Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) ir efektīva metode, lai inficētu augu šūnas ar svešiem gēniem, izmantojot Agrobacterium kā transportieri. Ultraskaņas kavitācija izraisa sonoporāciju, ko var raksturot kā mērķtiecīgu augu audu mikroievainošanu. Caur šiem ultrasoniski rada mikro brūces, DNS un DNS vektorus var efektīvi transportēt šūnu matricā.

sonoporācija – Ultrasoniski uzlabota šūnu transformācija

Ja šūnu suspensijām tiek pielietota zemas frekvences ultraskaņa (aptuveni 20 kHz), akustiskās kavitācijas ietekme izraisa pārejošu membrānas caurlaidību šūnu audos. Šis ultraskaņas efekts ir pazīstams kā sonoporācija un tiek izmantots gēnu pārnešanai šūnās vai audos.
Ultrasonication priekšrocības ir balstītas uz tā ne-termisko mehāniskā darba principu, kas padara ultraskaņu bieži daudzpusīgāku un mazāk atkarīgu no šūnu tipiem. Daudzpusīga sonoporācijas pielietošana paver iespēju izmantot transgēnus augus, kuriem ir ievērojams potenciāls sarežģītu cilvēka terapeitisko proteīnu bioproducēšanā. Ar šādiem augu izcelsmes bioreaktoriem var viegli ģenētiski manipulēt, tie novērš iespējamo piesārņojumu ar cilvēku patogēniem, nebojā transformācijas mediējošās baktērijas (piemēram, Agrobacterium) un ir lēta, efektīva biosintēzes metode.

Ultraskaņas šūnu transformācija

Ultraskaņas apstrāde ir metode, kas izmanto zemas frekvences ultraskaņas viļņus, lai sajauktu daļiņas šķīdumā, sajauktu šķīdumus, tādējādi palielinot masas pārneses un izšķīšanas ātrumu. Vienlaikus ultraskaņas apstrāde var noņemt izšķīdušās gāzes no šķidrumiem. Augu transformācijas laikā ultraskaņas apstrāde izraisīs mikroputnu veidošanos uz augu audiem un uzlabos kailas DNS piegādi augu protoplastā.

Ģenētiskai transformācijai vēlamā metode ir Sonication-Assisted Agrobacterium-mediaed Transformation (SAAT), un tai ir ievērojami augstāka efektivitāte nekā ultraskaņas apstrādei, ko izmanto, lai pārnestu kailus DNS un DNS vektorus tieši protoplastā. Daudzi pētījumi ir pierādījuši, ka ultraskaņas apstrāde, kas palīdzēja Agrobacterium mediētai transformācijai (SAAT), var tikt izmantota, lai izraisītu mehāniskus traucējumus un brūču veidošanos uz augu šūnām ar ultraskaņas viļņiem un no tā izrietošo akustisko kavitāciju. Īsa ultraskaņas apstrāde rada mikro brūces uz eksplantu virsmas. Tā kā ievainotās šūnas ļaus Agrobacterium iekļūt augu audu dziļākajā daļā, tādējādi palielinot augu šūnu inficēšanās iespējamību. Turklāt izdalītie fenola savienojumi uzlabo transformāciju. Ultrasoniski radītās mikro brūces padara baktēriju eksplantācijas iekļūšanu arī reālākas. SAAT tika veiksmīgi izmantots augu sugu ģenētiskai transformācijai, ko īpaši uzskatīja par rezistentām pret Agrobacterium.
Tā kā tā ir ļoti vienkārša un lēta metode, kā arī būtiska Agrobacterium mediētās gēnu pārneses uzlabošana ir galvenās SAAT priekšrocības. Papildus veiksmīgai SAAT pielietošanai Chenopodium rubrum L. un Beta vulgaris L. transformācijā šī pieeja ir izmantota arī rekombinantā Escherichia coli savvaļas tipa karstuma labila holotoksīna un Escherichia coli mutanta LT vakcīnas palīgvielu ražošanā Nicotiana tabacum, kurā putniem tika konstatēti visaugstākie sistēmiskie LT-B specifiskie IgG titri.
(sal.: Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka un R. Baranski, 2014)

Vispārēja procedūra gēnu pārnesei, izmantojot sonoporāciju augu šūnās

1. Ģenētiskā materiāla sagatavošana: Sāciet, sagatavojot ģenētisko materiālu, kuru vēlaties ievadīt augu šūnās. Tas varētu būt plazmīdu DNS, RNS vai citas nukleīnskābes.
2. Augu šūnu izolācija: Izolējiet augu šūnas, uz kurām vēlaties mērķēt. Atkarībā no eksperimenta šīs šūnas var būt izolētas no augu audiem vai kultūrām.
3. Šūnu suspensija: Augu šūnas suspendē piemērotā vidē vai buferī. Tas ir būtiski, lai nodrošinātu, ka šūnas ir veselas un tādā stāvoklī, kas veicina gēnu uzņemšanu.
4. Iestatiet savu Sonicator: Sagatavojiet zondes tipa sonikatoru, iepriekš iestatot ultraskaņu ar tādiem parametriem kā amplitūda, laiks, enerģija un temperatūra. Iegremdējiet ultraskaņas zondi šūnu suspensijā.
5. Ultraskaņu Sāciet ultraskaņas procedūru. Zondes gala straujās svārstības šķidrumā rada kavitācijas burbuļus. Šie burbuļi paplašinās un sabrūk ultraskaņas viļņu dēļ, radot mehāniskus spēkus un mikroplastēšanu suspensijā.
6. Sonoporācija: Kavitācijas radītie mehāniskie spēki un mikrostraumēšana uz laiku rada poras un caurumus augu šūnu membrānās. Suspensijā esošais ģenētiskais materiāls var iekļūt augu šūnās caur šīm porām.
7. Inkubācija: Pēc sonoporācijas apstrādes inkubējiet augu šūnas, lai tās varētu atgūt un stabilizēt membrānas. Tas ir izšķirošs solis, lai nodrošinātu šūnu izdzīvošanu un veiksmīgu gēnu pārnesi.

Gēnu pārnešana, izmantojot agrobaktēriju vai liposomas

Augu šūnu transficēšanai ir divas kopīgas formas. Viņi izmanto vai nu agrobaktēriju, gramnegatīvu baktēriju ģints, vai liposomas kā ģenētiskā materiāla nesēju.

• Agrobaktēriju mediēta sonoporācija: Agrobacterium tumefaciens ir baktērija, ko parasti izmanto augu gēnu inženierijā. Šajā metodē Agrobacterium tiek ievadīta plazmīdu DNS, kas satur vēlamo gēnu, kas pēc tam tiek sajaukts ar augu šūnām. Šūnu suspensija tiek pakļauta sonoporācijai, izmantojot zondes tipa sonikatoru. Ultraskaņas enerģija uzlabo ģenētiskā materiāla pārnešanu no Agrobacterium uz augu šūnām. Šo metodi plaši izmanto augu ģenētiskajai modifikācijai.
• Liposomu mediēta sonoporācija: Liposomas ir uz lipīdiem balstītas pūslīši, kas var pārnēsāt ģenētisko materiālu. Šajā metodē liposomas, kas ielādētas ar plazmīdu DNS vai citām nukleīnskābēm, sajauc ar augu šūnām. Sonoporācija, izmantojot zondes tipa sonikatoru, tiek izmantota, lai atvieglotu liposomu uzņemšanu augu šūnās. Ultraskaņa traucē lipīdu divslāņus liposomās, atbrīvojot ģenētisko materiālu augu šūnās. Šī pieeja ir noderīga pārejošiem gēnu ekspresijas pētījumiem augu šūnās.

Zinātniski pierādītas priekšrocības, ko sniedz ar ultraskaņu atbalstīta agrobaktērijas mediēta transformācija (SAAT)

Ultraskaņas apstrāde-asistēta agrobaktērijas mediēta transformācija (SAAT) ir piemērota daudzām augu sugām. Īsa un salīdzinoši viegla augu šūnu kultūru ultraskaņas apstrāde izraisa sonoporāciju, kas pēc tam ļauj dziļi iekļūt Agrobacterium kā gēnu transportētājā. Zemāk jūs varat izlasīt priekšzīmīgus pētījumus, kas parāda SAAT labvēlīgo ietekmi.

Ultrasoniski atbalstīta Ashwagandha transformācija

Lai uzlabotu transformācijas efektivitāti W. somnifera (pazīstams kā ashwagandha vai ziemas ķirsis), Dehdashti un kolēģi (2016) pētīja acetosirīna (AS) un ultraskaņas apstrādes izmantošanu.
Acetosiringāns (AS) tika pievienots trīs posmos: Agrobacterium šķidrā kultūra, Agrobacterium infekcija un eksplantātu līdzkultūra ar Agrobacterium. Tika konstatēts, ka 75 μM AS pievienošana Agrobacterium šķidruma kultūrai ir optimāla vir gēnu inducēšanai.
Papildu ultraskaņas pielietošana (SAAT) izraisīja visaugstāko gēnu ekspresiju. GusA gēna ekspresija matainajās saknēs tika atzīta par labāko, kad lapas un šaušanas uzgaļi tika apstrādāti attiecīgi 10 un 20 gadus. Uzlabotā protokola transformācijas efektivitāte tika reģistrēta attiecīgi 66,5 un 59,5% lapu un dzinumu uzgaļu eksplantu gadījumā. Salīdzinot ar citiem protokoliem, tika konstatēts, ka šī uzlabotā protokola transformācijas efektivitāte ir 2,5 reizes lielāka lapām un par 3,7 reizes vairāk šaušanas galiem. Dienvidu blot analīzes apstiprināja 1–2 gusA transgēna kopijas līnijās W1-W4, bet 1–4 transgēnu kopijas tika konstatētas līnijā W5, ko ģenerēja uzlabotais protokols.

Ar ultraskaņu atbalstītas Agrobacterium- mediētās transformācijas (SAAT) ilguma ietekme uz W. somnifera lapas (a) transformācijas frekvenci un šāviena gala (b) eksplantātiem
(pētījums un grafika: © Dehdashti et al., 2016)

Kokvilnas ultraskaņas pārveidošana

(2007) demonstrē kokvilnas transformācijas ar ultraskaņu atbalstītās kokvilnas transformācijas labvēlīgo ietekmi. Akustiskā kavitācija, ko izraisa zemas frekvences ultraskaņa, rada mikro brūces uz un zem augu audu virsmas (sonoporācija) un ļauj Agrobacterium ceļot dziļāk un pilnīgāk visā augu audos. Šī brūkošā mode palielina varbūtību inficēt augu šūnas, kas atrodas dziļāk audos. Lai novērtētu SAAT transformācijas efektivitāti, tika mērīta GUS gēnu ekspresija. GUS reportieru sistēma ir reportieru gēnu sistēma, kas ir īpaši noderīga augu molekulārajā bioloģijā un mikrobioloģijā. Pielāgojot dažādus SAAT parametrus, ievērojami uzlabojās GUS pārejošā ekspresija kokvilnā, izmantojot nobriedušus embrijus kā eksplantu. GUS pirmo reizi tika atklāts 24h pēc eksplantu inkubācijas, un līdz 48h, GUS ekspresija bija ļoti intensīva, kas kalpoja kā noderīgs rādītājs veiksmīgai kokvilnas eksplanta transformācijai pēc ultraskaņas apstrādes, kas palīdzēja Agrobacterium mediētai transformācijai (SAAT). Dažādu transformācijas metožu salīdzinājums (proti, biolistiskais, Agro, BAAT, SAAT), ar ultraskaņu atbalstītā Agrobacterium mediētā transformācija (SAAT) parādīja līdz šim labākos transformācijas rezultātus.

Transformācijas procedūras izvēle, pamatojoties uz īslaicīgu GUS ekspresiju. Sonication-assisted Agrobacterium mediētā transformācija (SAAT) uzrāda ievērojami augstāku pārejošu ekspresiju.
(pētījums un grafika: © Hussain et al., 2007)

Augstas veiktspējas ultraskaņas risinājumi sonoporācijai un SAAT

Hielscher Ultrasonics ir ilgstoša pieredze augstas veiktspējas ultrasonikatoru izstrādē un ražošanā laboratorijām, pētniecības iekārtām, kā arī rūpnieciskajai ražošanai ar ļoti augstu caurlaidspēju. Mikrobioloģijā un zinātnē par dzīvību Hielscher piedāvā dažādus risinājumus, lai pielāgotos dažādām prasībām, kas nepieciešamas konkrētiem audiem un to ārstēšanai. Vienlaicīgai daudzu paraugu ultrasonikācijai Hielscher piedāvā UIP400MTP daudzvelnu plāksnēm, VialTweeter līdz 10 flakonu apstrādei (piemēram, Eppendorf caurules) vai ultraskaņas CupHorn. Zondes tipa ultrasonikatori ir pieejami no 50 līdz 400 vatiem kā laboratorijas homogenizatori, savukārt rūpnieciskās sistēmas aptver jaudas diapazonu no 500 vatiem līdz 16kW.
Lūdzu, sazinieties ar mums un informējiet mūs par savām pieteikuma un procesa prasībām. Mūsu labi pieredzējušie darbinieki ar prieku ieteiks vispiemērotāko ultrasonikatoru jūsu bioloģiskajam procesam.
Zemāk redzamā tabula sniedz norādes par mūsu ultraskaņas aparātu aptuveno apstrādes jaudu: