Uzlabojiet HPLC analīzi ar uzticamu paraugu sagatavošanu
Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC) joprojām ir viena no svarīgākajām analītiskajām metodēm savienojumu identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai sarežģītās matricās. HPLC metodes tiek augstu vērtētas to jutības, selektivitātes un reproducējamības dēļ gan farmaceitisko produktu kvalitātes kontrolē, gan vides monitoringā un pārtikas analīzē. Tomēr hromatogrāfisko datu uzticamība lielā mērā ir atkarīga no viena izšķiroša posma: paraugu sagatavošanas HPLC analīzei.
Pētījumi un ikdienas paraugu sagatavošanas prakse liecina, ka ekstrakcija un paraugu sagatavošana ar ultraskaņas palīdzību būtiski uzlabo HPLC analīzes efektivitāti, pareizību un ātrumu. Izmantojot ultraskaņas enerģiju matricu sagraušanai un analītu pārejas veicināšanai šķīdinātājos, laboratorijas var panākt augstāku atgūstamību, īsāku ekstrakcijas laiku un reproducējamākus analīžu rezultātus.
Kāpēc paraugu sagatavošana ir svarīga HPLC analīzē
Daudzās analītiskajās darbplūsmās parauga matrica – piemēram, augu materiāls, bioloģiskie audi, augsne vai ūdens – satur sarežģītus savienojumu maisījumus, kas var traucēt hromatogrāfisko atdalīšanu. Tāpēc pirms ievadīšanas HPLC sistēmā ir nepieciešama efektīva paraugu sagatavošana, lai izolētu analītus, atdalītu traucējošās vielas un koncentrētu mērķsavienojumus.
Tradicionālās ekstrakcijas metodes bieži ietver laikietilpīgas procedūras, lielus organisko šķīdinātāju tilpumus un vairākus attīrīšanas posmus. Šīs metodes var radīt mainīgumu, palielināt darbības izmaksas un pagarināt kopējo analīzes laiku.
Paraugu sagatavošana ar ultraskaņu piedāvā efektīvu alternatīvu. Apstrāde ar ultraskaņu ievada šķidrā vidē augstfrekvences akustisko enerģiju, radot mikroskopiskus kavitācijas burbuļus. Šiem burbuļiem sabrūkot, rodas lokāli bīdes spēki un mikrosajaukšanās efekti, kas sagrauj cietās matricas un paātrina masas pārnesi. Šis process ievērojami uzlabo ekstrakcijas efektivitāti.
Ultraskaņas ierīce UIP400MTP lielam paraugu apstrādes ražīgumam ar statīvu automātiskā paraugu padevēja flakoniem
Zinātniskie pierādījumi: apstrāde ar ultraskaņu uzlabo analītiskos raksturlielumus
Vairāki recenzēti pētījumi ir pierādījuši ultraskaņas ekstrakcijas priekšrocības HPLC darbplūsmās.
Piemēram, metodē, kas izstrādāta pesticīdu atlieku monitoringam ūdens paraugos, karbarila pesticīda koncentrācijas noteikšanai tika izmantota apstrāde ar ultraskaņu apvienojumā ar LC–MS/MS analīzi. Šajā pieejā ūdens paraugi pirms hromatogrāfiskās analīzes tika ekstrahēti ar acetonitrilu, veicot apstrādi ar ultraskaņu. Metode nodrošināja augstus analītiskos raksturlielumus, tostarp atgūstamību no 89,53% līdz 101,72%, apstiprinot paraugu sagatavošanas ar ultraskaņu procedūras pareizību un uzticamību.
Ultraskaņas ekstrakcijas posms nodrošināja efektīvu analītu pāreju no ūdens matricas organiskajā šķīdinātājā, samazinot šķīdinātāja patēriņu un novēršot nepieciešamību pēc apjomīgām attīrīšanas procedūrām. Validētā analītiskā metode uzrādīja izcilu linearitāti, precizitāti un kvantitatīvās noteikšanas robežas, uzsverot apstrādes ar ultraskaņu efektivitāti mūsdienu hromatogrāfiskajās darbplūsmās. (sal. Roudani et al., 2018)
Citā pētījumā oleuropeīna noteikšanai olīvkoka lapās ar HPLC analīzi tika ieviesta matricas cietfāzes dispersija ar ultraskaņas palīdzību (UA-MSPD). Šajā metodē augu pulveris un sorbenta materiāls tika sajaukti un pēc tam eluēšanas posmā pakļauti ultraskaņas viļņu iedarbībai. Ultraskaņa veicināja analītu desorbciju no sorbenta virsmas, vienlaikus uzlabojot ekstrakciju no parauga matricas. (sal. Rashidipour un Heydari, 2018)
Optimizētā ultraskaņas procedūra nodrošināja būtiskus analītiskos uzlabojumus, tostarp:
- Lineāras kalibrēšanas līknes ar R² = 0,9979
- Noteikšanas robežas līdz pat 0,03 µg mL⁻¹
- Atgūstamība no 90,2% līdz 96,7%
Šie rezultāti apstiprina, ka ekstrakcija ar ultraskaņas palīdzību ne tikai paātrina paraugu sagatavošanu, bet arī palielina ekstrakcijas iznākumu salīdzinājumā ar klasiskajām matricas cietfāzes dispersijas metodēm.
Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīce UP200St HPLC paraugu sagatavošanai
Galvenās priekšrocības paraugu sagatavošanai ar ultraskaņu HPLC analīzei
Ultraskaņas ekstrakcijas arvien plašāku izmantošanu analītiskajās laboratorijās veicina vairākas izmērāmas priekšrocības.
- Augstāka ekstrakcijas efektivitāte
Akustiskā kavitācija sagrauj cietās matricas un uzlabo šķīdinātāja iespiešanos tajās. Tas veicina analītu atbrīvošanos un palielina atguves rādītājus, īpaši savienojumiem, kas sarežģītos paraugos ir sastopami zīmes daudzumos. - Īsāks paraugu sagatavošanas laiks
Ar ultraskaņas ekstrakciju paraugu sagatavošanu bieži var pabeigt dažu sekunžu vai minūšu laikā. Piemēram, optimizēti ultraskaņas ekstrakcijas parametri UA-MSPD metodē ļāva panākt efektīvu analītu atguvi aptuveni 30 sekunžu ilgas apstrādes ar ultraskaņu laikā, parādot, cik ievērojami var paātrināt analīzes darbplūsmas. - Mazāks šķīdinātāju patēriņš
Tā kā ultraskaņa uzlabo masas pārnesi, parasti ir nepieciešami mazāki šķīdinātāju tilpumi. Mazāks šķīdinātāju patēriņš uzlabo laboratorijas ilgtspēju un samazina darbības izmaksas. - Uzlabota reproducējamība
Vienmērīgs ultraskaņas enerģijas sadalījums nodrošina vienādu paraugu struktūras sagraušanu un ekstrakciju atkārtojumos, uzlabojot analītisko mērījumu precizitāti. - Saderība ar mūsdienīgām hromatogrāfijas metodēm
Ultraskaņas ekstrakcija ir viegli integrējama HPLC, UHPLC un LC-MS sistēmās, tādēļ tā ir piemērota analītiskajām laboratorijām ar lielu paraugu apstrādes caurlaidspēju.
Ar ultraskaņas apstrādes ierīci UP400S izdalīta Annona muricata lapu ekstrakta fenolu savienojumu HPLC hromatogramma.
(Pētījums un attēls: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktiski risinājumi apstrādei ar ultraskaņu HPLC paraugu sagatavošanā
Laboratorijām, kas ievieš ultraskaņas ekstrakciju, Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces nodrošina precīzu tādu parametru kontroli kā amplitūda, laiks un impulsu režīms. Tādēļ Hielscher laboratorijas ultraskaņas apstrādes ierīces ir īpaši piemērotas analītiskajām laboratorijām.
