PMCA voor de detectie van prionen met hoge verwerkingscapaciteit met de sonicator UIP400MTP

De sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten biedt een krachtige oplossing voor monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit bij cyclische amplificatie van foutief gevouwen eiwitten (PMCA). Door een gelijkmatige energieverdeling over meerdere wells te leveren en nauwkeurige sonicatieparameters te handhaven, maakt dit systeem de gelijktijdige verwerking van talrijke monsters met uitzonderlijke reproduceerbaarheid mogelijk. Deze mogelijkheden zijn cruciaal voor het optimaliseren van PMCA om prionen in lage concentraties te detecteren in lastige biologische monsters, zoals speeksel, waarin assayremmers de resultaten kunnen vertroebelen.

Prionziekten, zoals chronic wasting disease (CWD) bij hertachtigen en de ziekte van Creutzfeldt-Jakob (CJD) bij mensen, zijn neurodegeneratieve aandoeningen die worden veroorzaakt door foutief gevouwen prioneiwitten (PrP^Sc). Bij deze ziekten zijn vaak lage hoeveelheden infectieuze prionen aanwezig in lichaamsvloeistoffen, zoals speeksel, bloed en urine, wat de diagnostiek en het onderzoek bemoeilijkt. Horizontale overdracht van CWD via prionen die in milieumatrices worden uitgescheiden, heeft bijzonder ingrijpende gevolgen voor wildbeheer en ecologische gezondheid. Ook bij ziekten zoals de ziekte van Creutzfeldt-Jakob is betrouwbare amplificatie van foutief gevouwen prioneiwitten uit menselijke monsters cruciaal voor het verbeteren van de diagnostiek en het begrijpen van de ziekteprogressie.

Door een aangepast PMCA-protocol toe te passen, kunnen veelvoorkomende assayremmers (bijv. mucinen in speeksel) worden omzeild en kan een hoge gevoeligheid worden bereikt bij het detecteren van prionen die met technieken zoals real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) anders niet detecteerbaar zouden zijn of ambigue detectieresultaten zouden opleveren. Deze vooruitgang verbetert de detectie van prionen bij verschillende ziekten, waardoor PMCA een onmisbaar hulpmiddel voor priononderzoek en diagnostiek wordt. De sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten vergemakkelijkt PMCA met hoge verwerkingscapaciteit door talrijke monsters in microplaten (bijv. platen met 6, 24 of 96 wells) of flacons in een buizenrek te soniceren.

Protocol voor cyclische amplificatie van foutief gevouwen eiwitten (PMCA) met hoge verwerkingscapaciteit

Het volgende protocol maakt de efficiënte verwerking van een groot aantal monsters onder exact dezelfde omstandigheden mogelijk voor robuuste onderzoeksresultaten.

Monstervoorbereiding

Uitgangsmateriaal:
Bereid monsters voor door:

• Pellets uit sarkosylextractie opnieuw te suspenderen in PMCA-substraat.
• Prionkiemen rechtstreeks toe te voegen aan hersenhomogenaten of bloedmonsters.

Substraat:

• Gebruik een hersenhomogenaat van 10% (wt/vol), bereid uit transgene muizen met overexpressie van PrP^C (bijv. Tg-muizen).
• Homogeniseer het hersenweefsel in:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Bewaar het substraat tot gebruik bij -80ºC.

Opstelling van monsters in een microplaat of buizen:
Buizen:

• Voeg 90 μL hersenhomogenaatsubstraat toe en ent dit met 10 μL monster (bijv. bloed, hersenhomogenaat of een sarkosylpellet).
• Plaats 3 Teflon-kogeltjes (met een diameter van 1,59 mm of 2,38 mm) in elke buis van 0,2 mL.
• Plaats de buizen in een rek dat compatibel is met de sonicator UIP400MTP.

Microplaat met 6 wells:

• Voeg per well 5 mL hersenhomogenaatsubstraat toe en ent dit met 500 μL monster.
• Voeg aan elke well 3 Teflon-kogeltjes toe.

PMCA-procedure

Plaatsing:
Plaats het buizenrek of de microplaat met 6 wells in de sonicator UIP400MTP volgens de instructies van de fabrikant.

Cyclusprogramma:
Voer als volgt 144 PMCA-cycli uit:

• Incubatie: 29 minuten en 30 seconden bij 37°C.
• Sonicatie: 30 seconden bij 60% amplitude.
• Bewaak de temperatuur: gebruik de aansluitbare temperatuursensor om de monstertemperatuur te bewaken en programmeer de UIP400MTP op een maximale temperatuur van 48–50°C.

Volgende rondes:
Breng na voltooiing van de eerste ronde van 144 cycli een aliquot van het geamplificeerde materiaal over:

• Verdun dit 10-voudig in vers substraat van hersenhomogenaat van transgene muizen.
• Voer in de volgende rondes 96 PMCA-cycli uit en handhaaf daarbij dezelfde sonicatieparameters.
• Ga door tot het gewenste aantal rondes is bereikt (doorgaans maximaal 5).

Detectie van PrP^Sc

1. Digestie met proteïnase K:
   – Behandel monsters gedurende 1 uur met proteïnase K (50 μg/mL) bij 37°C.
   – Beëindig de digestie door SDS-monsterbuffer toe te voegen en de monsters gedurende 10 minuten te koken.
2. Westernblotanalyse:
   – Analyseer gedigereerde monsters met:
   – 6H4- of PRC1-antilichamen tegen PrP.
   – Voer SDS-PAGE uit en breng de eiwitten voor detectie over op PVDF-membranen.

 

De Hielscher UIP400MTP is de meest flexibele sonicator voor uw multiwellplaten, PCR-platen of monsterbuisjes. Met 400 watt continu sonicatievermogen is hij ontworpen voor toepassingen zoals cellyse, emulsificatie, eiwitextractie, DNA / RNA-fragmentatie, deagglomeratie, FFPE-extractie, het losmaken van cellen en biofilms of emulsificatie. De UIP400MTP is geen ultrasoonbad. Het is een cuphoorn met hoge intensiteit voor gerichte sonicatie. Deze krachtige contactloze sonicator levert een uniforme sonicatie in alle wells van uw standaard wellplaat. U kunt de amplitude, het vermogen en de pulswerking nauwkeurig regelen. Een ingebouwde timer en temperatuursonde zorgen voor consistente resultaten. De UIP400MTP-platensonicator koelt monsters met een waterbad, met een optionele externe koeler.

 

Verwerk meer monsters voor robuustere resultaten

De sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten verbetert de efficiëntie en schaalbaarheid van cyclische amplificatie van foutief gevouwen eiwitten (PMCA) aanzienlijk en pakt daarmee het van oudsher tijdrovende karakter van de procedure aan. Doordat maximaal 96 monsters in een plaat met 96 wells gelijktijdig kunnen worden verwerkt, stroomlijnt het systeem PMCA-werkprocessen, terwijl in alle wells nauwkeurige en gelijkmatige sonicatieomstandigheden worden gehandhaafd. Deze hoge verwerkingscapaciteit minimaliseert handmatige handelingen, vermindert arbeidsintensieve stappen en waarborgt de reproduceerbaarheid, waardoor het systeem een onmisbaar hulpmiddel voor priononderzoek is. Of het nu gaat om onderzoek naar chronic wasting disease of de ziekte van Creutzfeldt-Jakob, de UIP400MTP vergemakkelijkt grootschalige studies met een grotere efficiëntie, zodat onderzoekers kunnen voldoen aan de eisen van moderne diagnostische en wetenschappelijke toepassingen.

---

---

Literatuur / Referenties

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.