Augu šūnu ģenētiskā transformācija, izmantojot ultraskaņu

Ar ultraskaņu veicināta Agrobacterium mediēta transformācija (SAAT) ir efektīva metode augu šūnu inficēšanai ar svešiem gēniem, izmantojot Agrobacterium kā pārnesēju. Ultraskaņas kavitācija izraisa sonoporāciju, ko var raksturot kā mērķtiecīgu mikrobrūču veidošanu augu audos. Caur šīm ar ultraskaņu radītajām mikrobrūcēm DNS un DNS vektorus var efektīvi ievadīt šūnas matriksā.

Sonoporācija – ar ultraskaņu uzlabota šūnu transformācija

Iedarbojoties uz šūnu suspensijām ar zemas frekvences ultraskaņu (aptuveni 20kHz), akustiskā kavitācija īslaicīgi palielina audu šūnu membrānu caurlaidību. Šo ultraskaņas iedarbību sauc par sonoporāciju, un to izmanto gēnu pārnesei šūnās vai audos.
Apstrādes ar ultraskaņu priekšrocības izriet no tās netermiskā mehāniskā darbības principa, kas bieži padara šo apstrādi daudzpusīgāku un mazāk atkarīgu no šūnu veida. Sonoporācijas daudzpusīgais pielietojums paver iespējas izmantot transgēnus augus, kuriem ir ievērojams potenciāls sarežģītu cilvēka terapeitisko olbaltumvielu bioloģiskajā ražošanā. Šādus augu bioreaktorus var viegli ģenētiski modificēt, tie novērš iespējamu piesārņojumu ar cilvēkam patogēniem mikroorganismiem, nebojā transformāciju mediējošās baktērijas (piemēram, Agrobacterium) un nodrošina lētu, efektīvu biosintēzes metodi.

Ar ultraskaņu veicināta šūnu transformācija

Apstrāde ar ultraskaņu ir metode, kurā izmanto zemas frekvences ultraskaņas viļņus, lai iekustinātu šķīdumā esošās daļiņas un sajauktu šķīdumus, tādējādi palielinot masas pārneses un šķīšanas ātrumu. Vienlaikus apstrāde ar ultraskaņu var izvadīt no šķidrumiem izšķīdušās gāzes. Augu transformācijā apstrāde ar ultraskaņu izraisa mikrobrūču veidošanos augu audos un uzlabo kailas DNS ievadīšanu augu protoplastos.

Ģenētiskajai transformācijai vēlamā metode ir ar ultraskaņu veicināta Agrobacterium mediēta transformācija (SAAT), un tās efektivitāte ir ievērojami augstāka nekā apstrādei ar ultraskaņu, ko izmanto kailas DNS un DNS vektoru tiešai ievadīšanai protoplastā. Daudzos pētījumos ir pierādīts, ka ar ultraskaņu veicinātu Agrobacterium mediētu transformāciju (SAAT) var izmantot, lai ar ultraskaņas viļņiem un to izraisīto akustisko kavitāciju radītu augu šūnu mehāniskus bojājumus un brūces. Īslaicīga apstrāde ar ultraskaņu rada mikrobrūces uz eksplantu virsmas. Tā kā ievainotās šūnas ļauj Agrobacterium iekļūt dziļāk augu audos, palielinās augu šūnu inficēšanās iespējamība. Turklāt izdalītie fenola savienojumi veicina transformāciju. Ar ultraskaņu radītās mikrobrūces arī atvieglo baktēriju iekļūšanu eksplantos. SAAT ir veiksmīgi izmantota tādu augu sugu ģenētiskajai transformācijai, kuras uzskata par īpaši izturīgām pret Agrobacterium.
Galvenās SAAT priekšrocības ir metodes vienkāršība un zemās izmaksas, kā arī ievērojami uzlabota Agrobacterium mediētā gēnu pārnese. Papildus veiksmīgam SAAT pielietojumam Chenopodium rubrum L. un Beta vulgaris L. transformācijā šī pieeja ir izmantota arī rekombinantā Escherichia coli savvaļas tipa termolabilā holotoksīna un Escherichia coli mutanta LT vakcīnu adjuvantu ražošanai Nicotiana tabacum augos; putniem tika konstatēti visaugstākie sistēmiskie LT-B specifisko IgG titri.
(sal. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Vispārīgā procedūra gēnu pārnesei augu šūnās ar sonoporāciju

