации эксплантов, и через 48 часов экспрессия ГУС была очень интенсивной, что служило полезным индикатором успешной трансформации хлопкового экспланта после трансформации агробактерий (SAAT) с помощью ультразвука. Сравнение различных методов трансформации (а именно биолистической, Агро, БААТ, СААТ), ультразвуковой трансформации, опосредованной агробактериями (SAAT) показало наилучшие результаты трансформации.

Выбор процедуры преобразования на основе переходной экспрессии GUS. Агробактериально-опосредованная трансформация (SAAT) с помощью ультразвука демонстрирует значительно более высокую экспрессию переходных процессов.
(исследование и график: © Hussain et al., 2007)

Высокопроизводительные ультразвуковые решения для сонопорации и SAAT

Компания Hielscher Ultrasonics имеет многолетний опыт разработки и производства высокопроизводительных ультразвуковых аппаратов для лабораторий, исследовательских центров, а также промышленного производства с очень высокой пропускной способностью. Для микробиологии и медико-биологических наук Hielscher предлагает различные решения для удовлетворения различных требований, необходимых для конкретных тканей и их лечения. Для одновременного ультразвукового исследования многочисленных образцов Hielscher предлагает UIP400MTP для многолуночных планшетов, VialTweeter для ультразвука до 10 флаконов (например, пробирки Eppendorf) или ультразвуковой CupHorn. Ультразвуковые аппараты зондового типа выпускаются в качестве лабораторных гомогенизаторов мощностью от 50 до 400 Вт, в то время как промышленные системы охватывают диапазон мощности от 500 Вт до 16 кВт.
Пожалуйста, свяжитесь с нами и сообщите нам о вашей заявке и требованиях к процессу. Наш опытный персонал будет рад порекомендовать вам наиболее подходящий ультразвуковой аппарат для вашего биологического процесса.
В таблице ниже приведена примерная производительность обработки наших ультразвуковых аппаратов: