Amiloīda fibrila veidošanās, izmantojot UIP400MTP Microplate Sonicator

Amiloīda fibrili, līdzīgi kā kristāli, veidojas nukleācijas un turpmākās augšanas procesā. Tomēr, ņemot vērā nukleācijas augsto brīvās enerģijas barjeru, spontāna amiloīda fibrila veidošanās notiek tikai pēc ilgstošas kavēšanās fāzes. Ultrasonication ir kļuvis par spēcīgu instrumentu amiloīda nukleācijas izraisīšanai, tādējādi ievērojami paātrinot fibrila veidošanos. Kombinējot ar mikroplašu lasītāju, izmantojot tioflavīna T (ThT) fluorescenci, ultrasonication ļauj augstas caurlaidspējas noteikt amiloīda fibrilus vairākos paraugos vienlaicīgi.

Ultrasoniski inducēts amiloīda fibrila veidošanās ar UIP400MTP mikroplates Sonicator

Ar UIP400MTP vairāku urbumu plāksnes sonikatoru, tādas pašas kvalitātes amiloīda fibrilus lielos daudzumos var ātri sintezēt pētniecības nolūkos. Šī efektīvā pieeja ļauj pētīt olbaltumvielu amiloidogenitāti. Šī metode atvieglo ātru un reproducējamu amiloīdu fibrilāciju, kā pierādīts ar β2-mikroglobulīnu (β2-m), amiloidogēnu proteīnu, kas saistīts ar dialīzi saistītu amiloidozi.

Vienkārša eksperimentāla pieeja: ultrasoniski izraisīta amiloīda fibrilācija

Lai izraisītu fibrila veidošanos, UIP400MTP vairāku urbumu plāksnes ultraskaņas centrā tika ievietota 96 urbumu mikroplate, kas nodrošina vienmērīgu ultraskaņas iedarbību visās akās. Eksperimenta apstākļi bija šādi:

1. Katrā iedobē bija 0,2 ml β2-mikroglobulīna šķīduma (0,3 mg/ml, pH 2,5), kas papildināts ar 5 μM ThT.
2. Plāksne tika pakļauta ultrasonication cikliem, piemēram, 1 minūtes ultrasonication, kam sekoja 9 minūšu pauze.
3. Pēc ultraskaņas apstrādes ThT fluorescence tika mērīta, izmantojot mikroplates lasītāju.

(sal. ar So et al., 2011)

Salīdzinājums ar parasto uzbudinājumu

Salīdzinot ar tradicionālajām uzbudinājuma metodēm, ultrasonication krasi samazināja fibrila veidošanās kavēšanās fāzi. Parastos mikroplašu kratīšanas apstākļos tikai 1 no 10 iedobēm pēc 20 stundām uzrādīja paaugstinātu ThT fluorescenci. Turpretī, izmantojot ciklveida ultrasonication (15 minūšu ultraskaņas apstrāde, kam seko 5 minūšu quiescence), tūlīt pēc pirmās ultraskaņas apstrādes tika konstatēts ievērojams ThT fluorescences pieaugums.

Straujš fibrilācijas kinētikas paātrinājums

(2011) iegūtie rezultāti parādīja, ka β2-mikroglobulīna spontānu fibrilu veidošanos pie pH 2,5 var paātrināt no vairākām stundām līdz tikai 10–15 minūtēm ar ultrasonikāciju.
Atomu spēka mikroskopijas (AFM) attēli apstiprināja, ka fibrili, kas radīti, izmantojot 10 minūšu ultrasonikāciju ik pēc 15 minūtēm, morfoloģiski neatšķiras no tiem, kas veidoti, izmantojot 1 minūtes ultrasonikāciju ik pēc 10 minūtēm. Tas izceļ ultrasoniski izraisītās amiloīda fibrilācijas reproducējamību un izturību.

AFM attēli no amiloīda fibriliem, ko ražo 1 min ultrasonikācija ik pēc 10 minūtēm (i), ar 10 minūšu ultraskaņu ik pēc 15 minūtēm (ii) un ar sēšanas reakciju bez ultrasonikācijas (iii). Baltā skalas josla apzīmē 1 μm.
Pētījums un attēli: ©So et al., 2011

Fibrilācija neitrālos pH apstākļos

Pat neitrālos pH apstākļos fibrila veidošanās tika panākta pēc 1,5 stundu kavēšanās laika, parādot, ka ultrasonication ievērojami pazemina enerģētisko barjeru nukleācijai un augšanai. Tas vēl vairāk atbalsta hipotēzi, ka amiloīda fibrilācija galvenokārt ir fiziska reakcija, ko lielā mērā ierobežo nukleācijas enerģijas barjera, ko ultrasonication efektīvi samazina.

Ietekme uz amiloīdu izraisītu slimību pētniecību

Facile un uzticama amiloīdu fibrilu veidošanās, izmantojot UIP400MTP mikroplates sonikatoru, būtiski ietekmē Alcheimera slimības (AD) pētījumus un citus ar amiloīdiem saistītus traucējumus, piemēram, Parkinsona slimību, II tipa diabētu un sistēmiskas amiloidozes. AD gadījumā amiloīda-β (Aβ) agregācija ir galvenā patoloģiskā pazīme, tomēr tās fibrilācijas kinētikas izpēte joprojām ir sarežģīta, ņemot vērā garās nobīdes fāzes un tradicionālo metožu mainīgumu. Ultrasonication virzīta fibrila veidošanās paātrina nukleāciju, nodrošinot augstu reproducējamību un samazinātu mainīgumu, kas ir izšķirošs potenciālo inhibitoru skrīningam un amiloidogēno mehānismu izpratnei. Turklāt UIP400MTP augstā caurlaidspējas spēja ļauj veikt plaša mēroga pētījumus par olbaltumvielu sajaukšanos un agregāciju, veicinot terapeitisko līdzekļu atklāšanu, kas var modulēt fibrila veidošanos un potenciāli mazināt neirodeģeneratīvo progresēšanu.

Šis pētījums nosaka ultrasonikāciju, izmantojot UIP400MTP vairāku urbumu plāksnes sonikatoru kā ļoti efektīvu metodi amiloīda fibrila veidošanās paātrināšanai. Šīs pieejas galvenās priekšrocības ir šādas:

• Dramatisks fibrilācijas kavēšanās laika samazinājums.
• Vienmērīga ultraskaņas iedarbība visās akās, kas ļauj reproducēt fibrilu veidošanos.
• Augstas caurlaidspējas skrīninga spēja, padarot to piemērotu proteīna amiloidogenitātes meklēšanai genoma mērogā.

Integrējot ultrasonication ar ThT fluorescences noteikšanu, šī metode nodrošina ātru, mērogojamu un uzticamu platformu amiloīda fibrilācijas izpētei. Ņemot vērā tās efektivitāti un augstas caurlaidspējas potenciālu, šī pieeja var atvieglot amiloīda fibrilu facile sintēzi biofizikālajiem un farmaceitiskajiem pētījumiem, piedāvājot daudzsološu instrumentu ar amiloīdiem saistītiem pētījumiem un zāļu skrīningam.