Transformasi Genetik pada Sel Tumbuhan menggunakan Ultrasonik

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) adalah metode yang efisien untuk menginfeksi sel tumbuhan dengan gen asing menggunakan Agrobacterium sebagai transporter. Kavitasi ultrasonik menyebabkan sonoporasi, yang dapat digambarkan sebagai luka mikro yang ditargetkan pada jaringan tanaman. Melalui ultrasonik ini menciptakan luka mikro, DNA dan vektor DNA dapat diangkut secara efisien ke dalam matriks sel.

sonoporasi – Transformasi Sel yang Ditingkatkan Secara Ultrasonik

Ketika ultrasound frekuensi rendah (sekitar 20kHz) diterapkan pada suspensi sel, efek kavitasi akustik menyebabkan permeabilisasi membran transien pada jaringan sel. Efek ultrasonik ini dikenal sebagai sonoporasi dan digunakan untuk transfer gen ke dalam sel atau jaringan.
Keuntungan dari ultrasonikasi didasarkan pada prinsip kerja mekanis non-termal, yang membuat sonikasi seringkali lebih serbaguna dan kurang bergantung pada jenis sel. Aplikasi serbaguna sonoporasi membuka kemungkinan pemanfaatan tanaman transgenik, yang memiliki potensi signifikan dalam bioproduksi protein terapeutik manusia yang kompleks. Bioreaktor nabati semacam itu dapat dengan mudah dimanipulasi secara genetik, mencegah potensi kontaminasi dengan patogen manusia, tidak merusak bakteri yang memediasi transformasi (misalnya Agrobacterium), dan merupakan metode bio-sintesis yang murah dan berkhasiat.

Transformasi Sel Berbantuan Ultrasonik

Sonikasi adalah teknik yang menerapkan gelombang ultrasound frekuensi rendah untuk mengaduksi partikel dalam larutan, untuk mencampur larutan, sehingga meningkatkan laju perpindahan massa dan pembubaran. Secara bersamaan, sonikasi dapat menghilangkan gas terlarut dari cairan. Dalam transformasi tanaman, sonikasi akan menyebabkan pembentukan luka mikro pada jaringan tanaman dan meningkatkan pengiriman DNA telanjang ke dalam protoplas tanaman.

Untuk transformasi genetik, Transformasi yang dimediasi Agrobacterium Berbantuan Sonication (SAAT) adalah metode yang disukai dan memiliki efisiensi yang jauh lebih tinggi daripada sonikasi yang digunakan untuk mentransfer DNA telanjang dan vektor DNA langsung ke protoplas. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa transformasi yang dimediasi Agrobacterium (SAAT) yang dibantu sonikasi dapat digunakan untuk menginduksi gangguan mekanis dan pembentukan luka pada sel tumbuhan oleh gelombang ultrasound dan kavitasi akustik yang dihasilkan. Perawatan ultrasonik singkat menciptakan luka mikro pada permukaan eksplant. Karena sel-sel yang terluka akan memungkinkan penetrasi Agrobacterium ke bagian yang lebih dalam dari jaringan tanaman, sehingga meningkatkan kemungkinan sel tumbuhan terinfeksi. Selain itu, senyawa fenolik yang disekresikan meningkatkan transformasi. Luka mikro yang dihasilkan secara ultrasonik membuat penetrasi eksplan oleh bakteri juga lebih layak. SAAT berhasil digunakan untuk transformasi genetik pada spesies tanaman yang terutama dianggap resisten terhadap Agrobacterium.
Menjadi metode yang sangat sederhana dan murah, serta peningkatan signifikan dari transfer gen yang dimediasi Agrobacterium adalah keuntungan utama dari SAAT. Selain keberhasilan penerapan SAAT dalam transformasi Chenopodium rubrum L. dan Beta vulgaris L., pendekatan ini juga telah diterapkan dalam produksi refuvan vaksin LT mutan mutan Escherichia pada Nicotiana tabacum, di mana titer IgG spesifik LT-B sistemik tertinggi terdeteksi pada burung.
(lih. Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka dan R. Baranski, 2014)

Prosedur Umum untuk Transfer Gen melalui Sonoporasi dalam Sel Tumbuhan

1. Persiapan Materi Genetik: Mulailah dengan menyiapkan materi genetik yang ingin Anda masukkan ke dalam sel tumbuhan. Ini bisa berupa DNA plasmid, RNA, atau asam nukleat lainnya.
2. Isolasi Sel Tumbuhan: Isolasi sel tumbuhan yang ingin Anda targetkan. Tergantung pada percobaan Anda, sel-sel ini dapat diisolasi dari jaringan atau kultur tanaman.
3. Suspensi Sel: Tangguhkan sel tumbuhan dalam media atau penyangga yang sesuai. Ini penting untuk memastikan bahwa sel-sel sehat dan dalam keadaan kondusif untuk penyerapan gen.
4. Siapkan Sonicator Anda: Siapkan sonicator tipe probe Anda dengan parameter pengaturan sebelumnya sonikasi seperti amplitudo, waktu, energi, dan suhu. Rendam probe ultrasonik ke dalam suspensi sel.
5. Sonikasi: Mulai prosedur sonikasi. Osilasi cepat dari ujung probe menghasilkan gelembung kavitasi dalam cairan. Gelembung-gelembung ini mengembang dan runtuh karena gelombang ultrasonik, menciptakan gaya mekanis dan microstreaming dalam suspensi.
6. Sonoporasi: Gaya mekanis dan microstreaming yang dihasilkan oleh kavitasi menciptakan pori-pori dan lubang sementara di membran sel tumbuhan. Bahan genetik yang ada dalam suspensi dapat masuk ke sel tumbuhan melalui pori-pori ini.
7. Inkubasi: Setelah perawatan sonoporasi, inkubasi sel tumbuhan agar mereka pulih dan menstabilkan membrannya. Ini adalah langkah penting untuk memastikan kelangsungan hidup sel dan transfer gen yang berhasil.

Transfer Gen Melalui Agrobacterium atau Liposom

Ada dua bentuk umum untuk mentransfeksi sel tumbuhan. Mereka menggunakan agrobacterium, genus bakteri Gram-negatif, atau liposom sebagai pembawa materi genetik.

• Sonoporasi yang Dimediasi Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri yang biasa digunakan dalam rekayasa genetika tanaman. Dalam metode ini, DNA plasmid yang mengandung gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam Agrobacterium, yang kemudian dicampur dengan sel tumbuhan. Suspensi sel mengalami sonoporasi menggunakan sonicator tipe probe. Energi ultrasonik meningkatkan transfer materi genetik dari Agrobacterium ke sel tumbuhan. Metode ini banyak digunakan untuk modifikasi genetik tanaman.
• Sonoporasi yang Dimediasi Liposom: Liposom adalah vesikel berbasis lipid yang dapat membawa materi genetik. Dalam metode ini, liposom yang sarat dengan DNA plasmid atau asam nukleat lainnya dicampur dengan sel tumbuhan. Sonoporasi menggunakan sonicator tipe probe digunakan untuk memfasilitasi penyerapan liposom oleh sel tumbuhan. Ultrasonografi mengganggu lapisan ganda lipid liposom, melepaskan materi genetik ke dalam sel tumbuhan. Pendekatan ini berguna untuk studi ekspresi gen transien pada sel tumbuhan.

Manfaat yang Terbukti Secara Ilmiah dari Transformasi yang Dimediasi Agrobacterium Berbantuan Sonikasi (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) telah diterapkan pada berbagai spesies tanaman. Perlakuan ultrasonik yang singkat dan relatif ringan dari kultur sel tumbuhan menyebabkan sonoporasi, yang kemudian memungkinkan penetrasi dalam Agrobacterium sebagai pengangkut gen. Di bawah ini Anda dapat membaca studi teladan yang menunjukkan efek menguntungkan dari SAAT.

Transformasi Ashwagandha yang Dibantu Ultrasonik

Untuk meningkatkan efisiensi transformasi pada W. somnifera (dikenal sebagai ashwagandha atau ceri musim dingin), Dehdashti dan rekannya (2016) menyelidiki penggunaan acetosyringone (AS) dan sonikasi.
Acetosyringone (AS) ditambahkan dalam tiga tahap: kultur cair Agrobacterium, infeksi Agrobacterium dan kultur bersama eksplan dengan Agrobacterium. Penambahan 75 μM AS ke kultur cair Agrobacterium ditemukan optimal untuk induksi gen vir.
Aplikasi tambahan sonikasi (SAAT) menghasilkan ekspresi gen tertinggi. Ekspresi gen gusA pada akar berbulu ditemukan paling baik ketika daun dan ujung pucuk masing-masing disonikasi selama 10 dan 20 detik. Efisiensi transformasi dari protokol yang ditingkatkan masing-masing tercatat 66,5 dan 59,5% dalam kasus eksplan daun dan ujung pucuk. Jika dibandingkan dengan protokol lain, efisiensi transformasi dari protokol yang ditingkatkan ini ditemukan 2,5 kali lebih tinggi untuk daun dan 3,7 kali lipat lebih banyak untuk ujung pucuk. Analisis Southern blot mengkonfirmasi 1-2 salinan transgen gusA di baris W1-W4, sementara 1-4 salinan transgen terdeteksi di baris W5 yang dihasilkan oleh protokol yang ditingkatkan.

Pengaruh durasi transformasi yang dimediasi Agrobacterium (SAAT) yang dibantu sonikasi pada frekuensi transformasi eksplan daun W. somnifera (a) dan ujung pucuk (b)
(studi dan grafik: © Dehdashti et al., 2016)

Transformasi kapas yang dibantu secara ultrasonik

Hussain et al. (2007) menunjukkan efek menguntungkan dari transformasi kapas yang dibantu sonikasi. Kavitasi akustik yang disebabkan oleh ultrasound frekuensi rendah menciptakan luka mikro di dan di bawah permukaan jaringan tanaman (sonoporasi) dan memungkinkan Agrobacterium untuk melakukan perjalanan lebih dalam dan sepenuhnya ke seluruh jaringan tanaman. Cara melukai ini meningkatkan kemungkinan menginfeksi sel-sel tumbuhan yang terletak lebih dalam di jaringan. Untuk mengevaluasi efisiensi transformasi SAAT, ekspresi gen GUS diukur. Sistem reporter GUS adalah sistem gen reporter, sangat berguna dalam biologi molekuler tanaman dan mikrobiologi. Menyesuaikan berbagai parameter SAAT, ekspresi transien GUS pada kapas menggunakan embrio dewasa sebagai eksplan ditingkatkan secara signifikan. GUS pertama kali terdeteksi 24 jam setelah inkubasi eksplan dan pada 48 jam, ekspresi GUS sangat intens yang berfungsi sebagai indikator yang berguna untuk keberhasilan transformasi eksplan kapas setelah transformasi yang dimediasi Agrobacterium (SAAT) yang dibantu sonikasi. Perbandingan berbagai teknik transformasi (yaitu biolistik, Agro, BAAT, SAAT), transformasi yang dimediasi Agrobacterium (SAAT) yang dibantu sonikasi menunjukkan hasil transformasi terbaik.

Pilihan prosedur transformasi berdasarkan ekspresi transien GUS. Transformasi yang dimediasi Agrobacterium (SAAT) yang dibantu sonikasi menunjukkan ekspresi transien yang jauh lebih tinggi.
(studi dan grafik: © Hussain et al., 2007)

Solusi Ultrasonik Kinerja Tinggi untuk Sonoporasi dan SAAT

Hielscher Ultrasonics telah lama berpengalaman dalam pengembangan dan pembuatan ultrasonicator berkinerja tinggi untuk laboratorium, fasilitas penelitian serta produksi industri dengan throughput yang sangat tinggi. Untuk mikrobiologi dan ilmu kehidupan, Hielscher menawarkan berbagai solusi untuk mengakomodasi berbagai persyaratan yang diperlukan untuk jaringan tertentu dan perawatannya. Untuk ultrasonikasi simultan dari banyak sampel, Hielscher menawarkan UIP400MTP untuk pelat multiwell, VialTweeter untuk sonikasi hingga 10 botol (misalnya, tabung Eppendorf) atau CupHorn ultrasonik. Ultrasonicator tipe probe tersedia dari 50 hingga 400 watt sebagai homogenizer laboratorium, sedangkan sistem industri mencakup rentang daya dari 500 watt hingga 16kW.
Silakan hubungi kami dan beri tahu kami tentang persyaratan aplikasi dan proses Anda. Staf kami yang berpengalaman akan dengan senang hati merekomendasikan ultrasonicator yang paling cocok untuk proses biologis Anda.
Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator kami: