Amiloīda fibrilu veidošanās, izmantojot mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP

Amiloīda fibrilas, līdzīgi kā kristāli, veidojas nukleācijas un tai sekojošas augšanas procesā. Tomēr augstās nukleācijas brīvās enerģijas barjeras dēļ spontāna amiloīda fibrilu veidošanās notiek tikai pēc ilgstošas latentās fāzes. Apstrāde ar ultraskaņu ir kļuvusi par iedarbīgu līdzekli amiloīda nukleācijas inducēšanai, tādējādi ievērojami paātrinot fibrilu veidošanos. Apvienojumā ar mikroplašu lasītāju, kas izmanto tioflavīna T (ThT) fluorescenci, apstrāde ar ultraskaņu ļauj vienlaikus noteikt amiloīda fibrilas daudzos paraugos ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu.

Ar ultraskaņu inducēta amiloīda fibrilu veidošanās, izmantojot mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP

Izmantojot daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP, pētniecības vajadzībām var ātri sintezēt lielu daudzumu vienādas kvalitātes amiloīda fibrilu. Šī efektīvā pieeja ļauj pētīt olbaltumvielu amiloidogenitāti. Šī metode veicina ātru un reproducējamu amiloīda fibrilu veidošanos, kā pierādīts ar β2-mikroglobulīnu (β2-m) – amiloidogēnu olbaltumvielu, kas saistīta ar dialīzes izraisītu amiloidozi.

Vienkārša eksperimentālā pieeja: ar ultraskaņu inducēta amiloīda fibrilu veidošanās

Lai inducētu fibrilu veidošanos, 96 iedobju mikroplate tika novietota daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīces UIP400MTP centrā; šī ierīce nodrošina vienmērīgu ultraskaņas iedarbību visās iedobēs. Eksperimenta apstākļi bija šādi:

1. Katra iedobe saturēja 0,2 ml β2-mikroglobulīna šķīduma (0,3 mg/ml, pH 2,5), kam pievienots 5 μM ThT.
2. Plate tika pakļauta apstrādes ar ultraskaņu cikliem, piemēram, 1 minūti ilgai apstrādei ar ultraskaņu, kam sekoja 9 minūšu pauze.
3. Pēc apstrādes ar ultraskaņu ThT fluorescence tika mērīta ar mikroplašu lasītāju.

(sal. So et al., 2011)

Salīdzinājums ar tradicionālo maisīšanu

Salīdzinājumā ar tradicionālajām maisīšanas metodēm apstrāde ar ultraskaņu krasi saīsināja fibrilu veidošanās latento fāzi. Tradicionālos mikroplašu kratīšanas apstākļos tikai 1 no 10 iedobēm pēc 20 stundām uzrādīja paaugstinātu ThT fluorescenci. Turpretī, izmantojot ciklisku apstrādi ar ultraskaņu (15 minūšu apstrāde ar ultraskaņu, kam sekoja 5 minūtes miera stāvoklī), ievērojams ThT fluorescences pieaugums tika konstatēts uzreiz pēc pirmās apstrādes ar ultraskaņu.

Strauja fibrilu veidošanās kinētikas paātrināšana

So et al. (2011) iegūtie rezultāti parādīja, ka spontānu β2-mikroglobulīna fibrilu veidošanos pie pH 2,5 ar apstrādi ar ultraskaņu var paātrināt no vairākām stundām līdz tikai 10–15 minūtēm.
Atomspēku mikroskopijas (AFM) attēli apstiprināja, ka fibrilas, kas iegūtas ar 10 minūšu apstrādi ar ultraskaņu ik pēc 15 minūtēm, morfoloģiski nebija atšķiramas no fibrilām, kas veidojās, izmantojot 1 minūtes apstrādi ar ultraskaņu ik pēc 10 minūtēm. Tas izceļ ar ultraskaņu inducētas amiloīda fibrilu veidošanās reproducējamību un noturību pret apstākļu variācijām.

AFM attēli ar amiloīda fibrilām, kas iegūtas, izmantojot 1 min ilgu apstrādi ar ultraskaņu ik pēc 10 min (i), 10 min ilgu apstrādi ar ultraskaņu ik pēc 15 min (ii) un reakciju ar fibrilu aizmetņu pievienošanu bez apstrādes ar ultraskaņu (iii). Baltā mēroga josla atbilst 1 μm.
Pētījums un attēli: ©So et al., 2011

Fibrilu veidošanās neitrāla pH apstākļos

Pat neitrāla pH apstākļos fibrilu veidošanās tika panākta pēc 1,5 stundu latentā perioda, pierādot, ka apstrāde ar ultraskaņu ievērojami pazemina nukleācijas un augšanas enerģētisko barjeru. Tas papildus apstiprina hipotēzi, ka amiloīda fibrilu veidošanās galvenokārt ir fizikāla reakcija, ko lielā mērā ierobežo nukleācijas enerģijas barjera, kuru apstrāde ar ultraskaņu efektīvi samazina.

Ietekme uz ar amiloīdu saistītu slimību pētniecību

Vienkāršai un uzticamai amiloīda fibrilu iegūšanai ar mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP ir būtiska nozīme Alcheimera slimības (AD) un citu ar amiloīdu saistītu slimību, piemēram, Parkinsona slimības, II tipa cukura diabēta un sistēmisko amiloidožu, pētniecībā. AD gadījumā amiloīda-β (Aβ) agregācija ir viena no galvenajām patoloģiskajām pazīmēm, tomēr tā fibrilu veidošanās kinētikas izpēti joprojām apgrūtina ilgās latentās fāzes un tradicionālo metožu rezultātu mainīgums. Ar ultraskaņu veicināta fibrilu veidošanās paātrina nukleāciju, nodrošinot augstu reproducējamību un samazinātu rezultātu mainīgumu, kas ir būtiski potenciālo inhibitoru skrīningam un amiloidogēno mehānismu izpratnei. Turklāt UIP400MTP augstais paraugu apstrādes ražīgums ļauj veikt plaša mēroga pētījumus par olbaltumvielu nepareizu salocīšanos un agregāciju, veicinot tādu terapeitisko līdzekļu atklāšanu, kuri var modulēt fibrilu veidošanos un potenciāli mazināt neirodeģenerācijas progresēšanu.

Šis pētījums apliecina, ka apstrāde ar ultraskaņu, izmantojot daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP, ir ļoti efektīva metode amiloīda fibrilu veidošanās paātrināšanai. Šīs pieejas galvenās priekšrocības ir:

• Krasa fibrilu veidošanās latentā perioda saīsināšana.
• Vienmērīga ultraskaņas iedarbība visās iedobēs, kas nodrošina reproducējamu fibrilu veidošanos.
• Iespēja veikt skrīningu ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu, kas padara šo pieeju piemērotu olbaltumvielu amiloidogenitātes meklējumiem visa genoma mērogā.

Apvienojot apstrādi ar ultraskaņu ar ThT fluorescences noteikšanu, šī metode nodrošina ātru, mērogojamu un uzticamu platformu amiloīda fibrilu veidošanās izpētei. Ņemot vērā tās efektivitāti un augsta paraugu apstrādes ražīguma potenciālu, šī pieeja var atvieglot vienkāršu amiloīda fibrilu sintēzi biofizikāliem un farmaceitiskiem pētījumiem, piedāvājot daudzsološu rīku ar amiloīdu saistītiem pētījumiem un zāļu skrīningam.