Ultrasone productie van hooggezuiverde bètaglucanen van schizophyllan

Schizophyllan is een β-glucaan uit schimmels met immunomodulerende eigenschappen. Voor een zeer krachtige medicinale werking moet schizophyllan een laag molecuulgewicht hebben om een verbeterde biologische beschikbaarheid te vertonen. Het is bewezen dat ultrasone behandeling het molecuulgewicht van schizophyllan verlaagt. Als betrouwbare en doeltreffende methode kan sonicatie eenvoudig worden toegepast voor de productie van schizophyllan met een laag molecuulgewicht.

Schizophyllum-paddenstoelen en ultrasone extractie van bètaglucanen

Soorten van het paddenstoelengeslacht Schizophyllum groeien in de natuur op rottende bomen na regenseizoenen. De vruchtlichamen worden in het daaropvolgende droge seizoen verzameld. Schizophyllum-soorten zijn rijk aan biochemische verbindingen zoals glucanen en worden daarom vooral in tropische landen als voedsel en geneesmiddel geconsumeerd. Vanwege zijn immunomodulerende, antischimmel-, antineoplastische en antivirale eigenschappen heeft Schizophyllum commune, ook bekend als het gewone waaiertje, de belangstelling van biotechnologische en farmaceutische bedrijven gewekt.
Het polysacharide schizophyllan, ook bekend als sizofiran, sonifilan of sizofilan, is het voornaamste β-glucaan in Schizophyllum-paddenstoelen, die het zeer effectieve bioactieve β-glucaan schizophyllan leveren.
Schizophyllum commune-paddenstoelen groeien in de natuur op bomen; het mycelium kan ook in fermentatiebouillon worden gekweekt. Voor farmaceutische en cosmetische toepassingen is schizophyllan met een laag molecuulgewicht veel doeltreffender dan schizophyllan met een hoog molecuulgewicht. Dit komt doordat schizophyllan met een laag molecuulgewicht een aanzienlijk betere biologische beschikbaarheid en absorptiesnelheid vertoont. Bovendien is schizophyllan met een hoog molecuulgewicht vaak problematisch in toepassingen, omdat het tot een hoge viscositeit van zijn waterige oplossingen leidt.
Ultrasone verkleining is een zeer effectieve en betrouwbare techniek om het molecuulgewicht van schizophyllan te verlagen en daarmee de kwaliteit van het β-glucaanmolecuul te verhogen.

Protocol voor de productie van schizophyllan met een laag molecuulgewicht

Omdat schizophyllan met een molecuulgewicht een drastisch betere biologische beschikbaarheid en toepassingseigenschappen vertoont, onderzocht het onderzoeksteam van Smirnou ultrasone behandeling voor de splitsing en verkleining van het β-glucaanmolecuul schizophyllan.

Ultrasone behandeling van schizophyllan

Het β-1.3(1.6)-glucaan schizophyllan (SPG) werd geproduceerd door ondergedompelde kweek van de schimmel S. commune in een bioreactor met sacharose als substraat.
Na afloop van de kweek werd de kweekbouillon verdund met gedemineraliseerd water tot een schizophyllanconcentratie van 2 g/L en vond ultrasone behandeling plaats met de ultrasone processor UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Duitsland) in recirculatiemodus bij de volgende parameters en omstandigheden: debiet van het medium 50 mL/s, frequentie 20 kHz, vermogen 2000 W, sonotrode type BS2d22, booster type B2-1.4 en amplitude 100%. De temperatuur van de kweekbouillon aan het begin van de sonicatie was 25°C. De ultrasoon behandelde kweekbouillon (specifieke energie-inbreng 100 Ws/mL) werd door een Seitz HS800-dieptefilter gefiltreerd bij een druk van 1,5 bar en 40°C. Het ultrasoon behandelde schizophyllan (uSPG) voor chemische karakterisering werd bij laboratoriumtemperatuur uit het filtraat neergeslagen met een drievoudige hoeveelheid isopropylalcohol en gedurende 12h gedroogd bij 60°C. uSPG-oplossingen voor immunologische onderzoeken werden als volgt bereid: (1) het filtraat van de ultrasoon behandelde kweekbouillon werd gediafiltreerd door een Pall Centramate T-series PES-cassette van 0,1m2 (afkapgrens 100 kDa) bij 0,8 bar, en de diafiltratie werd voortgezet totdat de geleidbaarheid van het retentaat 20 μS/cm bedroeg; (2) de oplossing werd door diafiltratie geconcentreerd tot een uSPG-concentratie van 1 g/L en gesteriliseerd door autoclaveren bij 120°C/20 min. Gedenatureerd uSPG werd op vergelijkbare wijze bereid, behalve dat NaOH aan het filtraat van de kweekbouillon werd toegevoegd tot een concentratie van 0,2 M en de gealkaliseerde oplossing vóór de diafiltratie gedurende 30 min bij laboratoriumtemperatuur werd geïncubeerd.

Analytische methoden

De myceliumopbrengst werd gravimetrisch geschat: de kweekbouillon werd met water verdund in een verhouding van 1:4 en gedurende 20 min bij 25°C gecentrifugeerd bij 10.000 × g; het neerslag werd gewassen met een drievoudige hoeveelheid water, gedroogd bij 60°C en gewogen. Schizophyllan werd uit de bovenstaande vloeistof neergeslagen met een drievoudige hoeveelheid isopropylalcohol en gedurende 24h gedroogd bij 60°C, waarna de opbrengst gravimetrisch werd bepaald. pO2 in de kweekbouillon werd gemeten met een optische sonde Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Zwitserland).
De dynamische viscositeit van de kweekbouillon werd gemeten met een HAAKE Visco Tester 6L met spindels 1L en 2L bij 4°C en een rotatiesnelheid van 30 rpm. De filtratiesnelheid werd berekend uit de filtratietijd van 500 mL kweekbouillon door een Seitz HS800-dieptefilter van 200 × 200 mm (Pall, VS) bij een druk van 1,5 bar en 40°C.
Het molecuulgewicht van uSPG werd gemeten met SEC-MALLS op het HPLC-systeem Alliance (Waters) met in serie geschakelde kolommen PL aquagel OH60 en PL aquagel OH40, en de detector miniDAWN TREOS (Wyatt) werd door diafiltratie geconcentreerd tot een uSPG-concentratie van 1 g/L en gesteriliseerd door autoclaveren bij 120°C/20 min. Gedenatureerd uSPG werd op vergelijkbare wijze bereid, behalve dat NaOH aan het filtraat van de kweekbouillon werd toegevoegd tot een concentratie van 0,2 M en de gealkaliseerde oplossing vóór de diafiltratie gedurende 30 min bij laboratoriumtemperatuur werd geïncubeerd.

Resultaten:
De ultrasone behandeling werd rechtstreeks toegepast op de 144-h-kweekbouillon van S. commune met mycelium om de verdere verwerking van SPG te vergemakkelijken.
 
Kenmerken van gesoniceerd schizophyllan: Ultrasoon behandeld schizophyllan (uSPG) werd met alcohol uit het filtraat van de kweekbouillon neergeslagen en gekarakteriseerd. Met SEC-MALLS werd de Mw van uSPG geschat op ongeveer 1 MDa. Het gemiddelde molecuulgewicht van schizophyllan uit vloeibare fermentatie bedraagt ongeveer 5 MDa, terwijl het bij vastestofkweek tot wel 10 MDa kan oplopen. Bij vergelijking van het molecuulgewicht van ultrasoon behandeld schizophyllan met de molecuulgewichten van natief, onbehandeld schizophyllan kan een door ultrasone behandeling met een factor 5 tot 10 verlaagd molecuulgewicht worden waargenomen.
Het gesoniceerde polysacharide uSPG bevatte 0,7%w/w eiwit en 1,0%w/w residu na verassing. Het uSPG-hydrolysaat bestond voor meer dan 99% uit glucose. De analytische resultaten wijzen erop dat sonicatie de hoofdketen van het β-glucaan willekeurig splitst en dat de zijtakken intact blijven, waardoor de grootte en het molecuulgewicht van schizophyllan afnemen. Immunologische onderzoeken met vrijwel eiwit- en endotoxinevrij uSPG toonden aan dat ultrasoon behandeld schizophyllan met een lage Mw een uitgesproken immunomodulerende activiteit heeft.

 
Verlaagde viscositeit: Ultrasone behandeling resulteerde in een aanzienlijke afname van de viscositeit van de kweekbouillon. Tijdens de ultrasone behandeling veranderde de viscositeit van de kweekbouillon niet-lineair: de viscositeit daalde snel aan het begin van de ultrasone behandeling, maar later vertraagde de afname. Een specifieke energie-inbreng van 100 Ws/mL was voldoende om de viscositeit van de kweekbouillon met een factor van bijna 7 te verlagen.

Verbeterde filtratie: De ultrasoon behandelde kweekbouillon stroomde sneller door het filter dan de onbehandelde kweekbouillon (specifieke energie-inbreng 0 Ws/mL) met SPG met een hoog molecuulgewicht. Bovendien verminderde ultrasone behandeling het productverlies tijdens de filtratie aanzienlijk. Het filtraat van onbehandelde kweekbouillon met SPG met een hoog molecuulgewicht (specifieke energie-inbreng 0 Ws/mL) bevatte 0,3 ± 0,07 g/L SPG, terwijl de SPG-concentratie vóór de dieptefiltratie 2 g/L bedroeg. Daarentegen bevatte het filtraat van bij 100 Ws/mL ultrasoon behandelde kweekbouillon SPG in een concentratie van 2,2 ± 0,2 g/L, wat overeenkomt met vrijwel geen productverlies.

Conclusie: In zijn conclusie vat het onderzoeksteam samen dat ultrasone verwerking een efficiënte technologie is voor de productie van schizophyllan met een laag molecuulgewicht, dat vervolgens in cosmetica en de geneeskunde kan worden gebruikt. Wanneer ultrasone behandeling op de volledige kweekbouillon met mycelium wordt toegepast, biedt dit bepaalde voordelen voor de productie van schizophyllan. Het vermindert productverliezen tijdens de verdere verwerking en maakt de productie van een hooggezuiverd polysacharide mogelijk door efficiënt gebruik van ultrafiltratie.
Bovendien constateerden de onderzoekers dat ultrasone verwerking van schizophyllan eenvoudig schaalbaar is. Eén eenheid van de ultrasone desintegrator UIP2000hdT in de proefinstallatie verwerkte 1 liter kweekbouillon in 110 s in doorstroommodus. De productiviteit van het systeem kan eenvoudig worden verhoogd door aanvullende ultrasone eenheden in serie aan te sluiten.

 
Lees meer over de eenvoudige opschaling van paddenstoelenextractie!
 

Ultrasone apparatuur met hoge prestaties voor de verwerking van glucanen uit schimmels

De fragmentatie van polysachariden zoals glucanen en andere bioactieve verbindingen zoals chitine en chitosan kan betrouwbaar worden uitgevoerd met ultrasone apparatuur met hoge prestaties van Hielscher. Onze sonicatoren kunnen hoge amplituden leveren, bieden nauwkeurige controle over de procesparameters en kunnen 24/7 onder zware belasting en in veeleisende omgevingen worden gebruikt. Het assortiment apparatuur van Hielscher Ultrasonics voldoet betrouwbaar aan deze eisen. Naast uitstekende ultrasone prestaties bieden sonicatoren van Hielscher een hoge energie-efficiëntie, wat een aanzienlijk economisch voordeel vormt – vooral bij gebruik in commerciële productie op grote schaal.
Sonicatoren van Hielscher zijn systemen met hoge prestaties die kunnen worden uitgerust met accessoires zoals sonotroden, boosters, reactoren of doorstroomcellen om optimaal aan uw procesbehoeften te voldoen.
Een digitaal kleurendisplay, de mogelijkheid om sonicatiecycli vooraf in te stellen, automatische gegevensregistratie op een geïntegreerde SD-kaart, bediening op afstand via een browser en vele andere functies waarborgen de hoogste mate van procescontrole en gebruiksvriendelijkheid. Dankzij hun robuustheid en vermogen om zware belasting te verdragen, zijn de ultrasone systemen van Hielscher uw betrouwbare werkpaard in de productie.
Voor het verlagen van het molecuulgewicht van β-glucanen zoals schizophyllan is krachtige ultrasone energie nodig om de beoogde splitsing en een hoogwaardig eindproduct van schizophyllan te verkrijgen dat voor farmaceutische toepassingen kan worden gebruikt.
 
Vind hier meer informatie over ultrasone extractie van bètaglucanen uit paddenstoelen, inclusief stapsgewijze instructies!
 
De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze sonicatoren: