Uzlabojiet HPLC analīzi ar uzticamu paraugu sagatavošanu
Augstas izšķirtspējas šķidrumu hromatogrāfija (HPLC) joprojām ir viena no svarīgākajām analītiskajām metodēm savienojumu identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai sarežģītās matricās. HPLC metodes tiek novērtētas to jutīguma, selektivitātes un reproducējamības dēļ, sākot no farmācijas kvalitātes kontroles līdz vides monitoringam un pārtikas analīzei. Tomēr hromatogrāfisko datu ticamība lielā mērā ir atkarīga no viena būtiska posma - HPLC paraugu sagatavošanas.
Pētījumi un paraugu sagatavošanas rutīnas liecina, ka ekstrakcija un paraugu sagatavošana ar sonikācijas palīdzību ievērojami uzlabo HPLC analīzes efektivitāti, precizitāti un ātrumu. Izmantojot ultraskaņas enerģiju, lai izjauktu matrices un uzlabotu analizējamo vielu pārnesi šķīdinātājos, laboratorijas var iegūt lielāku atgūstamību, īsāku ekstrakcijas laiku un reproducējamākus analīžu rezultātus.
Kāpēc HPLC ir svarīga paraugu sagatavošana
Daudzās analītiskajās darba plūsmās parauga matrica – piemēram, augu materiāls, bioloģiskie audi, augsne vai ūdens. – satur sarežģītus savienojumu maisījumus, kas var traucēt hromatogrāfisko atdalīšanu. Tāpēc ir nepieciešama efektīva parauga sagatavošana, lai izolētu analizējamās vielas, atdalītu traucējošās vielas un koncentrētu mērķa savienojumus pirms ievadīšanas HPLC sistēmā.
Tradicionālās ekstrakcijas metodes bieži vien ir saistītas ar ilgstošām procedūrām, lieliem organisko šķīdinātāju apjomiem un vairākiem attīrīšanas posmiem. Šīs metodes var radīt mainīgumu, palielināt darbības izmaksas un pagarināt kopējo analīzes laiku.
Ultraskaņas paraugu sagatavošana ir efektīva alternatīva. Ar sonikāciju šķidrā vidē tiek ievadīta augstfrekvences akustiskā enerģija, radot mikroskopiskus kavitācijas burbulīšus. Kad šie burbuļi sabrūk, tie rada lokālus bīdes spēkus un mikromaisīšanas efektus, kas izjauc cietās matricas un paātrina masas pārnesi. Šis process ievērojami uzlabo ekstrakcijas efektivitāti.
UIP400MTP augstas caurlaidspējas sonikators ar autosamplera flakonu turētāju mēģenēm
Zinātniskie pierādījumi: Sonikācija uzlabo analītisko veiktspēju
Vairāki recenzēti pētījumi ir pierādījuši ultraskaņas ekstrakcijas priekšrocības HPLC darba procesos.
Piemēram, lai noteiktu karbarila pesticīdu koncentrāciju ūdens paraugos, izstrādātā metode pesticīdu atlieku uzraudzībai izmantoja sonikāciju apvienojumā ar LC-MS/MS analīzi. Izmantojot šo metodi, ūdens paraugus pirms hromatogrāfiskās analīzes ekstrahēja ar acetonitrilu ultraskaņas iedarbībā. Ar šo metodi tika sasniegti labi analītiskie rādītāji, tostarp atgūstamība bija no 89,53 % līdz 101,72 %, kas apliecina paraugu sagatavošanas procedūras ar ultraskaņu precizitāti un uzticamību.
Ultraskaņas ekstrakcijas posms ļāva efektīvi pārnest analizējamās vielas no ūdens matricas uz organisko šķīdinātāju, samazinot šķīdinātāja patēriņu un novēršot nepieciešamību pēc plašām attīrīšanas procedūrām. Apstiprinātā analītiskā metode uzrādīja izcilu linearitāti, precizitāti un kvantitatīvās noteikšanas robežas, uzsverot sonikācijas efektivitāti mūsdienu hromatogrāfijas darba plūsmās. (sk. Roudani et al., 2018)
Citā pētījumā tika ieviesta matricas cietās fāzes dispersija ar ultraskaņas palīdzību (UA-MSPD) oleuropeīna noteikšanai olīvu lapās, izmantojot HPLC analīzi. Izmantojot šo metodi, augu pulveri un sorbenta materiālu sajauca un pēc tam elucijas posmā pakļāva ultraskaņas viļņiem. Ultraskaņa pastiprināja analizējamās vielas desorbciju no sorbenta virsmas, vienlaikus uzlabojot ekstrakciju no parauga matricas. (sk. Rashidipour un Heydari, 2018)
Optimizētā ultraskaņas procedūra nodrošināja būtiskus analītiskus uzlabojumus, tostarp:
- Lineāras kalibrēšanas līknes ar R² = 0,9979
- Noteikšanas robežas līdz 0,03 µg ml-¹
- Atgūšanas rādītāji no 90,2 % līdz 96,7 %.
Šie rezultāti apstiprina, ka ekstrakcija ar ultraskaņas palīdzību ne tikai paātrina parauga sagatavošanu, bet arī palielina ekstrakcijas iznākumu salīdzinājumā ar klasiskajām matricas cietās fāzes dispersijas metodēm.
Zondes tipa sonikators UP200St HPLC paraugu sagatavošanai
Ultraskaņas paraugu sagatavošanas galvenās priekšrocības HPLC vajadzībām
Aizvien plašāku ultraskaņas ekstrakcijas izmantošanu analītiskajās laboratorijās veicina vairāki izmērāmi ieguvumi.
- Augstāka ekstrakcijas efektivitāte
Akustiskā kavitācija sašķeļ cietās matricas un uzlabo šķīdinātāja iekļūšanu. Tas uzlabo analizējamo vielu izdalīšanos un palielina atgūstamības rādītājus, jo īpaši attiecībā uz mikroorganismiem sarežģītos paraugos. - Samazināts paraugu sagatavošanas laiks
Ar ultraskaņas ekstrakciju paraugu sagatavošanu bieži vien var pabeigt dažu sekunžu vai minūšu laikā. Piemēram, optimizētie ultraskaņas ekstrakcijas parametri UA-MSPD panāca efektīvu analizējamo vielu atgūšanu aptuveni 30 sekunžu sonikācijas laikā, parādot, cik ievērojami var paātrināt analīzes darba procesu. - Mazāks šķīdinātāju patēriņš
Tā kā ultraskaņa uzlabo masas pārnesi, parasti ir nepieciešami mazāki šķīdinātāja tilpumi. Samazināts šķīdinātāju patēriņš uzlabo laboratorijas ilgtspēju un samazina ekspluatācijas izmaksas. - Uzlabota reproducējamība
Vienmērīgs ultraskaņas enerģijas sadalījums nodrošina konsekventu parauga izjaukšanu un ekstrakciju visos atkārtojumos, tādējādi uzlabojot analītisko mērījumu precizitāti. - Savietojamība ar mūsdienu hromatogrāfijas metodēm
Ultraskaņas ekstrakcija ir viegli integrējama ar HPLC, UHPLC un LC-MS sistēmām, padarot to piemērotu augstas veiktspējas analītiskajām vidēm.
Fenola savienojumu HPLC hromatogramma no ultrasoniski izolēta Annona muricata ekstrakta, izmantojot ultrasonicator UP400S.
(Pētījums un grafika: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktiski sonikācijas risinājumi HPLC paraugu sagatavošanai
Hielscher sonikatori nodrošina precīzu ultraskaņas ekstrakcijas parametru, piemēram, amplitūdas, laika un impulsa režīma, kontroli laboratorijās, kurās tiek veikta ultraskaņas ekstrakcija. Tāpēc Hielscher laboratorijas sonikatori ir īpaši piemēroti analītiskajām laboratorijām.
Izvēlieties vispiemērotāko sonikatoru saviem HPLC paraugiem
| Sonicator modelis | HPLC priekšrocības | Labākais pielietojums HPLC paraugu sagatavošanā |
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator |
- Vienlaicīga līdz pat 10 aizzīmogotu flakonu sonikācija ar vienādu ultraskaņas enerģiju. - Sterils: nav krusteniskās kontaminācijas, jo paraugi paliek slēgti. - Ļoti reproducējami ekstrakcijas apstākļi dažādās partijās - Efektīva kavitācija maza tilpuma analītiskiem paraugiem |
- Vides, pārtikas vai farmācijas paraugu sagatavošana ar lielu jaudu - Analizējamās vielas ekstrakcija pirms HPLC, UHPLC vai LC-MS analīzes. - Standartizētas darba plūsmas, kas prasa identisku vairāku paraugu apstrādi. |
| Mikroplates sonikators UIP400MTP |
- Bezkontakta sonikācija veselām mikroplatēm (96 iedobju, 384 iedobju formāti). - Vienmērīgs ultraskaņas enerģijas sadalījums visos urbumos - Iespēja automatizēt un robotizēti integrēt analītiskās darba plūsmas. - Augsta caurlaides spēja ar precīzu amplitūdas un sonikācijas laika kontroli |
- Augstas veiktspējas UHPLC skrīninga darba plūsmas - Farmaceitisko savienojumu bibliotēkas un metabolomikas paraugu sagatavošana - Ekstrakcija uz plākšņu bāzes LC-MS vai UHPLC analītiskajiem cauruļvadiem |
| Laboratorijas sonikatori ar mikrouzgaļiem (tieša sonikācija) |
- Maksimāla ultraskaņas intensitāte efektīvai matricas izjaukšanai - Ļoti ātra analizējamo vielu ekstrakcija no cietiem, viskoziem vai neviendabīgiem paraugiem. - Regulējama amplitūda un impulsu parametri optimizētiem ekstrakcijas apstākļiem - Augsta kavitācijas enerģija uzlabo analizējamo vielu atgūšanu un ekstrakcijas efektivitāti. |
- Ekstrakcija no sarežģītām matricām, piemēram, augu audiem, pārtikas paraugiem vai polimēriem. - Homogenizācija pirms SPE, filtrēšanas vai ekstrakcijas šķidrums-šķidrums - Ultraskaņas HPLC paraugu sagatavošanas metodes izstrāde |
| Cuphorn (“augstas intensitātes vanna” spainīšiem un mēģenēm) |
- Netiešā sonikācija novērš zondes piesārņojumu - Vienmērīgs ultraskaņas lauks vairākām caurulēm vienlaicīgi - Ideāli piemērots steriliem, bīstamiem vai gaistošiem paraugiem, kuriem jābūt aizzīmogotiem. - Vienkāršota apstrāde, vienlaikus saglabājot spēcīgu kavitācijas enerģiju. |
- Vairāku HPLC paraugu paralēla ekstrakcija noslēgtās centrifūgas mēģenēs - Bioloģisko, farmaceitisko vai vides paraugu sagatavošana - Darba plūsmas, kurās nepieciešama netieša sonikācija bez piesārņojuma |
Zinātniskā nozīme analītiskajā ķīmijā
Tā kā analītiskā ķīmija virzās uz ātrāku un ilgtspējīgāku laboratorijas praksi, ultraskaņas paraugu sagatavošana ir kļuvusi par spēcīgu palīgtehnoloģiju. Sonikācija palīdz izstrādāt ātras analītiskās metodes ar mazāku šķīdinātāju patēriņu, uzlabotu ekstrakcijas efektivitāti un stabiliem validācijas parametriem.
Arvien vairāk literatūras par ekstrakciju ar ultraskaņu liecina, ka HPLC paraugu sagatavošana ar sonikācijas palīdzību nav tikai ērtība. – tā ir zinātniski apstiprināta pieeja, kas uzlabo analītisko veiktspēju. Apvienojot ultraskaņas ekstrakciju ar modernām hromatogrāfijas metodēm, laboratorijas var panākt uzticamu analītu pēdu noteikšanu arvien sarežģītākās paraugu matricās.
Sonikācijas uzlabotas HPLC darba plūsmas
Nepārtraukti attīstoties analītiskajiem instrumentiem un paraugu sagatavošanas tehnoloģijām, ultraskaņas ekstrakcijai hromatogrāfijas laboratorijās, visticamāk, būs vēl lielāka nozīme. Tās spēja racionalizēt darba procesus, uzlabot datu kvalitāti un samazināt ietekmi uz vidi labi atbilst mūsdienu analītiskās zinātnes mainīgajām prasībām.
Analītiskās ķīmijas speciālistiem un rūpnieciskajām laboratorijām, kas vēlas optimizēt HPLC paraugu sagatavošanu, ultraskaņas ekstrakcija piedāvā pārbaudītu, mērogojamu un zinātniski pamatotu risinājumu. Integrējot sonikāciju ikdienas paraugu sagatavošanas protokolos, laboratorijas var ievērojami uzlabot hromatogrāfiskās analīzes efektivitāti un uzticamību.
Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Kvalitāte ražots Vācijā
Hielscher ultrasonikatori ir labi pazīstami ar saviem augstākajiem kvalitātes un dizaina standartiem. Robustums un viegla darbība ļauj vienmērīgi integrēt mūsu ultrasonikatorus rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultrasonikatori viegli apstrādā neapstrādātus apstākļus un prasīgu vidi.
Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums un īpašu uzsvaru liek uz augstas veiktspējas ultrasonikatoriem, kas piedāvā vismodernākās tehnoloģijas un lietotājdraudzīgumu. Protams, Hielscher ultrasonikatori atbilst CE prasībām un atbilst UL, CSA un RoHs prasībām.
Literatūra / Atsauces
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Biežāk uzdotie jautājumi
Kas ir HPLC?
Augstas izšķirtspējas šķidrumu hromatogrāfija (HPLC) ir analītiska atdalīšanas metode, ko izmanto maisījuma sastāvdaļu identificēšanai, kvantitatīvai noteikšanai un attīrīšanai. HPLC šķidrā kustīgajā fāzē izšķīdušās analizējamās vielas tiek izvadītas caur kolonnu, kas pildīta ar stacionāro fāzi zem augsta spiediena. Analizējamo vielu, stacionārās fāzes un mobilās fāzes mijiedarbības atšķirības izraisa savienojumu atdalīšanos, tiem pārvietojoties pa kolonnu. Atdalītos savienojumus mēra ar tādiem detektoriem kā UV-Vis, fluorescences vai masas spektrometrija, kas ļauj veikt precīzu kvalitatīvu un kvantitatīvu analīzi.
Kādi ir šķidrumu hromatogrāfijas veidi?
Šķidrumu hromatogrāfiju var klasificēt atkarībā no izmantotā atdalīšanas mehānisma starp analizējamo vielu, stacionāro fāzi un mobilo fāzi. Visbiežāk sastopamie veidi ir apgrieztās fāzes hromatogrāfija, kurā nepolāra stacionārā fāze atdala savienojumus, pamatojoties uz hidrofobu mijiedarbību; normālās fāzes hromatogrāfija, kurā izmanto polāro stacionāro fāzi un atdala savienojumus atkarībā no polaritātes; jonu apmaiņas hromatogrāfija, kurā uzlādētas stacionārās fāzes atdala analizējamās vielas, pamatojoties uz jonu mijiedarbību; un izmēru izslēdzošā hromatogrāfija, kurā molekulas atdala atkarībā no to hidrodinamiskā lieluma un molekulmasas. Papildu specializētās metodes ir afinitātes hromatogrāfija un hidrofilās mijiedarbības hromatogrāfija (HILIC), kas ir vērstas uz specifiskām molekulārām mijiedarbībām vai polāriem savienojumiem.
Kādas flakonus izmanto HPLC?
HPLC analīzēs parasti izmanto nelielas stikla vai polimēra flakonus, kas paredzēti sagatavoto paraugu uzglabāšanai pirms ievadīšanas hromatogrāfiskajā sistēmā. Visizplatītākais formāts ir 2 ml autosamplera flakons, kas ir saderīgs ar lielāko daļu HPLC autosampleru. Šīs flakoni parasti ir izgatavoti no borsilikāta stikla, lai nodrošinātu ķīmisko izturību un minimālu mijiedarbību ar šķīdinātājiem un analizējamām vielām. Atkarībā no parauga veida flakonos var būt ieliktņi maza tilpuma paraugiem, aizskrūvējams vāciņš vai krimpisks vāciņš, kā arī starpsienas, kas izgatavotas no tādiem materiāliem kā PTFE/silikons, lai saglabātu parauga integritāti.
Kas ir autosamplera flakoni?
Autosamplera flakoni ir specializēti paraugu konteineri, kas paredzēti automātiskajām iesmidzināšanas sistēmām HPLC un UHPLC instrumentos. Tās satur sagatavotu parauga šķīdumu un tiek ievietotas instrumenta autosamplera paplātē, kur sistēma automātiski paņem noteiktu tilpumu injekcijai hromatogrāfiskajā kolonnā. Autosamplera flakoniem ir precīzi izmēri, lai nodrošinātu savietojamību ar robotizētām paraugu ņemšanas adatām un līdz minimumam samazinātu parauga iztvaikošanu, piesārņojumu vai adsorbciju. To konstrukcija nodrošina reproducējamu, augstas veiktspējas analīzi modernās hromatogrāfijas laboratorijās.
Kādi ir HPLC posmi?
Augstas izšķirtspējas šķidrumu hromatogrāfijas (HPLC) tipiskais darba process sastāv no vairākiem secīgiem soļiem, kas nodrošina drošu analītu atdalīšanu un noteikšanu.
- Vispirms veic parauga sagatavošanu, lai izšķīdinātu analizējamo vielu, atdalītu daļiņas un bieži vien no parauga matricas ekstrahētu vai koncentrētu mērķa savienojumus. Šis posms var ietvert filtrēšanu, atšķaidīšanu vai ekstrakcijas paņēmienus, piemēram, ekstrakciju ar ultraskaņu, cietās fāzes ekstrakciju vai ekstrakciju šķidrums-šķidrums.
- Pēc tam sagatavoto paraugu ievieto HPLC flakonā un ievieto autosamplerī. Autosamplers ievada precīzu parauga tilpumu plūstošajā mobilajā fāzē.
- Pēc tam mobilās fāzes padeves posmā iesmidzinātais paraugs tiek transportēts caur sistēmu, izmantojot augstspiediena sūkni. Mobilajā fāzē analizējamās vielas caur hromatogrāfisko kolonnu tiek pārvadītas ar kontrolētu plūsmas ātrumu.
- Hromatogrāfijas kolonnas iekšpusē notiek atdalīšana. Kolonna satur stacionāro fāzi, parasti pildītas daļiņas ar noteiktām ķīmiskām īpašībām. Analītēm pārvietojoties pa kolonnu, tās atšķirīgi mijiedarbojas ar stacionāro fāzi un mobilo fāzi, izraisot to eluēšanu dažādos laikos.
- Pēc atdalīšanas savienojumi iziet caur detektoru, piemēram, UV-Vis, fluorescences vai masspektrometrijas detektoru. Detektors mēra eluējošo savienojumu klātbūtni un koncentrāciju un pārvērš signālu elektroniskos datos.
- Visbeidzot, datu iegūšana un analīze tiek veikta, izmantojot hromatogrāfijas programmatūru. Sistēma ģenerē hromatogrammu, kurā pīķi atbilst atsevišķiem savienojumiem. Maksimumu aiztures laiki palīdz identificēt analizējamās vielas, savukārt maksimumu laukumi vai augstumi ļauj kvantitatīvi noteikt to koncentrāciju.
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no Lab līdz rūpnieciskais izmērs.