PMCA prionu augstas caurlaidspējas noteikšanai, izmantojot UIP400MTP Sonicator

UIP400MTP vairāku urbumu plāksnes sonikators piedāvā spēcīgu risinājumu augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanai olbaltumvielu misfolding cikliskajā pastiprināšanā (PMCA). Nodrošinot vienmērīgu enerģijas sadalījumu vairākos urbumos un saglabājot precīzus ultraskaņas parametrus, šī sistēma ļauj vienlaicīgi apstrādāt daudzus paraugus ar izcilu reproducējamību. Šīs spējas ir kritiski svarīgas, lai optimizētu PMCA, lai atklātu prionus zemā koncentrācijā izaicinošos bioloģiskos paraugos, piemēram, siekalās, kur testa inhibitori var aizēnot rezultātus.

Prionu slimības, piemēram, hroniska novājēšanas slimība (HNS) briežu dzimtas dzīvniekiem un Kreicfelda-Jakoba slimība (CJD) cilvēkiem, ir neirodeģeneratīvi traucējumi, ko izraisa nepareizi salocīti prionu proteīni (PrP^Sc). Šīs slimības bieži ir saistītas ar zemu infekciozo prionu līmeni ķermeņa šķidrumos, piemēram, siekalās, asinīs un urīnā, sarežģījot diagnostiku un pētījumus. HNS horizontālai pārnešanai caur prioniem, kas izklāti vides matricās, ir īpaši būtiska ietekme uz savvaļas dzīvnieku apsaimniekošanu un ekoloģisko veselību. Tāpat tādās slimībās kā Kreicfelda-Jakoba slimība uzticama nepareizi salocītu prionu proteīnu pastiprināšana no cilvēku paraugiem ir būtiska, lai veicinātu diagnostiku un izprastu slimības progresēšanu.

Modificēta PMCA protokola piemērošana ļauj apiet parastos testa inhibitorus (piemēram, mucīnus siekalās) un sasniegt augstu jutību, nosakot prionus, kas citādi būtu nenosakāmi vai neskaidri, izmantojot tādas metodes kā reāllaika trīcēšanas izraisīta pārveidošana (RT-QuIC). Šie sasniegumi uzlabo prionu noteikšanu dažādām slimībām, padarot PMCA par neaizstājamu instrumentu prionu izpētei un diagnostikai. Vairāku urbumu plates ultraskaņas UIP400MTP atvieglo augstas caurlaidspējas PMCA, apstrādājot daudzus paraugus mikroplatēs (piemēram, 6, 24 vai 96 urbumu platēs) vai flakonos cauruļu statīvā.

Protokols augstas caurlaidspējas proteīnu misfolding cikliskajai amplifikācijai (PMCA)

Šis protokols ļauj efektīvi apstrādāt lielu paraugu skaitu tieši tādos pašos apstākļos, lai iegūtu stabilus pētījumu rezultātus.

Parauga sagatavošana

Izejvielas:
Sagatavo paraugus:

• Sarkosila ekstrakcijas granulu atkārtota saskalošana PMCA substrātā.
• Tieši spiking smadzeņu homogenātus vai asins paraugus ar prionu sēklām.

Substrāts:

• Izmantojiet 10% (masas/tilp.) smadzeņu homogenātu, kas sagatavots no transgēnām pelēm, kuras pārmērīgi ekspresē PrP^C (piemēram, Tg peles).
• Homogenizējiet smadzeņu audus:
  – 1× PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Līdz lietošanai substrātu uzglabā -80 °C temperatūrā.

Parauga iestatīšana mikroplatē vai mēģenēs:
Caurules:

• Pievieno 90 μl smadzeņu homogenāta substrāta un sēklas ar 10 μL parauga (piemēram, asinīm, smadzeņu homogenātu vai sarkozila granulveida nogulšņu nogulšņiem).
• Ievietojiet 3 teflona lodītes (1,59 mm vai 2,38 mm diametrā) katrā 0,2 ml mēģenē.
• Uzstādiet caurules statīvā, kas ir saderīgs ar UIP400MTP sonikatoru.

6 urbumu mikroplate:

• Pievieno 5 ml smadzeņu homogenāta substrāta un sēklas ar 500 μL parauga uz iedobi.
• Katrā iedobē pievienojiet 3 teflona krelles.

PMCA procedūra

Izvietošana:
Ievietojiet cauruļu statīvu vai 6 iedobju mikroplati UIP400MTP sonikatorā saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

Riteņbraukšanas programma:
Veiciet 144 PMCA ciklus šādi:

• Inkubācija: 29 minūtes un 30 sekundes 37 °C temperatūrā.
• Ultraskaņas apstrāde: 30 sekundes ar 60% amplitūdu.
• Temperatūras uzraudzība: Izmantojiet pievienojamo temperatūras sensoru, lai uzraudzītu parauga temperatūru, un ieprogrammējiet UIP400MTP līdz maksimālajai temperatūrai 48–50 °C.

Nākamās kārtas:
Pēc 144 ciklu pirmās kārtas pabeigšanas pārnesiet pastiprinātā materiāla alikvotu daļu:

• Atšķaida 10 reizes svaigā transgēnā peļu smadzeņu homogenāta substrātā.
• Veiciet 96 PMCA ciklus nākamajām kārtām, saglabājot tos pašus ultraskaņas parametrus.
• Turpiniet ar vēlamo raundu skaitu (parasti līdz 5).

PrP noteikšana^Sc

1. Proteināzes K gremošana:
   – Paraugus 1 stundu apstrādā ar proteināzi K (50 μg/ml) 37°C temperatūrā.
   – Šķelšanu pārtrauc, pievienojot SDS parauga buferšķīdumu un vārot 10 minūtes.
2. Western Blot analīze:
   – Analizējiet sagremotos paraugus, izmantojot:
   – 6H4 vai PRC1 anti-PrP antivielas.
   – Veiciet SDS-PAGE un pārsūtiet uz PVDF membrānām noteikšanai.

 

 

Apstrādājiet vairāk paraugu, lai iegūtu stabilākus rezultātus

UIP400MTP vairāku urbumu plāksnes ultraskaņas apstrādātājs ievērojami uzlabo proteīnu sajaukšanas cikliskās pastiprināšanas (PMCA) efektivitāti un mērogojamību, risinot procedūras tradicionāli laikietilpīgo raksturu. Ļaujot vienlaicīgi apstrādāt līdz 96 paraugiem 96 urbumu plāksnē, sistēma racionalizē PMCA darbplūsmas, vienlaikus saglabājot precīzus un vienādus ultraskaņas apstākļus visos urbumos. Šī augstas caurlaidspējas spēja samazina manuālo apstrādi, samazina darbietilpīgus soļus un nodrošina reproducējamību, padarot to par neaizstājamu rīku prionu izpētei. Neatkarīgi no tā, vai tiek pētīta hroniska novājēšanas slimība vai Kreicfelda-Jakoba slimība, UIP400MTP veicina liela mēroga pētījumus ar lielāku efektivitāti, ļaujot pētniekiem apmierināt mūsdienu diagnostikas un zinātnisko pielietojumu prasības.

---

---

Literatūra / Atsauces

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.