Vorming van amyloïdfibrillen met de sonicator UIP400MTP voor microplaten

Amyloïdfibrillen ontstaan, net als kristallen, door een proces van nucleatie en daaropvolgende groei. Door de hoge vrije-energiebarrière voor nucleatie vindt spontane vorming van amyloïdfibrillen echter pas na een langdurige lagfase plaats. Sonicatie is uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel om amyloïdnucleatie te induceren en zo de vorming van fibrillen aanzienlijk te versnellen. In combinatie met een microplaatlezer die gebruikmaakt van thioflavine T (ThT)-fluorescentie maakt sonicatie de gelijktijdige detectie van amyloïdfibrillen in meerdere monsters met een hoge verwerkingscapaciteit mogelijk.

Ultrasoon geïnduceerde vorming van amyloïdfibrillen met de sonicator UIP400MTP voor microplaten

Met de sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten kunnen amyloïdfibrillen van dezelfde kwaliteit snel in grote hoeveelheden worden gesynthetiseerd voor onderzoeksdoeleinden. Deze efficiënte aanpak maakt het mogelijk de amyloïdogeniciteit van eiwitten te bestuderen. Deze techniek maakt snelle en reproduceerbare amyloïdfibrillatie mogelijk, zoals aangetoond met β2-microglobuline (β2-m), een amyloïdogeen eiwit dat verband houdt met dialysegerelateerde amyloïdose.

Eenvoudige experimentele aanpak: ultrasoon geïnduceerde amyloïdfibrillatie

Om fibrilvorming te induceren, werd een microplaat met 96 wells in het midden van de sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten geplaatst, die zorgt voor een uniforme blootstelling aan ultrageluid in alle wells. De experimentele omstandigheden waren als volgt:

1. Elke well bevatte 0,2 ml β2-microglobulineoplossing (0,3 mg/ml, pH 2,5), aangevuld met 5 μM ThT.
2. De plaat werd onderworpen aan sonicatiecycli, zoals 1 minuut sonicatie gevolgd door 9 minuten pauze.
3. Na de sonicatie werd de ThT-fluorescentie gemeten met een microplaatlezer.

(vgl. So et al., 2011)

Vergelijking met conventionele agitatie

Vergeleken met traditionele agitatiemethoden verkortte sonicatie de lagfase van fibrilvorming drastisch. Onder conventionele omstandigheden voor het schudden van microplaten vertoonde slechts 1 van de 10 wells na 20 uur een verhoogde ThT-fluorescentie. Bij toepassing van cyclische sonicatie (15 minuten sonicatie gevolgd door 5 minuten rust) werd daarentegen direct na de eerste sonicatiebehandeling een significante toename van de ThT-fluorescentie gedetecteerd.

Snelle versnelling van de fibrillatiekinetiek

De resultaten van So et al. (2011) toonden aan dat de spontane fibrilvorming van β2-microglobuline bij pH 2,5 met sonicatie kan worden versneld van enkele uren tot slechts 10–15 minuten.
Beelden verkregen met atoomkrachtmicroscopie (AFM) bevestigden dat fibrillen die werden gevormd door elke 15 minuten gedurende 10 minuten sonicatie toe te passen, morfologisch niet te onderscheiden waren van fibrillen die werden gevormd door elke 10 minuten gedurende 1 minuut sonicatie toe te passen. Dit onderstreept de reproduceerbaarheid en robuustheid van ultrasoon geïnduceerde amyloïdfibrillatie.

AFM-beelden van amyloïdfibrillen geproduceerd door elke 10 min gedurende 1 min sonicatie toe te passen (i), door elke 15 min gedurende 10 min sonicatie toe te passen (ii) en door de entreactie zonder sonicatie (iii). De witte schaalbalk geeft 1 μm aan.
Onderzoek en afbeeldingen: ©So et al., 2011

Fibrillatie bij neutrale pH

Zelfs bij neutrale pH werd fibrilvorming bereikt na een lagfase van 1,5 uur, wat aantoont dat sonicatie de energetische barrière voor nucleatie en groei aanzienlijk verlaagt. Dit ondersteunt verder de hypothese dat amyloïdfibrillatie voornamelijk een fysische reactie is die grotendeels wordt beperkt door de energiebarrière voor nucleatie, die door sonicatie effectief wordt verlaagd.

Impact op onderzoek naar amyloïdgerelateerde ziekten

De eenvoudige en betrouwbare vorming van amyloïdfibrillen met de sonicator UIP400MTP voor microplaten heeft belangrijke implicaties voor onderzoek naar de ziekte van Alzheimer (AD) en andere amyloïdgerelateerde aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson, diabetes type II en systemische amyloïdosen. Bij AD is de aggregatie van amyloïd-β (Aβ) een belangrijk pathologisch kenmerk, maar het bestuderen van de fibrillatiekinetiek blijft een uitdaging door de lange lagfasen en de variabiliteit van conventionele methoden. Door sonicatie aangedreven fibrilvorming versnelt de nucleatie en zorgt voor een hoge reproduceerbaarheid en verminderde variabiliteit, wat cruciaal is voor het screenen van potentiële remmers en het begrijpen van amyloïdogene mechanismen. Bovendien maakt de hoge verwerkingscapaciteit van de UIP400MTP grootschalig onderzoek naar verkeerde eiwitvouwing en aggregatie mogelijk. Dit vergemakkelijkt de ontdekking van therapeutische middelen die fibrilvorming kunnen moduleren en mogelijk de voortgang van neurodegeneratie kunnen afremmen.

Dit onderzoek toont aan dat sonicatie met de sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten een zeer efficiënte methode is om de vorming van amyloïdfibrillen te versnellen. De belangrijkste voordelen van deze aanpak zijn:

• Drastische verkorting van de lagfase voor fibrillatie.
• Uniforme blootstelling aan ultrageluid in alle wells, waardoor reproduceerbare fibrilvorming mogelijk is.
• Screeningsmogelijkheden met een hoge verwerkingscapaciteit, waardoor de aanpak geschikt is voor genoombrede zoekacties naar de amyloïdogeniciteit van eiwitten.

Door sonicatie te integreren met detectie van ThT-fluorescentie biedt deze methode een snel, schaalbaar en betrouwbaar platform voor het bestuderen van amyloïdfibrillatie. Dankzij de efficiëntie en het potentieel voor een hoge verwerkingscapaciteit kan deze aanpak de eenvoudige synthese van amyloïdfibrillen voor biofysisch en farmaceutisch onderzoek vergemakkelijken en biedt deze een veelbelovend hulpmiddel voor amyloïdgerelateerd onderzoek en het screenen van geneesmiddelen.