Transformasi Genetik pada Sel Tumbuhan menggunakan Ultrasonik

Transformasi yang Dimediasi Agrobacterium dengan Bantuan Sonikasi (SAAT) merupakan metode yang efisien untuk menginfeksi sel tumbuhan dengan gen asing menggunakan Agrobacterium sebagai pembawa. Kavitasi ultrasonik menyebabkan sonoporasi, yang dapat dijelaskan sebagai pembentukan luka mikro secara terarah pada jaringan tumbuhan. Melalui luka mikro yang terbentuk secara ultrasonik ini, DNA dan vektor DNA dapat diangkut secara efisien ke dalam matriks sel.

Sonoporasi – Transformasi Sel yang Ditingkatkan secara Ultrasonik

Ketika ultrasonik berfrekuensi rendah (sekitar 20kHz) diterapkan pada suspensi sel, efek kavitasi akustik menyebabkan permeabilisasi membran sementara pada jaringan sel. Efek ultrasonik ini dikenal sebagai sonoporasi dan digunakan untuk transfer gen ke dalam sel atau jaringan.
Keunggulan ultrasonikasi didasarkan pada prinsip kerja mekanis nontermalnya, yang sering kali membuat sonikasi lebih serbaguna dan tidak terlalu bergantung pada jenis sel. Penerapan sonoporasi yang serbaguna membuka kemungkinan pemanfaatan tumbuhan transgenik, yang memiliki potensi besar dalam bioproduksi protein terapeutik manusia yang kompleks. Bioreaktor berbasis tumbuhan semacam ini dapat dengan mudah dimanipulasi secara genetik, mencegah potensi kontaminasi patogen manusia, tidak merusak bakteri yang memediasi transformasi (misalnya Agrobacterium), dan merupakan metode biosintesis yang murah dan efektif.

Transformasi Sel dengan Bantuan Ultrasonik

Sonikasi merupakan teknik yang menerapkan gelombang ultrasonik berfrekuensi rendah untuk menggerakkan partikel dalam larutan dan mencampur larutan, sehingga meningkatkan laju perpindahan massa dan pelarutan. Secara bersamaan, sonikasi dapat menghilangkan gas terlarut dari cairan. Dalam transformasi tumbuhan, sonikasi akan menyebabkan pembentukan luka mikro pada jaringan tumbuhan dan meningkatkan penghantaran DNA telanjang ke dalam protoplas tumbuhan.

Untuk transformasi genetik, Transformasi yang Dimediasi Agrobacterium dengan Bantuan Sonikasi (SAAT) merupakan metode pilihan dan memiliki efisiensi yang jauh lebih tinggi dibandingkan sonikasi yang digunakan untuk mentransfer DNA telanjang dan vektor DNA secara langsung ke dalam protoplas. Berbagai penelitian telah menunjukkan bahwa transformasi yang dimediasi Agrobacterium dengan bantuan sonikasi (SAAT) dapat digunakan untuk menginduksi disrupsi mekanis dan pembentukan luka pada sel tumbuhan melalui gelombang ultrasonik serta kavitasi akustik yang dihasilkannya. Perlakuan ultrasonik singkat membentuk luka mikro pada permukaan eksplan. Sel yang terluka memungkinkan penetrasi Agrobacterium ke bagian jaringan tumbuhan yang lebih dalam, sehingga meningkatkan kemungkinan sel tumbuhan terinfeksi. Selain itu, senyawa fenolik yang disekresikan meningkatkan transformasi. Luka mikro yang dihasilkan secara ultrasonik juga mempermudah penetrasi bakteri ke dalam eksplan. SAAT telah berhasil digunakan untuk transformasi genetik pada spesies tumbuhan yang secara khusus dianggap resistan terhadap Agrobacterium.
Metodenya yang sangat sederhana dan murah, serta peningkatan signifikan transfer gen yang dimediasi Agrobacterium, merupakan keunggulan utama SAAT. Selain keberhasilan penerapan SAAT dalam transformasi Chenopodium rubrum L. dan Beta vulgaris L., pendekatan ini juga telah diterapkan dalam produksi holotoksin labil panas tipe liar Escherichia coli rekombinan dan adjuvan vaksin LT mutan Escherichia coli pada Nicotiana tabacum, dengan titer IgG sistemik spesifik LT-B tertinggi terdeteksi pada burung.
(lihat Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka and R. Baranski, 2014)

