PMCA voor detectie van Prionen met hoge doorvoer met behulp van de UIP400MTP Sonicator

De UIP400MTP multi-well plaat sonicator biedt een krachtige oplossing voor high-throughput monstervoorbereiding in eiwitmisvouwing cyclische amplificatie (PMCA). Door het leveren van een uniforme energiedistributie over meerdere wells en het handhaven van nauwkeurige sonicatieparameters, maakt dit systeem de gelijktijdige verwerking van talrijke monsters met uitzonderlijke reproduceerbaarheid mogelijk. Deze mogelijkheden zijn essentieel voor het optimaliseren van PMCA om prionen te detecteren bij lage concentraties in uitdagende biologische monsters, zoals speeksel, waar assayremmers de resultaten kunnen vertroebelen.

Prionziekten, zoals chronic wasting disease (CWD) bij hertachtigen en de ziekte van Creutzfeldt-Jakob (CJD) bij mensen, zijn neurodegeneratieve aandoeningen die worden veroorzaakt door verkeerd gevouwen prioneiwitten (PrP^Sc). Bij deze ziekten zijn er vaak lage niveaus van infectieuze prionen in lichaamsvloeistoffen zoals speeksel, bloed en urine, wat de diagnose en het onderzoek bemoeilijkt. Horizontale transmissie van CWD via prionen die in milieumatrices worden uitgescheiden, heeft bijzonder belangrijke implicaties voor het beheer van wilde dieren en de ecologische gezondheid. Op dezelfde manier is bij ziekten zoals de ziekte van Creutzfeldt-Jakob betrouwbare amplificatie van verkeerd gevouwen prioneiwitten uit menselijke monsters cruciaal voor het bevorderen van de diagnostiek en het begrijpen van het ziekteverloop.

Door een gewijzigd PMCA-protocol toe te passen, kunnen veelvoorkomende testremmers (bv. mucines in speeksel) worden omzeild en kan een hoge gevoeligheid worden bereikt bij het detecteren van prionen die anders niet detecteerbaar of dubbelzinnig zouden zijn met technieken zoals real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC). Deze vooruitgang verbetert de priondetectie voor verschillende ziekten, waardoor PMCA een onmisbaar hulpmiddel wordt voor priononderzoek en -diagnostiek. De multi-well plaat sonicator UIP400MTP vergemakkelijkt high-throughput PMCA sonicatie van talrijke monsters in microtiterplaten (bv. 6-, 24-, of 96-wells platen) of flacons in een buizenrek.

Protocol voor High-Throughput eiwitmisvouwing cyclische amplificatie (PMCA)

Het volgende protocol maakt een efficiënte verwerking van grote aantallen monsters mogelijk onder exact dezelfde omstandigheden voor robuuste onderzoeksresultaten.

monstervoorbereiding

Startmateriaal:
Bereid monsters voor door:

• Resuspenderen van sarkosyl extractiepellets in PMCA substraat.
• Hersenhomogenaten of bloedmonsters rechtstreeks besprenkelen met prionzaad.

Substraat:

• Gebruik een hersenhomogenaat van 10% (g/g) bereid uit transgene muizen met overexpressie van PrP^C (bijvoorbeeld Tg-muizen).
• Homogeniseer het hersenweefsel in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Bewaar het substraat bij -80ºC tot gebruik.

Monstername in microtiterplaat of buisjes:
Buizen:

• Voeg 90 μL substraat van hersenhomogenaat toe en zaad met 10 μL monster (bijv. bloed, hersenhomogenaat of sarkosylpellet).
• Plaats 3 teflonparels (1,59 mm of 2,38 mm diameter) in elke 0,2 mL buis.
• Monteer de buizen in een rek dat compatibel is met de UIP400MTP sonicator.

6-wells microtiterplaat:

• Voeg 5 ml substraat van hersenhomogenaat toe en zaai met 500 μL monster per well.
• Voeg 3 teflonparels toe aan elk putje.

PMCA Procedure

Plaatsing:
Plaats het buisrek of de 6-well microtiterplaat in de UIP400MTP sonicator volgens de instructies van de fabrikant.

Fietsprogramma:
Voer 144 PMCA-cycli als volgt uit:

• Incubatie: 29 minuten en 30 seconden bij 37°C.
• Sonificatie: 30 seconden bij 60% amplitude.
• Bewaak de temperatuur: Gebruik de insteekbare temperatuursensor om de monstertemperatuur te controleren en programmeer de UIP400MTP op een maximumtemperatuur van 48-50°C.

Latere rondes:
Breng na het voltooien van de eerste ronde van 144 cycli een aliquot van het geamplificeerde materiaal over:

• 10-voudig verdunnen in vers substraat van transgene muishersenhomogenaat.
• Voer 96 PMCA-cycli uit voor de volgende rondes, met behoud van dezelfde sonicatieparameters.
• Ga door met het gewenste aantal rondes (meestal maximaal 5).

Detectie van PrP^Sc

1. Proteïnase K-vergisting:
   – Behandel de monsters met Proteïnase K (50 μg/mL) bij 37 °C gedurende 1 uur.
   – Beëindig de digestie door SDS-monsterbuffer toe te voegen en 10 minuten te koken.
2. Western Blot Analyse:
   – Analyseer verteerde monsters met:
   – 6H4 of PRC1 anti-PrP antilichamen.
   – Voer SDS-PAGE uit en breng over op PVDF-membranen voor detectie.

 

 

Meer monsters verwerken voor robuustere resultaten

De UIP400MTP multi-well plaat sonicator verbetert de efficiëntie en schaalbaarheid van eiwit misvouwing cyclische amplificatie (PMCA) aanzienlijk en pakt de traditioneel tijdrovende aard van de procedure aan. Door de gelijktijdige verwerking van maximaal 96 monsters in een plaat met 96 wells mogelijk te maken, stroomlijnt het systeem PMCA-workflows met behoud van nauwkeurige en uniforme sonicatiecondities in alle wells. Deze hoge verwerkingscapaciteit minimaliseert handmatige handelingen, vermindert arbeidsintensieve stappen en zorgt voor reproduceerbaarheid, waardoor het een onmisbaar hulpmiddel is voor priononderzoek. Of het nu gaat om onderzoek naar Chronic Wasting Disease of de ziekte van Creutzfeldt-Jakob, de UIP400MTP vergemakkelijkt grootschalige studies met een grotere efficiëntie, waardoor onderzoekers kunnen voldoen aan de eisen van moderne diagnostische en wetenschappelijke toepassingen.

---

---

Literatuur / Referenties

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.