Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) adalah metode yang efisien untuk menginfeksi sel tanaman dengan gen asing menggunakan Agrobacterium sebagai transporter. Kavitasi ultrasonik menyebabkan sonoporation, yang dapat digambarkan sebagai micro-wounding yang ditargetkan dari jaringan tanaman. Melalui ini secara ultrasonik menciptakan luka mikro, vektor DNA dan DNA dapat diangkut secara efisien ke dalam matriks sel.

sonoporation – Ultrasonically Peningkatan Transformasi Sel

Ketika ultrasound frekuensi rendah (sekitar 20kHz) diterapkan pada suspensi sel, efek kavitasi akustik menyebabkan permeabilisasi membran sementara pada jaringan sel. Efek ultrasonik ini dikenal sebagai sonoporation dan digunakan untuk transfer gen ke dalam sel atau jaringan.
Keuntungan ultrasonikasi didasarkan pada prinsip kerja mekanis non-termal, yang membuat sonikasi seringkali lebih fleksibel dan kurang tergantung pada jenis sel. Aplikasi sonoporation yang serbaguna membuka kemungkinan untuk pemanfaatan tanaman transgenik, yang memiliki potensi signifikan dalam bioproduksi protein terapeutik manusia yang kompleks. Bioreaktor nabati semacam itu dapat dengan mudah dimanipulasi secara genetik, mencegah potensi kontaminasi dengan patogen manusia, tidak merusak transformasi yang memediasi bakteri (misalnya Agrobacterium), dan merupakan metode bio-sintesis yang murah dan berkhasiat.

Transformasi Sel Ultrasonic-Assisted

Sonikasi adalah teknik yang menerapkan gelombang ultrasound frekuensi rendah untuk mengaduk partikel dalam larutan, untuk mencampur larutan, sehingga meningkatkan laju transfer massa dan pembubaran. Secara bersamaan, sonikasi dapat menghilangkan gas terlarut dari cairan. Dalam transformasi tanaman, sonikasi akan menyebabkan pembentukan microwound pada jaringan tanaman dan meningkatkan pengiriman DNA telanjang ke dalam protoplast tanaman.

Untuk transformasi genetik, Transformasi yang dimediasi Agrobacterium Sonication-Assisted (SAAT) adalah metode yang disukai dan memiliki efisiensi yang jauh lebih tinggi daripada sonikasi yang digunakan untuk mentransfer vektor DNA dan DNA telanjang langsung ke protoplast. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa transformasi yang dimediasi Agrobacterium yang dibantu sonikasi (SAAT) dapat digunakan untuk menginduksi gangguan mekanis dan pembentukan luka pada sel tanaman oleh gelombang ultrasound dan kavitasi akustik yang dihasilkan. Perawatan ultrasonik singkat menciptakan luka mikro pada permukaan eksplan. Karena sel-sel yang terluka akan memungkinkan penetrasi Agrobacterium ke bagian yang lebih dalam dari jaringan tanaman, sehingga meningkatkan kemungkinan sel-sel tanaman terinfeksi. Selain itu, senyawa fenolik yang disekresikan meningkatkan transformasi. Luka mikro yang dihasilkan secara ultrasonik membuat penetrasi eksplan oleh bakteri juga lebih layak. SAAT berhasil digunakan untuk transformasi genetik pada spesies tanaman yang dianggap tahan terhadap Agrobacterium.
Menjadi metode yang sangat sederhana dan murah, serta peningkatan yang signifikan dari transfer gen yang dimediasi Agrobacterium adalah keuntungan utama DARI SAAT. Terlepas dari keberhasilan penerapan SAAT dalam transformasi Chenopodium rubrum L. dan Beta vulgaris L., pendekatan ini juga telah diterapkan dalam produksi holotoksin panas-labil tipe liar Escherichia rekombinan dan adjuvan vaksin LT mutan Escherichia di Nicotiana tabacum, di mana titer IgG spesifik LT-B sistemik tertinggi terdeteksi pada burung.
(lihat Laere et al., 2016; M. Klimek-Chodacka dan R. Baranski, 2014)

Prosedur Umum untuk Transfer Gen melalui Sonoporasi dalam Sel Tumbuhan

1. Persiapan materi genetik: Mulailah dengan menyiapkan materi genetik yang ingin Anda masukkan ke dalam sel tumbuhan. Ini bisa berupa DNA plasmid, RNA, atau asam nukleat lainnya.
2. Isolasi Sel Tumbuhan: Pisahkan sel tanaman yang ingin Anda targetkan. Tergantung pada percobaan Anda, sel-sel ini dapat diisolasi dari jaringan tanaman atau kultur.
3. Penangguhan Sel: Tangguhkan sel tanaman dalam media atau penyangga yang sesuai. Hal ini penting untuk memastikan bahwa sel-sel sehat dan dalam keadaan kondusif untuk penyerapan gen.
4. Siapkan Sonicator Anda: Siapkan sonikator tipe probe Anda dengan parameter pra-pengaturan sonikasi seperti amplitudo, waktu, energi, dan suhu. Benamkan probe ultrasonik ke dalam suspensi sel.
5. Sonikasi: Mulai prosedur sonikasi. Osilasi cepat dari ujung probe menghasilkan gelembung kavitasi dalam cairan. Gelembung-gelembung ini mengembang dan runtuh karena gelombang ultrasonik, menciptakan kekuatan mekanik dan microstreaming dalam suspensi.
6. Sonoporasi: Kekuatan mekanik dan microstreaming yang dihasilkan oleh kavitasi menciptakan pori-pori sementara dan lubang di membran sel tumbuhan. Materi genetik yang ada dalam suspensi dapat memasuki sel tumbuhan melalui pori-pori ini.
7. Inkubasi: Setelah perawatan sonoporasi, inkubasi sel-sel tanaman untuk memungkinkan mereka memulihkan dan menstabilkan membran mereka. Ini adalah langkah penting untuk memastikan kelangsungan hidup sel dan transfer gen yang sukses.

Transfer Gen Melalui Agrobacterium atau Liposom

Ada dua bentuk umum untuk transfeksi sel tumbuhan. Mereka menggunakan agrobacterium, genus bakteri Gram-negatif, atau liposom sebagai pembawa materi genetik.

• Sonoporasi yang Dimediasi Agrobacterium: Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri yang biasa digunakan dalam rekayasa genetika tanaman. Dalam metode ini, DNA plasmid yang mengandung gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam Agrobacterium, yang kemudian dicampur dengan sel tanaman. Suspensi sel dikenakan sonoporasi menggunakan sonikator tipe probe. Energi ultrasonik meningkatkan transfer materi genetik dari Agrobacterium ke sel-sel tanaman. Metode ini banyak digunakan untuk modifikasi genetik tanaman.
• Sonoporasi yang Dimediasi Liposom: Liposom adalah vesikel berbasis lipid yang dapat membawa materi genetik. Dalam metode ini, liposom sarat dengan DNA plasmid atau asam nukleat lainnya dicampur dengan sel tumbuhan. Sonoporasi menggunakan probe-type sonicator digunakan untuk memfasilitasi penyerapan liposom oleh sel tumbuhan. Ultrasonografi mengganggu lapisan ganda lipid liposom, melepaskan materi genetik ke dalam sel tumbuhan. Pendekatan ini berguna untuk studi ekspresi gen sementara dalam sel tumbuhan.

Manfaat Terbukti Secara Ilmiah dari Transformasi yang Dimediasi Agrobakteri Yang Dibantu Sonikasi (SAAT)

Sonication-Assisted Agrobacterium-Mediated Transformation (SAAT) telah diterapkan pada berbagai spesies tanaman. Perawatan ultrasonik yang pendek dan relatif ringan dari kultur sel tanaman menyebabkan sonoporation, yang kemudian memungkinkan penetrasi mendalam Agrobacterium sebagai transporter gen. Di bawah ini Anda dapat membaca studi teladan yang menunjukkan efek menguntungkan dari SAAT.

Ultrasonically-Dibantu Transformasi Ashwagandha

Untuk meningkatkan efisiensi transformasi pada W. somnifera (dikenal sebagai ashwagandha atau ceri musim dingin), Dehdashti dan rekan-rekannya (2016) menyelidiki penggunaan acetosyringone (AS) dan sonikasi.
Acetosyringone (AS) ditambahkan dalam tiga tahap: kultur cair Agrobacterium, infeksi Agrobacterium dan kultur bersama eksplan dengan Agrobacterium. Penambahan 75 μM AS ke kultur cair Agrobacterium ditemukan optimal untuk induksi gen vir.
Aplikasi tambahan sonikasi (SAAT) menghasilkan ekspresi gen tertinggi. Ekspresi gen gusA pada akar berbulu ditemukan menjadi yang terbaik ketika daun dan ujung pucuk disonikasi masing-masing selama 10 dan 20-an. Efisiensi transformasi protokol yang ditingkatkan masing-masing tercatat 66,5 dan 59,5% dalam kasus eksplan daun dan ujung pucuk. Jika dibandingkan dengan protokol lain, efisiensi transformasi protokol yang sudah lebih baik ini ditemukan 2,5 kali lipat lebih tinggi untuk daun dan 3,7 kali lipat lebih banyak untuk ujung bidikan. Analisis blot selatan mengkonfirmasi 1-2 salinan transgene gusA di baris W1-W4, sementara 1-4 salinan transgen terdeteksi di baris W5 yang dihasilkan oleh protokol yang ditingkatkan.

Pengaruh durasi transformasi yang dimediasi Agrobacterium yang dibantu sonikasi (SAAT) terhadap frekuensi transformasi daun W. somnifera (a) dan ujung pucuk (b) eksplan
(studi dan grafis: © Dehdashti et al., 2016)

Ultrasonically-Dibantu Transformasi Kapas

Hussain et al. (2007) menunjukkan efek menguntungkan dari transformasi kapas yang dibantu sonikasi. Kavitasi akustik yang disebabkan oleh ultrasound frekuensi rendah menciptakan luka mikro pada dan di bawah permukaan jaringan tanaman (sonoporation) dan memungkinkan Agrobacterium untuk melakukan perjalanan lebih dalam dan sepenuhnya ke seluruh jaringan tanaman. Cara melukai ini meningkatkan kemungkinan menginfeksi sel-sel tanaman yang tergeletak lebih dalam di jaringan. Untuk mengevaluasi efisiensi transformasi SAAT, ekspresi gen GUS diukur. Sistem reporter GUS adalah sistem gen reporter, terutama berguna dalam biologi molekuler tumbuhan dan mikrobiologi. Menyesuaikan berbagai parameter SAAT, ekspresi sementara GUS dalam kapas menggunakan embrio dewasa sebagai eksplan meningkat secara signifikan. GUS pertama kali terdeteksi 24 jam setelah inkubasi eksplan dan pada 48 jam, ekspresi GUS sangat intens yang berfungsi sebagai indikator yang berguna keberhasilan transformasi eksplan kapas setelah sonikasi dibantu Agrobacterium dimediasi transformasi (SAAT). Perbandingan berbagai teknik transformasi (yaitu biolistik, Agro, BAAT, SAAT), transformasi yang dimediasi Agrobacterium yang dibantu sonikasi (SAAT) sejauh ini menunjukkan hasil transformasi terbaik.

Pilihan prosedur transformasi berdasarkan ekspresi sementara GUS. Transformasi yang dimediasi Agrobacterium yang dibantu sonikasi (SAAT) menunjukkan ekspresi sementara yang jauh lebih tinggi.
(studi dan grafik: © Hussain et al., 2007)

Solusi Ultrasonik Berkinerja Tinggi untuk Sonoporation dan SAAT

Hielscher Ultrasonics sudah lama berpengalaman dalam pengembangan dan pembuatan ultrasonicators berkinerja tinggi untuk laboratorium, fasilitas penelitian serta produksi industri dengan throughput yang sangat tinggi. Untuk mikrobiologi dan ilmu kehidupan, Hielscher menawarkan berbagai solusi untuk mengakomodasi berbagai persyaratan yang diperlukan untuk jaringan tertentu dan perawatannya. Untuk ultrasonikasi simultan dari banyak sampel Hielscher menawarkan UIP400MTP untuk pelat multiwell, VialTweeter untuk sonikasi hingga 10 botol (misalnya, tabung Eppendorf) atau CupHorn ultrasonik. Ultrasonicators tipe probe tersedia dari 50 hingga 400 watt sebagai homogenizer lab, sementara sistem industri mencakup rentang daya dari 500 watt hingga 16kW.
Silakan hubungi kami dan beri tahu kami tentang aplikasi dan persyaratan proses Anda. Staf kami yang berpengalaman akan dengan senang hati merekomendasikan ultrasonicator yang paling cocok untuk proses biologis Anda.
Tabel di bawah ini memberi Anda indikasi perkiraan kapasitas pemrosesan ultrasonikator kami: