Ģenētiskā transformācija augu šūnās, izmantojot ultrasoniku

Ultraskaņas atbalstītā agrobaktēriju mediētā transformācija (SAAT) ir efektīva metode, lai inficētu augu šūnas ar svešiem gēniem, izmantojot Agrobacterium kā transportieri. Ultraskaņas kavitācija izraisa sonoporāciju, ko var raksturot kā mērķtiecīgu augu audu mikrobrūci. Izmantojot šos ultrasoniski radītos mikro brūces, DNS un DNS vektorus var efektīvi transportēt šūnu matricā.

sonoporācija – Ultrasoniski uzlabota šūnu transformācija

Ja šūnu suspensijām tiek piemērota zemas frekvences ultraskaņa (aptuveni 20 kHz), akustiskās kavitācijas ietekme izraisa pārejošu membrānas caurlaidību šūnu audos. Šis ultraskaņas efekts ir pazīstams kā sonoporācija un tiek izmantots gēnu pārnešanai šūnās vai audos.
Ultrasonication priekšrocības ir balstītas uz tās ne-termisko mehānisko darbības principu, kas padara ultraskaņu bieži daudzpusīgāku un mazāk atkarīgu no šūnu tipiem. Daudzpusīga sonoporācijas pielietošana paver iespēju izmantot transgēnus augus, kuriem ir ievērojams potenciāls sarežģītu cilvēka terapeitisko proteīnu bioražošanā. Ar šādiem augu izcelsmes bioreaktoriem var viegli ģenētiski manipulēt, novērst iespējamo piesārņojumu ar cilvēku patogēniem, nebojāt transformāciju veicinošās baktērijas (piemēram, Agrobacterium) un ir lēta, iedarbīga biosintēzes metode.

Ultraskaņas šūnu transformācija

Ultraskaņas apstrāde ir metode, kas izmanto zemas frekvences ultraskaņas viļņus, lai sajauktu daļiņas šķīdumā, sajauktu šķīdumus, tādējādi palielinot masas pārneses un izšķīšanas ātrumu. Vienlaikus ultraskaņas apstrāde var noņemt izšķīdušās gāzes no šķidrumiem. Augu transformācijā ultraskaņas apstrāde izraisīs mikrobrūču veidošanos uz augu audiem un uzlabos kailas DNS piegādi augu protoplastā.

Ģenētiskai transformācijai vēlamā metode ir ultraskaņas atbalstītā agrobaktēriju mediētā transformācija (SAAT), un tai ir ievērojami augstāka efektivitāte nekā ultraskaņas apstrādei, ko izmanto, lai pārnestu kailus DNS un DNS vektorus tieši protoplastā. Daudzi pētījumi ir parādījuši, ka ultraskaņas atbalstītā agrobaktēriju mediētā transformācija (SAAT) var tikt izmantota, lai izraisītu mehāniskus traucējumus un brūču veidošanos uz augu šūnām ar ultraskaņas viļņiem un no tā izrietošo akustisko kavitāciju. Īsa ultraskaņas apstrāde rada mikro brūces uz eksplantu virsmas. Tā kā ievainotās šūnas ļaus Agrobacterium iekļūt dziļākajā augu audu daļā, tādējādi palielinot augu šūnu inficēšanās iespējamību. Turklāt izdalītie fenola savienojumi uzlabo transformāciju. Ultrasoniski radītās mikro brūces padara baktēriju eksplantāciju iekļūšanu arī iespējamāku. SAAT tika veiksmīgi izmantots ģenētiskai transformācijai augu sugās, kas īpaši tiek uzskatītas par rezistentām pret Agrobacterium.
Tā kā tā ir ļoti vienkārša un lēta metode, kā arī ievērojama Agrobacterium mediētās gēnu pārneses uzlabošana ir galvenās SAAT priekšrocības. Papildus veiksmīgai SAAT pielietošanai Chenopodium rubrum L. un Beta vulgaris L. transformācijā, šī pieeja ir izmantota arī rekombinantā Escherichia coli savvaļas tipa siltuma labilā holotoksīna un Escherichia coli mutantu LT vakcīnas palīgvielu ražošanā Nicotiana tabacum, kurā putniem tika konstatēti visaugstākie sistēmiskie LT-B specifiskie IgG titri.
(sk. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka un R. Baranski, 2014)

Vispārēja procedūra gēnu pārnesei, izmantojot sonoporāciju augu šūnās

1. Ģenētiskā materiāla sagatavošana: Sāciet, sagatavojot ģenētisko materiālu, kuru vēlaties ievadīt augu šūnās. Tas varētu būt plazmīdu DNS, RNS vai citas nukleīnskābes.
2. Augu šūnu izolācija: Izolējiet augu šūnas, kuras vēlaties atlasīt. Atkarībā no eksperimenta šīs šūnas var būt izolētas no augu audiem vai kultūrām.
3. Šūnu suspensija: Augu šūnas suspendē piemērotā vidē vai buferī. Tas ir būtiski, lai nodrošinātu, ka šūnas ir veselas un tādā stāvoklī, kas veicina gēnu uzņemšanu.
4. Iestatiet savu Sonicator: Sagatavojiet zondes tipa sonikatoru, iepriekš iestatot ultraskaņas apstrādes parametrus, piemēram, amplitūdu, laiku, enerģiju un temperatūru. Iegremdējiet ultraskaņas zondi šūnu suspensijā.
5. Ultraskaņas apstrāde: Sāciet ultraskaņas procedūru. Zondes gala straujās svārstības šķidrumā rada kavitācijas burbuļus. Šie burbuļi paplašinās un sabrūk ultraskaņas viļņu dēļ, radot mehāniskus spēkus un mikrostraumēšanu suspensijā.
6. Sonoporācija: Kavitācijas radītie mehāniskie spēki un mikrostraumēšana uz laiku rada poras un caurumus augu šūnu membrānās. Suspensijā esošais ģenētiskais materiāls var iekļūt augu šūnās caur šīm porām.
7. Inkubācija: Pēc sonoporācijas apstrādes inkubējiet augu šūnas, lai tās varētu atgūt un stabilizēt membrānas. Tas ir izšķirošs solis, lai nodrošinātu šūnu izdzīvošanu un veiksmīgu gēnu pārnesi.

Gēnu pārnešana, izmantojot agrobaktēriju vai liposomas

Augu šūnu transficēšanai ir divas kopīgas formas. Viņi izmanto vai nu agrobaktēriju, gramnegatīvu baktēriju ģints, vai liposomas kā ģenētiskā materiāla nesēju.

• Agrobaktēriju mediēta sonoporācija: Agrobacterium tumefaciens ir baktērija, ko parasti izmanto augu gēnu inženierijā. Šajā metodē Agrobacterium tiek ievadīta plazmīdu DNS, kas satur vēlamo gēnu, kas pēc tam tiek sajaukts ar augu šūnām. Šūnu suspensija tiek pakļauta sonoporācijai, izmantojot zondes tipa sonikatoru. Ultraskaņas enerģija uzlabo ģenētiskā materiāla pārnešanu no Agrobacterium uz augu šūnām. Šo metodi plaši izmanto augu ģenētiskajai modifikācijai.
• Liposomu mediēta sonoporācija: Liposomas ir lipīdu bāzes pūslīši, kas var pārnēsāt ģenētisko materiālu. Šajā metodē liposomas, kas ielādētas ar plazmīdu DNS vai citām nukleīnskābēm, sajauc ar augu šūnām. Sonoporācija, izmantojot zondes tipa sonikatoru, tiek izmantota, lai atvieglotu liposomu uzņemšanu augu šūnās. Ultraskaņa traucē lipīdu divslāņus liposomās, atbrīvojot ģenētisko materiālu augu šūnās. Šī pieeja ir noderīga pārejošiem gēnu ekspresijas pētījumiem augu šūnās.

Zinātniski pierādītas ultraskaņas agrobaktēriju mediētās transformācijas (SAAT) priekšrocības

Ultraskaņas atbalstītā agrobaktēriju mediētā transformācija (SAAT) ir piemērota daudzām augu sugām. Īsa un salīdzinoši viegla augu šūnu kultūru ultraskaņas apstrāde izraisa sonoporāciju, kas pēc tam ļauj dziļi iekļūt Agrobacterium kā gēnu transportētājs. Zemāk jūs varat izlasīt priekšzīmīgus pētījumus, kas parāda SAAT labvēlīgo ietekmi.

Ashwagandha ultrasoniski atbalstīta transformācija

Lai uzlabotu W. somnifera (pazīstams kā ashwagandha vai ziemas ķirsis) transformācijas efektivitāti, Dehdashti un kolēģi (2016) pētīja acetosiringona (AS) un ultraskaņas lietošanu.
Acetozilingons (AS) tika pievienots trīs posmos: Agrobacterium šķidrā kultūra, Agrobacterium infekcija un eksplantu kopkultūra ar Agrobacterium. Tika konstatēts, ka 75 μM AS pievienošana Agrobacterium šķidrajai kultūrai ir optimāla vir gēnu indukcijai.
Papildu ultraskaņas pielietojums (SAAT) izraisīja visaugstāko gēnu ekspresiju. GusA gēna ekspresija matainās saknēs tika atzīta par labāko, kad lapas un dzinumu galiņi tika apstrādāti ar ultraskaņu attiecīgi 10 un 20 gadus. Uzlabotā protokola transformācijas efektivitāte tika reģistrēta attiecīgi 66,5 un 59,5% lapu un dzinumu galu eksplantu gadījumā. Salīdzinot ar citiem protokoliem, tika konstatēts, ka šī uzlabotā protokola transformācijas efektivitāte ir 2,5 reizes augstāka lapām un 3,7 reizes lielāka šaušanas uzgaļiem. Dienvidu plankumainības analīzes apstiprināja 1–2 gusA transgēna kopijas līnijās W1-W4, savukārt uzlabotā protokola radītajā līnijā W5 tika konstatētas 1–4 transgēnu kopijas.

Ultraskaņas atbalstītās agrobaktērijas mediētās transformācijas (SAAT) ilguma ietekme uz W. somnifera lapu (a) un dzinuma gala (b) eksplantu transformācijas biežumu
(pētījums un grafiks: © Dehdashti et al., 2016)

Kokvilnas ultrasoniski atbalstīta transformācija

(2007) parāda labvēlīgo ietekmi, ko rada kokvilnas transformācija ar ultraskaņu. Akustiskā kavitācija, ko izraisa zemas frekvences ultraskaņa, rada mikro brūces uz un zem augu audu virsmas (sonoporācija) un ļauj Agrobacterium ceļot dziļāk un pilnīgāk visā augu audos. Šī brūču mode palielina varbūtību inficēt augu šūnas, kas atrodas dziļāk audos. Lai novērtētu SAAT transformācijas efektivitāti, tika mērīta GUS gēnu ekspresija. GUS reportieru sistēma ir reportiera gēnu sistēma, kas īpaši noderīga augu molekulārajā bioloģijā un mikrobioloģijā. Pielāgojot dažādus SAAT parametrus, GUS pārejoša ekspresija kokvilnā, izmantojot nobriedušus embrijus kā eksplantu, tika ievērojami uzlabota. GUS pirmo reizi tika atklāts 24 stundas pēc eksplantu inkubācijas, un 48 stundas GUS ekspresija bija ļoti intensīva, kas kalpoja kā noderīgs rādītājs veiksmīgai kokvilnas eksplanta transformācijai pēc ultraskaņas apstrādes atbalstītas Agrobacterium mediētās transformācijas (SAAT). Dažādu transformācijas metožu salīdzinājums (proti, biolistic, Agro, BAAT, SAAT), ultraskaņas atbalstīta agrobaktēriju mediēta transformācija (SAAT) parādīja līdz šim labākos transformācijas rezultātus.

Pārveidošanas procedūras izvēle, pamatojoties uz GUS īslaicīgu izpausmi. Ultraskaņas atbalstīta agrobaktēriju mediēta transformācija (SAAT) parāda ievērojami augstāku pārejošu ekspresiju.
(pētījums un grafiks: © Hussain et al., 2007)

Augstas veiktspējas ultraskaņas risinājumi sonoporācijai un SAAT

Hielscher Ultrasonics ir ilgstoša pieredze augstas veiktspējas ultrasonikatoru izstrādē un ražošanā laboratorijām, pētniecības iekārtām, kā arī rūpnieciskai ražošanai ar ļoti augstu caurlaidspēju. Mikrobioloģijai un zinātnei par dzīvību Hielscher piedāvā dažādus risinājumus, lai pielāgotos dažādām prasībām, kas nepieciešamas konkrētiem audiem un to ārstēšanai. Daudzu paraugu vienlaicīgai ultrasonikācijai Hielscher piedāvā UIP400MTP multiwell plāksnēm, VialTweeter ultraskaņas apstrādei līdz 10 flakoniem (piemēram, Eppendorf caurulēm) vai ultraskaņas CupHorn. Zondes tipa ultrasonikatori ir pieejami no 50 līdz 400 vatiem kā laboratorijas homogenizatori, bet rūpnieciskās sistēmas aptver jaudas diapazonu no 500 vatiem līdz 16kW.
Lūdzu, sazinieties ar mums un informējiet mūs par savām pieteikuma un procesa prasībām. Mūsu pieredzējušais personāls ar prieku ieteiks vispiemērotāko ultrasonikatoru jūsu bioloģiskajam procesam.
Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu ultrasonikatoru aptuveno apstrādes jaudu: