PMCA fir High-Throughput Detektioun vu Prionen mam UIP400MTP Sonicator

Den UIP400MTP Multi-Well Platte Sonicator bitt eng mächteg Léisung fir High-Throughput Probe Virbereedung an Protein misfolding cyclic amplification (PMCA). Andeems Dir eenheetlech Energieverdeelung iwwer verschidde Wellen liwwert a präzis Sonikatiounsparameter behalen, erméiglecht dëse System d'simultan Veraarbechtung vu ville Proben mat aussergewéinlecher Reproduktioun. Dës Fäegkeeten si kritesch fir PMCA ze optimiséieren fir Prionen bei niddrege Konzentratioune bei usprochsvollen biologesche Proben z'entdecken, sou wéi Spaut, wou Assay-Inhibitoren Resultater verstoppen kënnen.

Prion Krankheeten, wéi chronesch Verschwendungskrankheeten (CWD) bei Cervids a Creutzfeldt-Jakob Krankheet (CJD) bei Mënschen, sinn neurodegenerative Stéierunge verursaacht duerch falsch geklappte Prionproteine (PrP)^Sc). Dës Krankheeten involvéieren dacks niddereg Niveaue vun infektiiv Prionen a Kierperflëssegkeeten, wéi Spaut, Blutt an Urin, wat d'Diagnos a Fuerschung komplizéiert. Horizontal Iwwerdroung vu CWD duerch Prionen, déi an Ëmweltmatrixen ofgeschaaft ginn, huet besonnesch bedeitend Implikatioune fir d'Wëldmanagement an d'ökologesch Gesondheet. Ähnlech, a Krankheeten wéi Creutzfeldt-Jakob Krankheet, ass zouverlässeg Verstäerkung vu falsch geklappte Prionproteine vu mënschleche Proben entscheedend fir Diagnostik ze förderen an d'Progressioun vun der Krankheet ze verstoen.

D'Applikatioun vun engem modifizéierten PMCA Protokoll erlaabt allgemeng Assay-Inhibitoren (zB Mucinen am Spaut) ëmzegoen an eng héich Sensibilitéit z'erreechen fir Prionen z'entdecken déi soss ondetektabel oder zweedeiteg mat Techniken wéi Echtzäit Quaking-induzéiert Konversioun (RT-QuIC) wieren. Dës Fortschrëtter verbesseren d'Priondetektioun fir verschidde Krankheeten, wat PMCA en onverzichtbar Instrument fir Prionfuerschung an Diagnostik mécht. De Multi-Well Plate Sonicator UIP400MTP erliichtert High-Throughput PMCA sonicating vill Proben a Mikroplaten (zB 6-, 24- oder 96-Well Placke) oder Fläschen an engem Röhre Rack.

Protokoll fir High-Throughput Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA)

De folgende Protokoll erlaabt d'effizient Veraarbechtung vun enger héijer Probezuel ënner de genaueselwechte Konditioune fir robust Fuerschungsresultater.

Prouf Virbereedung

Startmaterial:
Bereet Proben duerch:

• Resuspending Sarkosyl Extraktioun Pellets am PMCA Substrat.
• Direkt spike Gehirhomogenaten oder Bluttprouwen mat Prion Somen.

Substrat:

• Benotzt en 10% (wt / vol) Gehirhomogenat virbereet aus transgenen Mais, déi PrP iwwerausdrécken^C (zB Tg Mais).
• Homogeniséiere vum Gehirngewebe an:
  – 1 × PBS.
  – 150 mM NaCl.
  – 1% Triton X-100.
• Späichert de Substrat bis zum Gebrauch bei -80ºC.

Sample Setup a Microplate oder Tubes:
Tubes:

• Füügt 90 μL Gehirhomogenat Substrat a Somen mat 10 μL Probe (zB Blutt, Gehirhomogenat oder Sarkosyl Pellet).
• Plaz 3 Teflon Perlen (1,59 mm oder 2,38 mm Duerchmiesser) an all 0,2 ml Röhre.
• Montéiert d'Réier an engem Rack kompatibel mam UIP400MTP Sonicator.

6-Well Mikroplatte:

• Füügt 5 mL Gehir homogenat Substrat a Somen mat 500 μL Probe pro Brunn.
• Füügt 3 Teflonpärelen an all Brunn.

PMCA Prozedur

Placement:
Place de Rouer Rack oder 6-Well Mikroplate an den UIP400MTP Sonicator no den Instruktioune vum Hiersteller.

Vëlo Programm:
Maacht 144 PMCA Zyklen wéi follegt:

• Inkubatioun: 29 Minutten an 30 Sekonnen bei 37 ° C.
• Sonication: 30 Sekonnen op 60% Amplituden.
• Iwwerwaacht d'Temperatur: Benotzt den pluggbare Temperatursensor fir d'Probetemperatur ze iwwerwaachen an den UIP400MTP op e max. Temperatur vun 48-50 ° C.

Folgend Ronnen:
Nodeems Dir déi éischt Ronn vun 144 Zyklen ofgeschloss hutt, transferéiert en Aliquot vum verstäerkte Material:

• Verdünnt 10-fach a frësche transgenen Maus Gehir homogenat Substrat.
• Féiert 96 PMCA Zyklen fir spéider Ronnen, behalen déiselwecht Sonikatiounsparameter.
• Fuert weider fir déi gewënscht Zuel vu Ronnen (typesch bis zu 5).

Detektioun vu PrP^Sc

1. Proteinase K Verdauung:
   – Behandelt Proben mat Proteinase K (50 μg / ml) bei 37 ° C fir 1 Stonn.
   – Ofschléissen d'Verdauung andeems Dir SDS-Probe-Puffer derbäigesat a fir 10 Minutten kachen.
2. Western Blot Analyse:
   – Analyséiert verdaut Proben mat:
   – 6H4 oder PRC1 Anti-PrP Antikörper.
   – Maacht SDS-PAGE a transferéiert op PVDF Membranen fir Detektioun.

 

 

Prozess Méi Echantillon fir méi robust Resultater

Den UIP400MTP Multi-Well Platte Sonicator verbessert d'Effizienz an d'Skalierbarkeet vun der Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) wesentlech verbessert, déi traditionell Zäitopwendeg Natur vun der Prozedur adresséiert. Andeems de gläichzäiteg Veraarbechtung vu bis zu 96 Proben an enger 96-Well Plack erlaabt, streamlines de System PMCA Workflows wärend präzis an eenheetlech Sonikatiounsbedéngungen iwwer all Brunnen behalen. Dës High-Throughput-Kapazitéit miniméiert manuell Handhabung, reduzéiert Aarbechtsintensiv Schrëtt a garantéiert d'Reproduzibilitéit, sou datt et en onverzichtbare Tool fir Prionfuerschung gëtt. Egal ob d'chronesch Verschwendungskrankheet oder d'Creutzfeldt-Jakob Krankheet ënnersicht, d'UIP400MTP erliichtert grouss Studien mat méi Effizienz, wat d'Fuerscher erméiglecht d'Ufuerderunge vun modernen diagnostesche a wëssenschaftleche Applikatiounen z'erreechen.

---

---

Literatur / Referenzen

• FactSheet UIP400MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• Lauren E. Cruchley-Fuge, Martin R. Jones, Ossama Edbali, Gavin R. Lloyd, Ralf J. M. Weber, Andrew D. Southam, Mark R. Viant (2024): Automated extraction of adherent cell lines from 24-well and 96-well plates for multi-omics analysis using the Hielscher UIP400MTP sonicator and Beckman Coulter i7 liquid handling workstation. Metabomeeting 2024, University of Liverpool, 26-28th November 2024.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
• Martins KB, Ferreira AM, Pereira VC, Pinheiro L, Oliveira A, Cunha MLRS (2019): In vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus saprophyticus Isolated From Patients With Urinary Tract Infections. Frontiers in Microbiology 2019.
• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mochizuki, Chika; Taketomi, Yoshitaka; Irie, Atsushi; Kano, Kuniyuki; Nagasaki, Yuki; Miki, Yoshimi; Ono, Takashi; Nishito, Yasumasa; Nakajima, Takahiro; Tomabechi, Yuri; Hanada, Kazuharu; Shirouzu, Mikako; Watanabe, Takashi; Hata, Kousuke; Izumi, Yoshihiro; Bamba, Takeshi; Chun, Jerold; Kudo, Kai; Kotani, Ai; Murakami, Makoto (2024): Secreted phospholipase PLA2G12A-driven lysophospholipid signaling via lipolytic modification of extracellular vesicles facilitates pathogenic Th17 differentiation. BioRxiv 2024.
• Cosenza-Contreras M, Seredynska A, Vogele D, Pinter N, Brombacher E, Cueto RF, Dinh TJ, Bernhard P, Rogg M, Liu J, Willems P, Stael S, Huesgen PF, Kuehn EW, Kreutz C, Schell C, Schilling O. (2024): TermineR: Extracting information on endogenous proteolytic processing from shotgun proteomics data. Proteomics. 2024.