Prosedur Umum Transfer Gen melalui Sonoporasi pada Sel Tumbuhan

1. Persiapan Materi Genetik: Mulailah dengan menyiapkan materi genetik yang ingin Anda masukkan ke dalam sel tumbuhan. Materi ini dapat berupa DNA plasmid, RNA, atau asam nukleat lainnya.
2. Isolasi Sel Tumbuhan: Isolasi sel tumbuhan yang ingin Anda jadikan target. Bergantung pada eksperimen Anda, sel ini dapat diisolasi dari jaringan atau kultur tumbuhan.
3. Suspensi Sel: Suspensikan sel tumbuhan dalam medium atau larutan penyangga yang sesuai. Langkah ini penting untuk memastikan sel tetap sehat dan berada dalam kondisi yang mendukung pengambilan gen.
4. Pengaturan Sonikator Anda: Siapkan sonikator tipe probe Anda dengan mengatur terlebih dahulu parameter sonikasi seperti amplitudo, waktu, energi, dan suhu. Celupkan probe ultrasonik ke dalam suspensi sel.
5. Sonikasi: Mulailah prosedur sonikasi. Osilasi cepat ujung probe menghasilkan gelembung kavitasi dalam cairan. Gelembung ini mengembang dan runtuh akibat gelombang ultrasonik, sehingga menciptakan gaya mekanis dan aliran mikro dalam suspensi.
6. Sonoporasi: Gaya mekanis dan aliran mikro yang dihasilkan oleh kavitasi membentuk pori dan lubang sementara pada membran sel tumbuhan. Materi genetik yang ada dalam suspensi dapat memasuki sel tumbuhan melalui pori ini.
7. Inkubasi: Setelah perlakuan sonoporasi, inkubasi sel tumbuhan agar dapat pulih dan menstabilkan membrannya. Langkah ini sangat penting untuk memastikan kelangsungan hidup sel dan keberhasilan transfer gen.

Transfer Gen melalui Agrobacterium atau Liposom

Terdapat dua cara umum untuk mentransfeksi sel tumbuhan. Keduanya menggunakan Agrobacterium, suatu genus bakteri Gram-negatif, atau liposom sebagai pembawa materi genetik.

• Sonoporasi yang Dimediasi Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri yang umum digunakan dalam rekayasa genetika tumbuhan. Dalam metode ini, DNA plasmid yang mengandung gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam Agrobacterium, yang kemudian dicampur dengan sel tumbuhan. Suspensi sel menjalani sonoporasi menggunakan sonikator tipe probe. Energi ultrasonik meningkatkan transfer materi genetik dari Agrobacterium ke sel tumbuhan. Metode ini banyak digunakan untuk modifikasi genetik tumbuhan.
• Sonoporasi yang Dimediasi Liposom: Liposom merupakan vesikel berbasis lipid yang dapat membawa materi genetik. Dalam metode ini, liposom yang dimuati DNA plasmid atau asam nukleat lainnya dicampur dengan sel tumbuhan. Sonoporasi menggunakan sonikator tipe probe diterapkan untuk memfasilitasi pengambilan liposom oleh sel tumbuhan. Ultrasonik mendisrupsi lapisan ganda lipid liposom, sehingga melepaskan materi genetik ke dalam sel tumbuhan. Pendekatan ini berguna untuk penelitian ekspresi gen sementara pada sel tumbuhan.

Manfaat Transformasi yang Dimediasi Agrobacterium dengan Bantuan Sonikasi (SAAT) yang Terbukti secara Ilmiah

Transformasi yang Dimediasi Agrobacterium dengan Bantuan Sonikasi (SAAT) telah diterapkan pada banyak spesies tumbuhan. Perlakuan ultrasonik yang singkat dan relatif ringan pada kultur sel tumbuhan menyebabkan sonoporasi, yang selanjutnya memungkinkan penetrasi mendalam Agrobacterium sebagai pembawa gen. Di bawah ini Anda dapat membaca contoh penelitian yang menunjukkan efek menguntungkan SAAT.