Izvēlieties saviem HPLC paraugiem vispiemērotāko laboratorijas ultraskaņas apstrādes ierīci
| Ultraskaņas apstrādes ierīces modelis | Priekšrocības HPLC analīzei | Vispiemērotākais lietojums HPLC paraugu sagatavošanā |
| Daudzmēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīce VialTweeter |
• Vienlaicīga līdz pat 10 hermētiski noslēgtu flakonu apstrāde ar vienādu ultraskaņas enerģiju • Sterila apstrāde: nav savstarpējas piesārņošanās, jo paraugi paliek noslēgti • Ļoti labi reproducējami ekstrakcijas apstākļi dažādās partijās • Efektīva kavitācija maza tilpuma analītiskajiem paraugiem |
• Vides, pārtikas vai farmaceitisko paraugu sagatavošana ar lielu paraugu apstrādes caurlaidspēju • Analītu ekstrakcija zīmes daudzumos pirms HPLC, UHPLC vai LC-MS analīzes • Standartizētas darbplūsmas, kurās nepieciešama vienāda vairāku paraugu apstrāde |
| Mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP |
• Veselu mikroplašu bezkontakta apstrāde ar ultraskaņu (96 iedobju un 384 iedobju formāti) • Vienmērīgs ultraskaņas enerģijas sadalījums visās iedobēs • Nodrošina automatizācijas un robotizācijas integrēšanu analītiskajās darbplūsmās • Liela paraugu apstrādes caurlaidspēja ar precīzu amplitūdas un ultraskaņas apstrādes laika kontroli |
• UHPLC skrīninga darbplūsmas ar lielu paraugu apstrādes caurlaidspēju • Farmaceitisko savienojumu bibliotēkas un metabolomikas paraugu sagatavošana • Ekstrakcija platēs LC-MS vai UHPLC analītisko procesu ķēdēm |
| Laboratorijas ultraskaņas apstrādes ierīces ar mikrouzgali (tieša apstrāde ar ultraskaņu) |
• Maksimāla ultraskaņas intensitāte efektīvai matricas sagraušanai • Ļoti ātra analītu ekstrakcija no cietiem, viskoziem vai neviendabīgiem paraugiem • Regulējama amplitūda un impulsu parametri optimizētiem ekstrakcijas apstākļiem • Augsta kavitācijas enerģija uzlabo analītu atguvi un ekstrakcijas iznākumu |
• Ekstrakcija no sarežģītām matricām, piemēram, augu audiem, pārtikas paraugiem vai polimēriem • Homogenizācija pirms SPE, filtrēšanas vai šķidruma–šķidruma ekstrakcijas • Metožu izstrāde HPLC paraugu sagatavošanai ar ultraskaņu |
| CupHorn (“augstas intensitātes vanna” vārglāzēm un mēģenēm) |
• Netieša apstrāde ar ultraskaņu novērš zondes piesārņošanos • Vienmērīgs ultraskaņas lauks vairākām mēģenēm vienlaikus • Ideāli piemērota steriliem, bīstamiem vai gaistošiem paraugiem, kuriem jāpaliek hermētiski noslēgtiem • Vienkāršo darbu ar paraugiem, vienlaikus saglabājot augstu kavitācijas enerģiju |
• Vairāku HPLC paraugu paralēla ekstrakcija hermētiski noslēgtās centrifūgas mēģenēs • Bioloģisko, farmaceitisko vai vides paraugu sagatavošana • Darbplūsmas, kurās nepieciešama netieša apstrāde ar ultraskaņu bez piesārņojuma |
Zinātniskā nozīme analītiskajā ķīmijā
Analītiskajai ķīmijai virzoties uz ātrākām un ilgtspējīgākām laboratorijas darba metodēm, paraugu sagatavošana ar ultraskaņu ir kļuvusi par jaudīgu tehnoloģiju, kas paver jaunas iespējas. Apstrāde ar ultraskaņu veicina ātru analītisko metožu izstrādi ar mazāku šķīdinātāju patēriņu, uzlabotu ekstrakcijas efektivitāti un stabiliem validācijas parametriem.
Arvien plašākais literatūras klāsts par ultraskaņas ekstrakciju apliecina, ka HPLC paraugu sagatavošana ar ultraskaņas palīdzību nav tikai ērtības jautājums – tā ir zinātniski validēta pieeja, kas uzlabo analītisko veiktspēju. Apvienojot ultraskaņas ekstrakciju ar mūsdienīgām hromatogrāfijas metodēm, laboratorijas var panākt uzticamu analītu noteikšanu pēdu koncentrācijās arvien sarežģītākās paraugu matricās.
Ar ultraskaņas apstrādi uzlabotas HPLC darbplūsmas
Nepārtraukti pilnveidojoties analītiskajai aparatūrai un paraugu sagatavošanas tehnoloģijām, ultraskaņas ekstrakcijai, visticamāk, būs vēl lielāka nozīme hromatogrāfijas laboratorijās. Tās spēja racionalizēt darbplūsmas, uzlabot datu kvalitāti un samazināt ietekmi uz vidi labi atbilst mūsdienu analītiskās zinātnes mainīgajām prasībām.
Analītiskās ķīmijas speciālistiem un rūpnieciskajām laboratorijām, kas vēlas optimizēt HPLC paraugu sagatavošanu, ultraskaņas ekstrakcija piedāvā pārbaudītu, mērogojamu un zinātniski pamatotu risinājumu. Iekļaujot apstrādi ar ultraskaņu ikdienas paraugu sagatavošanas protokolos, laboratorijas var būtiski uzlabot gan hromatogrāfiskās analīzes efektivitāti, gan uzticamību.
Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Vācijā radīta kvalitāte
Hielscher ultraskaņas ierīces ir plaši pazīstamas ar visaugstākajiem kvalitātes un projektēšanas standartiem. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas ierīces netraucēti integrēt rūpnieciskajās ražotnēs. Hielscher ultraskaņas ierīces viegli tiek galā ar skarbiem apstākļiem un prasīgu darba vidi.
Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas ierīcēm ar vismodernākajām tehnoloģijām un ērtu lietošanu. Protams, Hielscher ultraskaņas ierīces atbilst CE prasībām un izpilda UL, CSA un RoHs prasības.
Literatūra / Atsauces
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Bieži uzdotie jautājumi
Kas ir HPLC?
Augstas efektivitātes šķidruma hromatogrāfija (HPLC) ir analītiska atdalīšanas metode, ko izmanto maisījuma sastāvdaļu identificēšanai, kvantitatīvai noteikšanai un attīrīšanai. HPLC procesā šķidra kustīgā fāze augstā spiedienā pārnes izšķīdušos analītus caur kolonnu, kas pildīta ar stacionāro fāzi. Analītu, stacionārās fāzes un kustīgās fāzes savstarpējās mijiedarbības atšķirības izraisa savienojumu atdalīšanos, tiem pārvietojoties caur kolonnu. Detektori, piemēram, UV-Vis, fluorescences vai masspektrometrijas detektori, mēra atdalītos savienojumus, ļaujot veikt precīzu kvalitatīvu un kvantitatīvu analīzi.
Kādi ir šķidruma hromatogrāfijas veidi?
Šķidruma hromatogrāfiju var klasificēt pēc atdalīšanas mehānisma, kura pamatā ir analīta, stacionārās fāzes un kustīgās fāzes mijiedarbība. Visizplatītākie veidi ir apgrieztās fāzes hromatogrāfija, kurā nepolāra stacionārā fāze atdala savienojumus, balstoties uz hidrofobu mijiedarbību; normālās fāzes hromatogrāfija, kurā izmanto polāru stacionāro fāzi un savienojumus atdala pēc polaritātes; jonu apmaiņas hromatogrāfija, kurā lādētas stacionārās fāzes atdala analītus, balstoties uz jonu mijiedarbību; un izmēru izslēgšanas hromatogrāfija, kas atdala molekulas pēc to hidrodinamiskā izmēra un molekulmasas. Papildu specializētās metodes ietver afinitātes hromatogrāfiju un hidrofilās mijiedarbības hromatogrāfiju (HILIC), kuru mērķis ir izmantot specifisku molekulāro mijiedarbību vai atdalīt polārus savienojumus.
Kādus flakonus izmanto HPLC?
HPLC analīzēs parasti izmanto nelielus stikla vai polimēra flakonus, kas paredzēti sagatavoto paraugu glabāšanai pirms ievadīšanas hromatogrāfijas sistēmā. Visizplatītākais formāts ir 2-mL automātiskā paraugu ievadītāja flakons, kas ir saderīgs ar lielāko daļu HPLC automātisko paraugu ievadītāju. Šos flakonus parasti izgatavo no borsilikāta stikla, lai nodrošinātu ķīmisko izturību un minimālu mijiedarbību ar šķīdinātājiem un analizējamām vielām. Atkarībā no parauga veida flakoni var būt aprīkoti ar ieliktņiem maza tilpuma paraugiem, aizskrūvējamiem vai aizvalcējamiem vāciņiem un septām, kas izgatavotas no tādiem materiāliem kā PTFE/silikons, lai saglabātu parauga integritāti.
Kas ir automātisko paraugu ievadītāju flakoni?
Automātisko paraugu ievadītāju flakoni ir specializēti paraugu trauki, kas paredzēti HPLC un UHPLC instrumentu automatizētajām ievadīšanas sistēmām. Tajos iepilda sagatavoto parauga šķīdumu un ievieto instrumenta automātiskā paraugu ievadītāja paplātē, kur sistēma automātiski paņem noteiktu tilpumu ievadīšanai hromatogrāfijas kolonnā. Automātisko paraugu ievadītāju flakonus izgatavo ar precīziem izmēriem, lai nodrošinātu saderību ar robotizētām paraugu ņemšanas adatām un samazinātu parauga iztvaikošanu, piesārņošanu vai adsorbciju. To konstrukcija ļauj mūsdienu hromatogrāfijas laboratorijās veikt reproducējamas analīzes ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu.
Kādi ir HPLC posmi?
Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) tipiskā darbplūsma sastāv no vairākiem secīgiem posmiem, kas nodrošina uzticamu analizējamo vielu atdalīšanu un detektēšanu.
- Vispirms veic parauga sagatavošanu, lai izšķīdinātu analizējamo vielu, atdalītu cietās daļiņas un bieži arī ekstrahētu vai koncentrētu mērķsavienojumus no parauga matricas. Šis posms var ietvert filtrēšanu, atšķaidīšanu vai tādas ekstrakcijas metodes kā ultraskaņas ekstrakcija, cietās fāzes ekstrakcija vai šķidruma–šķidruma ekstrakcija.
- Pēc tam sagatavoto paraugu iepilda HPLC flakonā un ievieto automātiskajā paraugu ievadītājā. Automātiskais paraugu ievadītājs ievada precīzu parauga tilpumu plūstošajā kustīgajā fāzē.
- Pēc tam kustīgās fāzes padeves posmā ievadīto paraugu pārvieto cauri sistēmai, izmantojot augstspiediena sūkni. Kustīgā fāze nes analizējamās vielas cauri hromatogrāfijas kolonnai ar kontrolētu plūsmas ātrumu.
- Hromatogrāfijas kolonnas iekšpusē notiek atdalīšana. Kolonnā ir nekustīgā fāze, parasti blīvi iepildītas daļiņas ar noteiktām ķīmiskajām īpašībām. Analizējamām vielām pārvietojoties cauri kolonnai, tās atšķirīgi mijiedarbojas ar nekustīgo fāzi un kustīgo fāzi, tādēļ tās eluējas dažādos laikos.
- Pēc atdalīšanas savienojumi plūst caur detektoru, piemēram, UV-Vis, fluorescences vai masspektrometrisko detektoru. Detektors nosaka eluējošo savienojumu klātbūtni un koncentrāciju un pārveido signālu elektroniskos datos.
- Visbeidzot veic datu iegūšanu un analīzi, izmantojot hromatogrāfijas programmatūru. Sistēma izveido hromatogrammu, kurā pīķi atbilst atsevišķiem savienojumiem. Pīķu aiztures laiki palīdz identificēt analizējamās vielas, savukārt pīķu laukumi vai augstumi ļauj kvantitatīvi noteikt to koncentrāciju.
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no laboratorijas mēroga līdz rūpnieciskam mērogam.