Вирусные вакцины на основе клеточных культур – Эффективное разрушение клеток с помощью ультразвуковой обработки

Часто задаваемые вопросы об ультразвуковом разрушении клеток при производстве вирусных вакцин

Что такое ультразвуковое разрушение клеток?

При ультразвуковом разрушении клеток используется высокоинтенсивный ультразвук, как правило, в диапазоне от 20 до 30 кГц, для разрыва клеточных мембран и высвобождения внутриклеточного содержимого. Мощные ультразвуковые волны создают в жидкости кавитационные пузырьки. Когда эти пузырьки разрушаются, они генерируют интенсивные локальные сдвиговые силы и микротечения, которые механически разрушают клетки и способствуют массообмену между внутренней средой клетки и окружающей средой. При производстве вакцин этот метод используется для лизиса инфицированных вирусом клеточных культур и высвобождения внутриклеточных и мембраносвязанных вирусных частиц в полученный продукт.

Почему для получения вируса следует использовать ультразвуковую обработку вместо химического или ферментативного лизиса?

Ультразвуковая обработка основана на чисто механическом воздействии. Не требуется использование моющих средств, лизоцима, протеиназы К или других лизирующих реагентов, которые могут изменить состав лизата, помешать последующей очистке или которые необходимо удалить перед дальнейшей обработкой. Химические реагенты, как правило, требуют трудоемкой многоэтапной подготовки, чтобы предотвратить ингибирование последующих анализов и других этапов постобработки. Ферментативное разрушение требует длительной инкубации и часто дает невоспроизводимые результаты. Ультразвуковой лизис также объединяет этапы ресуспендирования, разрушения и экстракции в одну непрерывную операцию. Если в вашем процессе требуется этап с использованием детергентов или ферментов, ультразвуковая обработка усиливает его, а не заменяет: кавитация ослабляет мембраны и обеспечивает равномерное воздействие реагента на все клетки.

Чем ультразвуковая обработка отличается от методов механической гомогенизации?

Ультразвуковые устройства зондового типа обеспечивают прямую и эффективную передачу ультразвуковой энергии, поскольку сонотрод находится в непосредственном контакте с образцом. Методы гомогенизации с механическим приводом зачастую приводят к снижению эффективности передачи энергии. Ультразвуковая обработка не требует использования расходных измельчающих шариков или вращающихся уплотнений в потоке продукта, а также сопел или камер, которые могут забиваться вязкой клеточной массой, и исключает перекрестное загрязнение между партиями.

Может ли ультразвуковая обработка повредить вирус или антиген?

Это ключевая задача оптимизации, и она поддается контролю. Регулируя параметры ультразвуковой обработки, можно точно контролировать эффекты ультразвукового воздействия: низкая амплитуда и короткое время воздействия дают очень мягкий эффект, тогда как высокие амплитуды, повышенное давление и более длительное время воздействия приводят к интенсивной обработке. Поскольку интенсивность можно точно настроить с учётом особенностей биологического образца, удаётся избежать чрезмерной обработки, деградации и потери выхода. На практике амплитуда, время пребывания и количество проходов устанавливаются на минимальные значения, обеспечивающие достижение целевой скорости разрушения, при этом осуществляется постоянный мониторинг температуры и охлаждение.

Снижает ли ультразвуковая обработка вязкость урожая?

Да. Густые культуры с высокой плотностью клеток обладают высокой вязкостью и их трудно перекачивать из-за высвобожденной нефрагментированной ДНК клеток-хозяев. Ультразвуковая обработка разрезает и фрагментирует ДНК и РНК, а также растворяет клеточную массу и разбивает агрегаты клеточных остатков. В результате получается однородная, перекачиваемая суспензия, которая более эффективно подходит для осветления, центрифугирования и хроматографии. Фрагментация ДНК и РНК с помощью контролируемой ультразвуковой обработки является хорошо зарекомендовавшим себя лабораторным применением той же технологии.

Можно ли запустить процесс в непрерывном режиме?

Да. Ультразвуковые аппараты Hielscher рассчитаны на круглосуточную непрерывную работу в промышленных условиях и могут комплектоваться проточными камерами и реакторами для непрерывной ультразвуковой обработки в технологическом потоке, рециркуляционных контурах или интеграции в производственные модули и технологические линии. Возможен как однопроходный, так и многопроходный режим работы.

Как перейти от лабораторных испытаний к серийному производству?

Линейно, на основе измеримого вводимого количества энергии. Все результаты ультразвуковой обработки, полученные с помощью ультразвукового гомогенизатора Hielscher, можно линейно масштабировать для обеспечения более высокой производительности в промышленных условиях; параметры ультразвуковой обработки, разработанные с использованием настольного ультразвукового гомогенизатора, можно напрямую перенести на более крупные системы Hielscher. Критерием масштабирования является удельная подаваемая энергия на единицу объёма в сочетании с амплитудой, временем пребывания и температурой. Консультации по технологическим процессам компании Hielscher включают рекомендации по оптимизации параметров (амплитуда, удельная энергия E/V, время пребывания, контроль температуры и давления), привязанные к измеримой подаваемой энергии.

Подходит ли ультразвуковое разрушение клеток для производства в чистых помещениях и в соответствии с требованиями GMP?

Ультразвуковые устройства Hielscher можно легко установить в лабораториях и на производственных объектах с чистыми помещениями. Корпуса изготовлены из антибактериального пластика или нержавеющей стали. Все детали, контактирующие с рабочей средой, такие как сонотроды и проточные ячейки, изготовлены из титана или нержавеющей стали и поддаются автоклавированию. Доступны специальные проточные реакторы, отвечающие современным требованиям CIP (очистка на месте) и SIP (стерилизация на месте). Преобразователь промышленной серии UIP имеет степень защиты IP64 и может устанавливаться в сложных условиях эксплуатации, при этом генератор размещается удаленно. Поскольку ультразвуковые преобразователи Hielscher преобразуют электрическую энергию в механические колебания с очень высоким КПД (около 80–90 %) от розетки до жидкости, преобразователь можно встраивать в закрытые корпуса без вентиляционных решеток, и при этом не требуется принудительное охлаждение, например с помощью сжатого воздуха или воды. Это также означает, что никакая охлаждающая среда не вступает в контакт с технологическим процессом. Автоматическая документация технологического процесса обеспечивает прослеживаемость и воспроизводимость в условиях регулируемого производства.

Может ли ультразвуковая обработка также инактивировать вирус для получения инактивированной вакцины?

Да. Мощный ультразвук находит применение при инактивации патогенов, таких как бактерии и вирусы. При выборе соответствующей дозы и интенсивности ультразвуковой обработки клетки и микроорганизмы можно обрабатывать в соответствии с целями процесса, поэтому одна и та же платформа используется как для лизиса с целью извлечения, так и для инактивации. Сочетание ультразвукового воздействия и нагрева, известное как термоультразвуковая обработка, обеспечивает более быструю стерилизацию при значительно сниженной тепловой интенсивности и продолжительности, что является преимуществом для сохранения термочувствительных соединений, таких как белки и антигены. Ультразвуковая инактивация, как правило, используется в сочетании с устоявшимися химическими методами инактивации, при этом для каждого конкретного вируса необходимо подтвердить полную кинетику инактивации.

Можно ли использовать ту же систему для этапов приготовления после сбора урожая?

Да. Эта же платформа обеспечивает диспергирование антигенов в суспензиях, полимеров или липосомальных капсул, деагломерацию и равномерное распределение антигенов и адъювантов на основе алюминия, таких как Alhydrogel™, приготовление вакцин в виде липосом и твердолипидных наночастиц с точным контролем размера носителя, а также этап дегазации перед розливом в флаконы или шприцы.