Transformasi Ashwagandha dengan Bantuan Ultrasonik

Untuk meningkatkan efisiensi transformasi pada W. somnifera (dikenal sebagai ashwagandha atau ceri musim dingin), Dehdashti dan rekan-rekannya (2016) meneliti penggunaan asetosiringon (AS) dan sonikasi.
Asetosiringon (AS) ditambahkan pada tiga tahap: kultur cair Agrobacterium, infeksi Agrobacterium, dan kokultur eksplan dengan Agrobacterium. Penambahan 75 μM AS ke kultur cair Agrobacterium ditemukan optimal untuk induksi gen vir.
Penerapan tambahan sonikasi (SAAT) menghasilkan ekspresi gen tertinggi. Ekspresi gen gusA pada akar rambut ditemukan paling baik ketika daun dan ujung tunas disonikasi masing-masing selama 10 dan 20s. Efisiensi transformasi protokol yang disempurnakan tercatat masing-masing sebesar 66,5 dan 59,5% untuk eksplan daun dan ujung tunas. Dibandingkan dengan protokol lain, efisiensi transformasi protokol yang disempurnakan ini ditemukan 2,5 kali lebih tinggi untuk daun dan 3,7 kali lebih tinggi untuk ujung tunas. Analisis Southern blot mengonfirmasi 1–2 salinan transgen gusA pada galur W1-W4, sedangkan 1–4 salinan transgen terdeteksi pada galur W5 yang dihasilkan dengan protokol yang disempurnakan.

Pengaruh durasi transformasi yang dimediasi Agrobacterium dengan bantuan sonikasi (SAAT) terhadap frekuensi transformasi eksplan daun (a) dan ujung tunas (b) W. somnifera
(penelitian dan grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Transformasi Kapas dengan Bantuan Ultrasonik

Hussain et al. (2007) menunjukkan efek menguntungkan transformasi kapas dengan bantuan sonikasi. Kavitasi akustik yang disebabkan oleh ultrasonik berfrekuensi rendah membentuk luka mikro pada dan di bawah permukaan jaringan tumbuhan (sonoporasi) serta memungkinkan Agrobacterium bergerak lebih dalam dan menyebar ke seluruh jaringan tumbuhan. Cara pembentukan luka ini meningkatkan kemungkinan infeksi sel tumbuhan yang terletak lebih dalam di jaringan. Untuk mengevaluasi efisiensi transformasi SAAT, ekspresi gen GUS diukur. Sistem pelapor GUS merupakan sistem gen pelapor yang sangat berguna dalam biologi molekuler tumbuhan dan mikrobiologi. Dengan menyesuaikan berbagai parameter SAAT, ekspresi sementara GUS pada kapas menggunakan embrio matang sebagai eksplan meningkat secara signifikan. GUS pertama kali terdeteksi 24h setelah inkubasi eksplan dan pada 48h, ekspresi GUS sangat kuat, sehingga menjadi indikator yang berguna untuk keberhasilan transformasi eksplan kapas setelah transformasi yang dimediasi Agrobacterium dengan bantuan sonikasi (SAAT). Dalam perbandingan berbagai teknik transformasi (yaitu biolistik, Agro, BAAT, SAAT), transformasi yang dimediasi Agrobacterium dengan bantuan sonikasi (SAAT) menunjukkan hasil transformasi yang jauh paling baik.

Pemilihan prosedur transformasi berdasarkan ekspresi sementara GUS. Transformasi yang dimediasi Agrobacterium dengan bantuan sonikasi (SAAT) menunjukkan ekspresi sementara yang secara signifikan lebih tinggi.
(penelitian dan grafik: © Hussain et al., 2007)

Solusi Ultrasonik Berkinerja Tinggi untuk Sonoporasi dan SAAT

Hielscher Ultrasonics memiliki pengalaman panjang dalam pengembangan dan pembuatan sonikator berkinerja tinggi untuk laboratorium, fasilitas penelitian, serta produksi industri dengan kapasitas pemrosesan yang sangat tinggi. Untuk mikrobiologi dan ilmu hayati, Hielscher menawarkan berbagai solusi guna memenuhi beragam kebutuhan jaringan tertentu dan perlakuannya. Untuk ultrasonikasi banyak sampel secara bersamaan, Hielscher menawarkan UIP400MTP untuk pelat multisumur, VialTweeter untuk sonikasi hingga 10 vial (misalnya tabung Eppendorf), atau CupHorn ultrasonik. Sonikator tipe probe tersedia dengan daya dari 50 hingga 400 watt sebagai homogenizer laboratorium, sedangkan sistem industri mencakup rentang daya dari 500 watt hingga 16kW.
Silakan hubungi kami dan sampaikan kebutuhan aplikasi serta proses Anda. Staf kami yang berpengalaman akan dengan senang hati merekomendasikan sonikator yang paling sesuai untuk proses biologis Anda.
Tabel di bawah ini memberikan gambaran perkiraan kapasitas pemrosesan sonikator kami: