Amyloïde fibrillenvorming met behulp van de UIP400MTP microtiterplaat Sonicator

Net als kristallen vormen amyloïde fibrillen zich door een proces van nucleatie en daaropvolgende groei. Echter, door de hoge vrije-energiebarrière van nucleatie, vindt spontane amyloïde fibrilvorming pas plaats na een langdurige vertragingsfase. Ultrasoon geluid is een krachtig middel gebleken om amyloïdekernvorming op te wekken en zo de vorming van fibrillen aanzienlijk te versnellen. In combinatie met een microtiterplaatlezer die gebruik maakt van thioflavine T (ThT) fluorescentie, maakt ultrasoonbehandeling high-throughput detectie van amyloïde fibrillen in meerdere monsters tegelijk mogelijk.

Ultrasonisch geïnduceerde vorming van amyloïde fibrillen met de UIP400MTP Microplate Sonicator

Met de UIP400MTP sonicator voor meerdere putjes kunnen amyloïde fibrillen van dezelfde kwaliteit in grote hoeveelheden snel worden gesynthetiseerd voor onderzoeksdoeleinden. Deze efficiënte aanpak maakt het mogelijk om de amyloïdogeniciteit van eiwitten te bestuderen. Deze techniek maakt snelle en reproduceerbare amyloïde fibrillatie mogelijk, zoals is aangetoond met β2-microglobuline (β2-m), een amyloïdogeen eiwit dat wordt geassocieerd met dialysegerelateerde amyloïdose.

Eenvoudige experimentele aanpak: Ultrasonisch geïnduceerde amyloïde fibrillatie

Om fibrilvorming te induceren, werd een 96-well microtiterplaat in het midden van de UIP400MTP multi-well plaat sonicator geplaatst, wat zorgt voor een uniforme ultrasone blootstelling in alle wells. De experimentele condities waren als volgt:

1. Elk putje bevatte 0,2 ml β2-microglobulineoplossing (0,3 mg/ml, pH 2,5) aangevuld met 5 μM ThT.
2. De plaat werd onderworpen aan ultrasooncycli, zoals ultrasoonbehandeling van 1 minuut gevolgd door een pauze van 9 minuten.
3. Na de sonatie werd de ThT-fluorescentie gemeten met een microtiter.

(vgl. So et al., 2011)

Vergelijking met conventionele agitatie

Vergeleken met traditionele schudmethoden verminderde ultrasoon de vertragingsfase van fibrilvorming drastisch. Onder conventionele omstandigheden voor het schudden van microtiterplaten vertoonde slechts 1 op de 10 wells een verhoogde ThT-fluorescentie na 20 uur. Daarentegen werd bij gebruik van cyclische ultrasoonbehandeling (15 minuten sonificatie gevolgd door 5 minuten rust) direct na de eerste sonicatiebehandeling een significante toename van de ThT-fluorescentie gedetecteerd.

Snelle versnelling van fibrillatiekinetiek

De resultaten van So et al. (2011) toonden aan dat de spontane fibrilvorming van β2-microglobuline bij pH 2,5 kan worden versneld van enkele uren tot slechts 10-15 minuten met ultrasone trillingen.
Beelden van atoomkrachtmicroscopie (AFM) bevestigden dat fibrillen gegenereerd met 10 minuten ultrasoon om de 15 minuten morfologisch niet te onderscheiden waren van de fibrillen die gevormd werden met 1 minuut ultrasoon om de 10 minuten. Dit benadrukt de reproduceerbaarheid en robuustheid van ultrasoon geïnduceerde amyloïde fibrillatie.

AFM beelden van amyloïde fibrillen geproduceerd door 1-min ultrasoon elke 10 min (i), door 10-min sonicatie om de 15 min (ii), en door de seeding reactie zonder ultrasoon (iii). De witte schaalbalk vertegenwoordigt 1 micrometer.
Studie en afbeeldingen: ©So et al., 2011

Fibrillatie bij neutrale pH-omstandigheden

Zelfs onder neutrale pH-omstandigheden werd fibrilvorming bereikt na een vertragingstijd van 1,5 uur, waaruit blijkt dat ultrasoonbehandeling de energetische barrière voor nucleatie en groei aanzienlijk verlaagt. Dit ondersteunt verder de hypothese dat amyloïde fibrillatie voornamelijk een fysische reactie is, grotendeels beperkt door de nucleatie-energiebarrière, die ultrasoonbehandeling effectief vermindert.

Impact op onderzoek naar Amyloïde-gerelateerde ziekten

De eenvoudige en betrouwbare vorming van amyloïde fibrillen met behulp van de UIP400MTP microplaat sonicator heeft belangrijke implicaties voor het onderzoek naar de ziekte van Alzheimer (AD) en andere amyloïd-gerelateerde aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson, type II diabetes en systemische amyloïdosen. Bij de ziekte van Alzheimer is de aggregatie van amyloïd-β (Aβ) een belangrijk pathologisch kenmerk, maar het bestuderen van de fibrillatiekinetiek blijft een uitdaging vanwege de lange vertragingsfasen en variabiliteit in conventionele methoden. Ultrasoon gestuurde fibrilvorming versnelt de nucleatie en zorgt voor een hoge reproduceerbaarheid en verminderde variabiliteit, wat cruciaal is voor het screenen van potentiële remmers en het begrijpen van amyloïdmechanismen. Bovendien maakt de hoge doorvoercapaciteit van de UIP400MTP grootschalig onderzoek mogelijk naar eiwitmisvouwing en -aggregatie, waardoor het gemakkelijker wordt om therapeutische middelen te ontdekken die de fibrilvorming kunnen moduleren en mogelijk de neurodegeneratieve progressie kunnen beperken.

Dit onderzoek toont aan dat ultrasone trillingen met behulp van de UIP400MTP sonicator voor meerdere putjes een zeer efficiënte methode is om de vorming van amyloïde fibrillen te versnellen. De belangrijkste voordelen van deze aanpak zijn:

• Dramatische vermindering van de wachttijd voor fibrillatie.
• Gelijkmatige blootstelling aan ultrageluid in alle wells, waardoor reproduceerbare fibrilvorming mogelijk is.
• Screening met hoge doorvoercapaciteit, waardoor het geschikt is voor genoombrede onderzoeken naar amyloïdogeniciteit van eiwitten.

Door de integratie van ultrasone trillingen met ThT fluorescentie detectie, deze methode biedt een snelle, schaalbare en betrouwbare platform voor het bestuderen van amyloïde fibrillatie. Gezien de efficiëntie en het hoge doorvoerpotentieel kan deze aanpak de eenvoudige synthese van amyloïde fibrillen voor biofysisch en farmaceutisch onderzoek vergemakkelijken en een veelbelovend hulpmiddel bieden voor amyloïde-gerelateerde studies en het screenen van medicijnen.