1. Ģenētiskā materiāla sagatavošana: Sāciet ar ģenētiskā materiāla sagatavošanu, kuru vēlaties ievadīt augu šūnās. Tā var būt plazmīdu DNS, RNS vai citas nukleīnskābes.
2. Augu šūnu izolēšana: Izolējiet augu šūnas, uz kurām vēlaties iedarboties. Atkarībā no eksperimenta šīs šūnas var izolēt no augu audiem vai kultūrām.
3. Šūnu suspensija: Suspendējiet augu šūnas piemērotā barotnē vai buferšķīdumā. Tas ir būtiski, lai nodrošinātu, ka šūnas ir veselas un gēnu uzņemšanai labvēlīgā stāvoklī.
4. Ultraskaņas apstrādes ierīces iestatīšana: Sagatavojiet zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīci, iepriekš iestatot tādus ultraskaņas apstrādes parametrus kā amplitūda, laiks, enerģija un temperatūra. Iegremdējiet ultraskaņas zondi šūnu suspensijā.
5. Apstrāde ar ultraskaņu: Sāciet apstrādi ar ultraskaņu. Zondes gala straujās svārstības šķidrumā rada kavitācijas burbuļus. Ultraskaņas viļņu ietekmē šie burbuļi izplešas un saplok, radot suspensijā mehāniskus spēkus un mikroplūsmas.
6. Sonoporācija: Kavitācijas radītie mehāniskie spēki un mikroplūsmas augu šūnu membrānās īslaicīgi izveido poras un atveres. Suspensijā esošais ģenētiskais materiāls caur šīm porām var iekļūt augu šūnās.
7. Inkubācija: Pēc sonoporācijas inkubējiet augu šūnas, lai tās varētu atjaunoties un stabilizēt savas membrānas. Šis solis ir izšķiroši svarīgs, lai nodrošinātu šūnu izdzīvošanu un veiksmīgu gēnu pārnesi.

Gēnu pārnese ar Agrobacterium vai liposomu starpniecību

Pastāv divi izplatīti augu šūnu transfekcijas veidi. Tajos par ģenētiskā materiāla pārnesēju izmanto vai nu gramnegatīvo baktēriju ģinti Agrobacterium, vai liposomas.

• Sonoporācija ar Agrobacterium starpniecību: Agrobacterium tumefaciens ir baktērija, ko bieži izmanto augu gēnu inženierijā. Šajā metodē plazmīdu DNS, kas satur vēlamo gēnu, ievada Agrobacterium baktērijās, kuras pēc tam sajauc ar augu šūnām. Šūnu suspensiju pakļauj sonoporācijai, izmantojot zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīci. Ultraskaņas enerģija uzlabo ģenētiskā materiāla pārnesi no Agrobacterium uz augu šūnām. Šo metodi plaši izmanto augu ģenētiskajai modificēšanai.
• Sonoporācija ar liposomu starpniecību: Liposomas ir lipīdu pūslīši, kas var pārnest ģenētisko materiālu. Šajā metodē liposomas, kurās iekļauta plazmīdu DNS vai citas nukleīnskābes, sajauc ar augu šūnām. Lai veicinātu liposomu uzņemšanu augu šūnās, izmanto sonoporāciju ar zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīci. Ultraskaņa izjauc liposomu lipīdu dubultslāņus, atbrīvojot ģenētisko materiālu augu šūnās. Šī pieeja ir noderīga pārejošas gēnu ekspresijas pētījumos augu šūnās.

Zinātniski pierādītas priekšrocības transformācijai ar Agrobacterium starpniecību, izmantojot ultraskaņas apstrādi (SAAT)

Transformācija ar Agrobacterium starpniecību, izmantojot ultraskaņas apstrādi (SAAT), ir izmantota daudzām augu sugām. Īslaicīga un samērā saudzīga augu šūnu kultūru apstrāde ar ultraskaņu izraisa sonoporāciju, kas pēc tam ļauj Agrobacterium kā gēnu pārnesējam iekļūt dziļi audos. Tālāk varat iepazīties ar pētījumu piemēriem, kas apliecina SAAT labvēlīgo ietekmi.

Ašvagandas transformācija ar ultraskaņas palīdzību

Lai uzlabotu W. somnifera (pazīstama kā ašvaganda jeb ziemas ķirsis) transformācijas efektivitāti, Dehdashti un kolēģi (2016) pētīja acetosiringona (AS) un apstrādes ar ultraskaņu izmantošanu.
Acetosiringons (AS) tika pievienots trīs posmos: Agrobacterium šķidrajai kultūrai, inficēšanas laikā ar Agrobacterium un eksplantātu kopkultivēšanas laikā ar Agrobacterium. Tika konstatēts, ka 75 μM AS pievienošana Agrobacterium šķidrajai kultūrai ir optimāla vir gēnu indukcijai.
Apstrādes ar ultraskaņu papildu izmantošana (SAAT) nodrošināja visaugstāko gēnu ekspresiju. Tika konstatēts, ka gusA gēna ekspresija matainajās saknēs bija vislabākā, ja lapas un dzinumu galotnes tika apstrādātas ar ultraskaņu attiecīgi 10 un 20s. Uzlabotā protokola transformācijas efektivitāte lapu un dzinumu galotņu eksplantātiem bija attiecīgi 66,5 un 59,5%. Salīdzinot ar citiem protokoliem, tika konstatēts, ka šī uzlabotā protokola transformācijas efektivitāte lapām bija 2,5 reizes augstāka, bet dzinumu galotnēm – 3,7 reizes augstāka. Southern blotanalīzes apstiprināja 1–2 gusA transgēna kopijas līnijās W1-W4, savukārt ar uzlaboto protokolu iegūtajā līnijā W5 tika konstatētas 1–4 transgēna kopijas.

Ar ultraskaņu veicinātas Agrobacterium mediētas transformācijas (SAAT) ilguma ietekme uz W. somnifera lapu (a) un dzinumu galotņu (b) eksplantātu transformācijas biežumu
(pētījums un attēls: © Dehdashti et al., 2016)

Ar ultraskaņu veicināta kokvilnas transformācija

Hussain et al. (2007) demonstrē ar ultraskaņu veicinātas kokvilnas transformācijas labvēlīgo ietekmi. Zemas frekvences ultraskaņas izraisīta akustiskā kavitācija rada mikrobojājumus uz augu audu virsmas un zem tās (sonoporācija) un ļauj Agrobacterium iekļūt dziļāk un izplatīties visā augu audu apjomā. Šāds bojājumu veidošanās veids palielina dziļāk audos esošo augu šūnu inficēšanas varbūtību. Lai novērtētu SAAT transformācijas efektivitāti, tika mērīta GUS gēna ekspresija. GUS reportiera sistēma ir reportiergēna sistēma, kas ir īpaši noderīga augu molekulārajā bioloģijā un mikrobioloģijā. Pielāgojot dažādus SAAT parametrus, tika ievērojami pastiprināta GUS pārejošā ekspresija kokvilnā, par eksplantātiem izmantojot nobriedušus embrijus. GUS pirmo reizi tika konstatēts 24h pēc eksplantātu inkubācijas, un pēc 48h GUS ekspresija bija ļoti intensīva, kas kalpoja kā noderīgs rādītājs veiksmīgai kokvilnas eksplantāta transformācijai pēc ar ultraskaņu veicinātas Agrobacterium mediētas transformācijas (SAAT). Salīdzinot dažādas transformācijas metodes (proti, biolistisko metodi, Agro, BAAT, SAAT), ar ultraskaņu veicināta Agrobacterium mediēta transformācija (SAAT) uzrādīja pārliecinoši labākos transformācijas rezultātus.

Transformācijas procedūras izvēle, pamatojoties uz GUS pārejošo ekspresiju. Ar ultraskaņu veicināta Agrobacterium mediēta transformācija (SAAT) uzrāda ievērojami augstāku pārejošo ekspresiju.
(pētījums un attēls: © Hussain et al., 2007)

Augstas veiktspējas ultraskaņas risinājumi sonoporācijai un SAAT

Hielscher Ultrasonics ir ilggadēja pieredze augstas veiktspējas ultraskaņas ierīču izstrādē un ražošanā laboratorijām, pētniecības iestādēm, kā arī rūpnieciskajai ražošanai ar ļoti lielu apstrādes ražīgumu. Mikrobioloģijai un dzīvības zinātnēm Hielscher piedāvā dažādus risinājumus, lai izpildītu atšķirīgās prasības, kas saistītas ar konkrētiem audiem un to apstrādi. Daudzu paraugu vienlaicīgai apstrādei ar ultraskaņu Hielscher piedāvā UIP400MTP daudziedobju platēm, VialTweeter līdz 10 flakonu (piemēram, Eppendorf mēģeņu) apstrādei ar ultraskaņu vai ultraskaņas CupHorn. Zondes tipa ultraskaņas ierīces ir pieejamas kā laboratorijas homogenizatori ar jaudu no 50 līdz 400 vatiem, savukārt rūpnieciskās sistēmas aptver jaudas diapazonu no 500 vatiem līdz 16kW.
Lūdzu, sazinieties ar mums un pastāstiet par savu lietojumu un procesa prasībām. Mūsu pieredzējušie darbinieki labprāt ieteiks jūsu bioloģiskajam procesam vispiemērotāko ultraskaņas ierīci.
Tālāk redzamā tabula sniedz priekšstatu par mūsu ultraskaņas ierīču aptuveno apstrādes jaudu: