Ультразвуковая агробактерия-опосредованная трансформация (SAAT) является эффективным методом заражения растительных клеток чужеродными генами с использованием Agrobacterium в качестве транспортера. Ультразвуковая кавитация вызывает сонопорацию, которую можно описать как целенаправленное микроранение растительной ткани. С помощью этих ультразвуковых микроран ДНК и векторов ДНК могут быть эффективно перенесены в клеточную матрицу.

сонопорация – Ультразвуковое преобразование клеток

Когда низкочастотный ультразвук (около 20 кГц) применяется к клеточным суспензиям, эффекты акустической кавитации вызывают преходящую мембранную пермеабилизацию на клеточных тканях. Этот ультразвуковой эффект известен как сонопорация и используется для переноса генов в клетки или ткани.
Преимущества ультразвука основаны на его нетепловом механическом принципе работы, который делает обработку ультразвуком часто более универсальной и менее зависимой от типов клеток. Универсальное применение сонопорации открывает возможность утилизации трансгенных растений, обладающих значительным потенциалом в биопроизводстве сложных лечебных белков человека. Такие растительные биореакторы могут быть легко генетически модифицированы, предотвращают потенциальное загрязнение патогенами человека, не повреждают опосредующие трансформацию бактерии (например, Agrobacterium) и являются недорогим, эффективным методом биосинтеза.

Ультразвуковая трансформация клеток

Обработка ультразвуком — это метод, который применяет низкочастотные ультразвуковые волны для перемешивания частиц в растворе, для смешивания растворов, тем самым увеличивая скорость массопереноса и растворения. Одновременно обработка ультразвуком может удалять растворенные газы из жидкостей. При превращении растений обработка ультразвуком вызовет образование микроранзий на растительной ткани и усилит доставку голой ДНК в протопласт растения.

Для генетической трансформации ультразвуковая агробактериальная трансформация (SAAT) является предпочтительным методом и имеет значительно более высокую эффективность, чем обработка ультразвуком, используемая для переноса голой ДНК и векторов ДНК непосредственно в протопласт. Многочисленные исследования показали, что обработка ультразвуком Agrobacterium-mediated transformation (SAAT) может использоваться для индуцирования механического разрушения и образования ран на клетках растений ультразвуковыми волнами и результирующей акустической кавитацией. Короткая ультразвуковая обработка создает микрораны на поверхности эксплантов. Так как раненые клетки позволят проникнуть Agrobacterium в более глубокую часть растительных тканей, тем самым увеличив вероятность заражения растительных клеток. Кроме того, секретируемые фенольные соединения усиливают трансформацию. Микроранины, генерируемые ультразвуком, также делают проникновение бактерий в эксплант также более осуществимым. SAAT успешно использовался для генетической трансформации видов растений, особенно считающихся устойчивыми к Agrobacterium.
Будучи очень простым и недорогим методом, а также значительное усиление агробактериального переноса генов являются основными преимуществами SAAT. Помимо успешного применения SAAT в трансформации Chenopodium rubrum L. и Beta vulgaris L., этот подход также применялся при производстве рекомбинантных теплолабильных голотоксинов дикого типа Escherichia coli и мутантных вакцинных адъювантов Escherichia coli в Nicotiana tabacum, в которых у птиц были обнаружены самые высокие системные LT-B-специфические титры IgG.
(ср. Laere et al., 2016; М. Климек-Ходацкая и Р. Барански, 2014)

Общая процедура переноса генов с помощью сонопорации в растительных клетках

1. Подготовка генетического материала: Начните с подготовки генетического материала, который вы хотите ввести в растительные клетки. Это может быть плазмидная ДНК, РНК или другие нуклеиновые кислоты.
2. Выделение растительных клеток: Изолируйте растительные клетки, на которые вы хотите ориентироваться. В зависимости от вашего эксперимента эти клетки могут быть выделены из растительных тканей или культур.
3. Клеточная суспензия: Суспендируйте растительные клетки в подходящей среде или буфере. Это необходимо для того, чтобы клетки были здоровыми и находились в состоянии, способствующем поглощению генов.
4. Настройте свой ультразвуковой аппарат: Подготовьте свой ультразвуковой аппарат зондового типа, предварительно установив параметры обработки ультразвуком, такие как амплитуда, время, энергия и температура. Погрузите ультразвуковой зонд в клеточную суспензию.
5. Озвучивание: Запустите процедуру обработки ультразвуком. Быстрое колебание наконечника зонда порождает кавитационные пузырьки в жидкости. Эти пузырьки расширяются и разрушаются за счет ультразвуковых волн, создавая механические силы и микропотоки в суспензии.
6. Сонопорация: Механические силы и микропотоки, создаваемые кавитацией, временно создают поры и отверстия в мембранах растительных клеток. Генетический материал, присутствующий в суспензии, может проникать в растительные клетки через эти поры.
7. Инкубация: После процедуры сонопорации инкубируйте растительные клетки, чтобы они могли восстановить и стабилизировать свои мембраны. Это важный шаг для обеспечения выживания клеток и успешного переноса генов.

Перенос генов через агробактерии или липосомы

Существует две распространенные формы трансфекции растительной клетки. Они используют либо агробактерии, род грамотрицательных бактерий, либо липосомы в качестве носителя генетического материала.

• Сонопорация, опосредованная агробактериями: Agrobacterium tumefaciens — бактерия, обычно используемая в генной инженерии растений. В этом методе плазмидная ДНК, содержащая нужный ген, вводится в Agrobacterium, которая затем смешивается с растительными клетками. Клеточную суспензию подвергают сонопорации с помощью ультразвукового аппарата зондового типа. Ультразвуковая энергия усиливает передачу генетического материала от Agrobacterium к растительным клеткам. Этот метод широко используется для генетической модификации растений.
• Липосомно-опосредованная сонопорация: Липосомы представляют собой везикулы на основе липидов, которые могут нести генетический материал. В этом методе липосомы, загруженные плазмидной ДНК или другими нуклеиновыми кислотами, смешиваются с растительными клетками. Сонопорация с использованием ультразвукового аппарата зондового типа используется для облегчения поглощения липосом растительными клетками. Ультразвук разрушает липидные бислои липосом, высвобождая генетический материал в растительные клетки. Этот подход полезен для временных исследований экспрессии генов в растительных клетках.

Научно доказанные преимущества опосредованной агробактериальной трансформации с помощью ультразвука (SAAT)

Ультразвуковая обработка agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) была применена к многочисленным видам растений. Короткая и относительно мягкая ультразвуковая обработка культур растительных клеток вызывает сонопорацию, что впоследствии позволяет глубоко проникнуть Agrobacterium в качестве переносчика генов. Ниже вы можете прочитать примерные исследования, демонстрирующие благотворное влияние SAAT.

Ультразвуковая трансформация ашваганды

Чтобы повысить эффективность трансформации у W. somnifera (известного как ашваганда или зимняя вишня), Дехдашти и его коллеги (2016) исследовали использование ацетосиргинона (AS) и обработки ультразвуком.
Ацетосиргин (АС) добавляли в три этапа: жидкая культура Agrobacterium, инфекция Agrobacterium и совместная культивирование эксплантов с Agrobacterium. Было установлено, что добавление 75 мкМ AS к жидкой культуре Agrobacterium является оптимальным для индукции генов vir.
Дополнительное применение ультразвуковой обработки (SAAT) привело к самой высокой экспрессии генов. Экспрессия гена gusA в волосистых корнях была признана лучшей, когда листья и кончики побегов обрабатывались ультразвуком в течение 10 и 20 секунд соответственно. Эффективность трансформации улучшенного протокола была зафиксирована на 66,5 и 59,5% в случае эксплантов листьев и побегов соответственно. По сравнению с другими протоколами эффективность преобразования этого улучшенного протокола оказалась в 2,5 раза выше для листьев и в 3,7 раза больше для наконечников побегов. Анализ Южного пятна подтвердил 1-2 копии трансгена gusA в линиях W1-W4, в то время как 1-4 трансгенные копии были обнаружены в линии W5, сгенерированной улучшенным протоколом.

Влияние продолжительности опосредованной переработки agrobacterium с помощью ультразвука (SAAT) на частоту трансформации эксплантов листьев W. somnifera (a) и кончика побега (b)
(исследование и графика: © Дехдашти и др., 2016)

Ультразвуковая трансформация хлопка

Hussain et al. (2007) демонстрируют благотворное влияние превращения хлопка с помощью ультразвука. Акустическая кавитация, вызванная низкочастотным ультразвуком, создает микрораны на поверхности и под поверхностью растительной ткани (сонопорация) и позволяет Agrobacterium путешествовать глубже и полностью по всей растительной ткани. Этот способ ранения увеличивает вероятность заражения растительных клеток, лежащих глубже в ткани. Чтобы оценить эффективность трансформации SAAT, была измерена экспрессия гена GUS. Репортерная система GUS — это репортерная генная система, особенно полезная в молекулярной биологии растений и микробиологии. При корректировке различных параметров SAAT была значительно улучшена транзиторная экспрессия GUS в хлопке с использованием зрелых эмбрионов в качестве эксплантата. GUS был впервые обнаружен через 24 часа после инкубации эксплантов, а через 48 часов экспрессия GUS была очень интенсивной, что послужило полезным показателем успешной трансформации хлопкового эксплантата после обработки ультразвуком Agrobacterium mediated transformation (SAAT). Сравнение различных методов трансформации (а именно биолистических, Агро, БААТ, СААТ), обработки ультразвуком агробактерий-опосредованной трансформации (SAAT) показало наилучшие результаты трансформации.

Выбор процедуры преобразования на основе переходного выражения GUS. Ультразвуковая трансформация Agrobacterium-mediated (SAAT) показывает значительно более высокую транзиторную экспрессию.
(исследование и графика: © Hussain et al., 2007)

Высокоэффективные ультразвуковые решения для сонопорации и SAAT

Hielscher Ultrasonics имеет многолетний опыт в разработке и производстве высокоэффективных ультразвуковых аппаратов для лабораторий, исследовательских учреждений, а также промышленного производства с очень высокой пропускной способностью. Для микробиологии и наук о жизни Hielscher предлагает различные решения для удовлетворения различных требований, необходимых для конкретных тканей и их лечения. Для одновременной ультразвуковой обработки многочисленных образцов Hielscher предлагает UIP400MTP для многолуночных пластин, VialTweeter для обработки ультразвуком до 10 флаконов (например, трубок Eppendorf) или ультразвуковой CupHorn. Ультразвуковые аппараты зондового типа доступны от 50 до 400 Вт в качестве лабораторных гомогенизаторов, в то время как промышленные системы охватывают диапазон мощности от 500 Вт до 16 кВт.
Пожалуйста, свяжитесь с нами и сообщите нам о вашей заявке и требованиях к процессу. Наш опытный персонал будет рад порекомендовать наиболее подходящий ультразвуковой аппарат для вашего биологического процесса.
В приведенной ниже таблице приведена приблизительная производительность наших ультразвуковых аппаратов: