Բարձր մաքրության շիզոֆիլան բետա-գլյուկանների ուլտրաձայնային արտադրություն

Շիզոֆիլանը իմունամոդուլացնող հատկություններով սնկային β-գլյուկան է։ Բարձր դեղաբանական ակտիվություն ապահովելու համար շիզոֆիլանը պետք է ունենա ցածր մոլեկուլային զանգված՝ բարելավված կենսամատչելիություն դրսևորելու նպատակով։ Ապացուցված է, որ ուլտրաձայնային մշակումը նվազեցնում է շիզոֆիլանի մոլեկուլային զանգվածը։ Որպես հուսալի և արդյունավետ մեթոդ՝ ուլտրաձայնային մշակումը կարող է հեշտությամբ կիրառվել ցածր մոլեկուլային զանգվածով շիզոֆիլանի արտադրության համար։

Schizophyllum սնկեր և բետա-գլյուկանի ուլտրաձայնային արդյունահանում

Schizophyllum ցեղի սնկերի տեսակները բնության մեջ աճում են քայքայվող ծառերի վրա՝ անձրևային սեզոններից հետո։ Պտղամարմինները հավաքվում են հաջորդող չոր սեզոնին։ Schizophyllum ցեղի տեսակները հարուստ են կենսաքիմիական միացություններով, օրինակ՝ գլյուկաններով, ուստի հատկապես արևադարձային երկրներում օգտագործվում են որպես սնունդ և դեղամիջոց։ Իր իմունամոդուլացնող, հակասնկային, հակաուռուցքային և հակավիրուսային հատկությունների շնորհիվ Schizophyllum commune տեսակը, որը հայտնի է նաև որպես ճեղքաթիթեղ սունկ, գրավել է կենսատեխնոլոգիական և դեղագործական ընկերությունների ուշադրությունը։
Շիզոֆիլան պոլիսախարիդը, որը հայտնի է նաև sizofiran, sonifilan կամ sizofilan անվանումներով, Schizophyllum ցեղի սնկերում հայտնաբերվող հիմնական β-գլյուկանն է. այդ սնկերը խիստ արդյունավետ կենսաակտիվ β-գլյուկանի՝ շիզոֆիլանի աղբյուր են։
Schizophyllum commune տեսակի սնկերը բնության մեջ աճում են ծառերի վրա, իսկ միցելիումը կարող է աճեցվել նաև ֆերմենտացման արգանակում։ Դեղագործական և կոսմետիկ կիրառությունների համար ցածր մոլեկուլային զանգվածով շիզոֆիլանը շատ ավելի արդյունավետ է, քան բարձր մոլեկուլային զանգվածով շիզոֆիլանը։ Դա պայմանավորված է նրանով, որ ցածր մոլեկուլային զանգվածով շիզոֆիլանը դրսևորում է զգալիորեն ավելի լավ կենսամատչելիություն և ներծծման ավելի բարձր արագություն։ Բացի այդ, բարձր մոլեկուլային զանգվածով շիզոֆիլանի կիրառությունը հաճախ խնդրահարույց է, քանի որ դրա ջրային լուծույթներն ունեն բարձր մածուցիկություն։
Չափերի ուլտրաձայնային փոքրացումը շիզոֆիլանի մոլեկուլային զանգվածը նվազեցնելու խիստ արդյունավետ և հուսալի տեխնիկա է, որը դրանով բարձրացնում է β-գլյուկանի մոլեկուլի որակը։

Ցածր մոլեկուլային զանգվածով շիզոֆիլանի արտադրության արձանագրություն

Քանի որ մոլեկուլային զանգվածով շիզոֆիլանը դրսևորում է կտրուկ ավելի լավ կենսամատչելիություն և կիրառական հատկություններ, Smirnou հետազոտական խումբն ուսումնասիրել է ուլտրաձայնային մշակումը՝ շիզոֆիլան β-գլյուկանի մոլեկուլը ճեղքելու և դրա չափերը փոքրացնելու համար։

Շիզոֆիլանի ուլտրաձայնային մշակում

Շիզոֆիլան β-1.3(1.6)-գլյուկանը (SPG) արտադրվել է կենսառեակտորում S. commune սնկի խորքային աճեցմամբ՝ որպես սուբստրատ օգտագործելով սախարոզ։
Աճեցման ավարտից հետո կուլտուրալ արգանակը նոսրացվել է հանքազերծված ջրով՝ շիզոֆիլանի կոնցենտրացիան հասցնելով 2 g/L, և ենթարկվել է ուլտրաձայնային մշակման՝ կիրառելով UIP2000hdT ուլտրաձայնային պրոցեսորը (Hielscher Ultrasonics GmbH, Գերմանիա)՝ վերաշրջանառության ռեժիմում, հետևյալ պարամետրերով և պայմաններում. միջավայրի հոսքի ծավալային արագություն՝ 50 mL/s, հաճախականություն՝ 20 kHz, ելքային հզորություն՝ 2000 W, սոնոտրոդի տեսակ՝ BS2d22, ամպլիտուդի ուժեղացուցիչի տեսակ՝ B2-1.4 և ամպլիտուդ՝ 100%։ Ուլտրաձայնային մշակման սկզբում կուլտուրալ արգանակի ջերմաստիճանը 25°C էր։ Ուլտրաձայնով մշակված կուլտուրալ արգանակը (տեսակարար էներգիայի ներմուծում՝ 100 Ws/mL) զտվել է Seitz HS800 խորքային զտիչով՝ 1,5 bar ճնշման տակ, 40°C ջերմաստիճանում։ Քիմիական բնութագրման համար ուլտրաձայնով մշակված շիզոֆիլանը (uSPG) նստեցվել է զտվածքից՝ լաբորատոր ջերմաստիճանում իզոպրոպիլային սպիրտի եռապատիկ քանակով, և չորացվել 60°C ջերմաստիճանում՝ 12h տևողությամբ։ Իմունաբանական հետազոտությունների համար uSPG պարունակող լուծույթները պատրաստվել են հետևյալ կերպ. (1) ուլտրաձայնով մշակված կուլտուրալ արգանակի զտվածքը դիաֆիլտրվել է 0,1m2 մակերեսով Pall Centramate T-series PES կասետով (մոլեկուլային զանգվածի սահմանային շեմ՝ 100 kDa)՝ 0,8 bar ճնշման տակ, և դիաֆիլտրումը շարունակվել է մինչև պահված խտանյութի էլեկտրահաղորդականությունը հասել է 20 μS/cm. (2) լուծույթը խտացվել է դիաֆիլտրմամբ՝ uSPG պարունակությունը հասցնելով 1 g/L կոնցենտրացիայի, և մանրէազերծվել ավտոկլավում՝ 120°C/20 min պայմաններում։ Դենատուրացված uSPG պատրաստվել է նման եղանակով՝ այն տարբերությամբ, որ կուլտուրալ արգանակի զտվածքին ավելացվել է NaOH՝ 0,2 M կոնցենտրացիայով, իսկ հիմնայնացված լուծույթը դիաֆիլտրումից առաջ ինկուբացվել է 30 min՝ լաբորատոր ջերմաստիճանում։

Վերլուծական մեթոդներ

Միցելիումի ելքը գնահատվել է գրավիմետրիկ եղանակով․ կուլտուրային արգանակը նոսրացվել է ջրով՝ 1:4 հարաբերակցությամբ, ցենտրիֆուգվել 10 000 × g արագացմամբ՝ 25°C ջերմաստիճանում, 20 min տևողությամբ, նստվածքը լվացվել է եռապատիկ քանակությամբ ջրով, չորացվել 60°C ջերմաստիճանում և կշռվել։ Շիզոֆիլանը վերնստվածքային հեղուկից նստեցվել է եռապատիկ քանակությամբ իզոպրոպիլային սպիրտով, չորացվել 60°C ջերմաստիճանում՝ 24h տևողությամբ, իսկ դրա ելքը որոշվել է գրավիմետրիկ եղանակով։ Կուլտուրային արգանակում pO2 ցուցանիշը չափվել է Hamilton-Visiferm DO 120 օպտիկական զոնդով (Hamilton, Շվեյցարիա)։
Կուլտուրային արգանակի դինամիկ մածուցիկությունը չափվել է HAAKE Visco Tester 6L սարքով՝ 1L և 2L իլիկներով, 4°C ջերմաստիճանում և 30 rpm պտտման արագությամբ։ Ֆիլտրման արագությունը հաշվարկվել է՝ ըստ 500 mL կուլտուրային արգանակը 200 × 200 mm չափերով Seitz HS800 խորքային ֆիլտրով (Pall, ԱՄՆ) 1,5 bar ճնշման և 40°C ջերմաստիճանի պայմաններում ֆիլտրելու ժամանակի։
uSPG մոլեկուլային զանգվածը չափվել է SEC-MALLS մեթոդով՝ Alliance (Waters) HPLC համակարգով, հաջորդաբար միացված PL aquagel OH60 և PL aquagel OH40 սյունակներով, իսկ miniDAWN TREOS (Wyatt) դետեկտորը խտացվել է դիաֆիլտրմամբ՝ մինչև uSPG կոնցենտրացիան հասել է 1 g/L, և մանրէազերծվել ավտոկլավացմամբ՝ 120°C/20 min պայմաններում։ Բնափոխված uSPG պատրաստվել է նմանատիպ եղանակով՝ այն տարբերությամբ, որ կուլտուրային արգանակի ֆիլտրատին ավելացվել է NaOH՝ 0,2 M կոնցենտրացիայով, իսկ հիմնայնացված լուծույթը դիաֆիլտրումից առաջ ինկուբացվել է 30 min՝ լաբորատոր ջերմաստիճանում։

Արդյունքներ․
Ուլտրաձայնային մշակումն ուղղակիորեն կիրառվել է միցելիում պարունակող S. commune 144-h կուլտուրային արգանակի նկատմամբ՝ SPG հետագա մշակումը հեշտացնելու համար։
 
Ուլտրաձայնով մշակված շիզոֆիլանի բնութագրերը․ Ուլտրաձայնով մշակված շիզոֆիլանը (uSPG) կուլտուրային արգանակի ֆիլտրատից նստեցվել է սպիրտով և բնութագրվել։ SEC-MALLS մեթոդով uSPG մոլեկուլային զանգվածը՝ Mw, գնահատվել է մոտ 1 MDa։ Հեղուկային ֆերմենտացմամբ ստացված շիզոֆիլանի միջին մոլեկուլային զանգվածը մոտավորապես 5 MDa է, մինչդեռ պինդֆազային աճեցման դեպքում այն կարող է հասնել մինչև 10 MDa։ Ուլտրաձայնով մշակված շիզոֆիլանի մոլեկուլային զանգվածը նատիվ, չմշակված շիզոֆիլանի մոլեկուլային զանգվածների հետ համեմատելիս կարելի է նկատել, որ ուլտրաձայնային մշակման շնորհիվ մոլեկուլային զանգվածը նվազել է 5–10 անգամ։
Ուլտրաձայնով մշակված uSPG պոլիսախարիդը պարունակել է 0,7%w/w սպիտակուց և շիկացումից հետո՝ 1,0%w/w մնացորդ։ uSPG հիդրոլիզատը ավելի քան 99%-ով կազմված էր գլյուկոզից։ Վերլուծական արդյունքները ցույց են տալիս, որ ուլտրաձայնային մշակումը պատահական հատվածներում ճեղքում է β-գլյուկանի հիմնական շղթան, իսկ կողային ճյուղերը մնում են անվնաս՝ այդպիսով նվազեցնելով շիզոֆիլանի չափը և մոլեկուլային զանգվածը։ Ըստ էության սպիտակուցից և էնդոտոքսինից զերծ uSPG նմուշների իմունաբանական հետազոտությունները ցույց են տվել, որ ուլտրաձայնով մշակված, ցածր Mw ունեցող շիզոֆիլանն ունի արտահայտված իմունամոդուլացնող ակտիվություն։

 
Նվազած մածուցիկություն․ Ուլտրաձայնային մշակման արդյունքում կուլտուրային արգանակի մածուցիկությունը զգալիորեն նվազել է։ Ուլտրաձայնային մշակման ընթացքում կուլտուրային արգանակի մածուցիկությունը փոխվել է ոչ գծային կերպով․ մշակման սկզբում մածուցիկության նվազումն արագ էր, սակայն հետագայում այն դանդաղել է։ 100 Ws/mL տեսակարար էներգիայի ներմուծումը բավարար էր կուլտուրային արգանակի մածուցիկությունը գրեթե 7 անգամ նվազեցնելու համար։

Բարելավված ֆիլտրում․ Ուլտրաձայնով մշակված կուլտուրային արգանակը ֆիլտրի միջով անցնում էր ավելի արագ, քան բարձրամոլեկուլային SPG պարունակող չմշակված կուլտուրային արգանակը (մուտքագրված տեսակարար էներգիա՝ 0 Ws/mL)։ Բացի այդ, ուլտրաձայնային մշակումը զգալիորեն նվազեցրեց ֆիլտրման ընթացքում արտադրանքի կորուստը։ Բարձրամոլեկուլային SPG պարունակող չմշակված կուլտուրային արգանակի ֆիլտրատը (մուտքագրված տեսակարար էներգիա՝ 0 Ws/mL) պարունակում էր 0,3 ± 0,07 g/L SPG, մինչդեռ խորքային ֆիլտրումից առաջ SPG կոնցենտրացիան 2 g/L էր։ Ի տարբերություն դրա՝ 100 Ws/mL տեսակարար էներգիայով ուլտրաձայնային մշակման ենթարկված կուլտուրային արգանակի ֆիլտրատում SPG կոնցենտրացիան 2,2 ± 0,2 g/L էր, ինչը համապատասխանում է արտադրանքի գրեթե զրոյական կորստին։

Եզրակացություն՝ Իր եզրակացության մեջ հետազոտական խումբն ամփոփում է, որ ուլտրաձայնային մշակումը արդյունավետ տեխնոլոգիա է ցածր մոլեկուլային զանգվածով շիզոֆիլանի արտադրության համար, որը հետագայում կարող է օգտագործվել կոսմետիկ միջոցներում և բժշկության մեջ։ Միցելիում պարունակող ամբողջական կուլտուրային արգանակի ուլտրաձայնային մշակումը որոշակի առավելություններ է տալիս շիզոֆիլանի արտադրությանը։ Այն նվազեցնում է արտադրանքի կորուստները հետագա մշակման ընթացքում և ուլտրաֆիլտրման արդյունավետ կիրառման շնորհիվ հնարավոր է դարձնում բարձր մաքրության պոլիսախարիդի արտադրությունը։
Բացի այդ, հետազոտողները պարզել են, որ շիզոֆիլանի ուլտրաձայնային մշակումը հեշտությամբ կարելի է տեղափոխել ավելի մեծ արտադրական մասշտաբների։ Փորձնական արտադրական կայանքի UIP2000hdT ուլտրաձայնային դեզինտեգրատորի մեկ միավորը հոսքային ռեժիմով 110 s ընթացքում մշակել է 1 լիտր կուլտուրային արգանակ։ Համակարգի արտադրողականությունը կարելի է հեշտությամբ մեծացնել՝ լրացուցիչ ուլտրաձայնային սարքեր հաջորդաբար միացնելով։

 
Կարդացեք ավելին սնկերի էքստրակցիան ավելի մեծ մասշտաբների պարզ եղանակով տեղափոխելու մասին։
 

Բարձր արտադրողականությամբ ուլտրաձայնային սարքավորումներ՝ սնկային գլյուկանների մշակման համար

Պոլիսախարիդների, օրինակ՝ գլյուկանների, ինչպես նաև այլ կենսաակտիվ միացությունների, օրինակ՝ խիտինի և խիտոզանի մասնատումը կարելի է հուսալիորեն իրականացնել Hielscher բարձր արտադրողականությամբ ուլտրաձայնային սարքավորումներով։ Մեր ուլտրաձայնային սարքերը կարող են ապահովել բարձր ամպլիտուդներ, թույլ են տալիս ճշգրիտ կառավարել գործընթացի պարամետրերը և կարող են աշխատել 24/7՝ մեծ բեռնվածության տակ և պահանջկոտ պայմաններում։ Hielscher Ultrasonics սարքավորումների տեսականին հուսալիորեն բավարարում է այս պահանջները։ Բացի ուլտրաձայնային աշխատանքի գերազանց ցուցանիշներից, Hielscher ուլտրաձայնային սարքերն առանձնանում են բարձր էներգաարդյունավետությամբ, ինչը զգալի տնտեսական առավելություն է՝ հատկապես առևտրային լայնածավալ արտադրության մեջ կիրառելիս։
Hielscher ուլտրաձայնային սարքերը բարձր արտադրողականությամբ համակարգեր են, որոնք կարող են համալրվել այնպիսի օժանդակ պարագաներով, ինչպիսիք են սոնոտրոդները, ամպլիտուդի ուժեղացուցիչները, ռեակտորները կամ հոսքային բջիջները՝ ձեր գործընթացի պահանջներին լավագույնս համապատասխանելու համար։
Թվային գունավոր էկրանը, ուլտրաձայնային մշակման ցիկլերը նախապես սահմանելու հնարավորությունը, ներկառուցված SD քարտի վրա տվյալների ավտոմատ գրանցումը, դիտարկիչով հեռակառավարումը և բազմաթիվ այլ գործառույթներ ապահովում են գործընթացի կառավարման և օգտագործման հարմարավետության ամենաբարձր մակարդակը։ Ամրության և մեծ բեռնվածությանը դիմակայելու կարողության շնորհիվ Hielscher ուլտրաձայնային համակարգերը արտադրության մեջ ձեր հուսալի աշխատուժն են։
Այնպիսի β-գլյուկանների մոլեկուլային զանգվածի նվազեցումը, ինչպիսին է շիզոֆիլանը, պահանջում է հզոր ուլտրաձայն՝ նպատակային տրոհումն իրականացնելու և բարձրորակ վերջնական շիզոֆիլանային արտադրանք ստանալու համար, որը կարող է օգտագործվել դեղագործական կիրառություններում։
 
Այստեղ գտեք լրացուցիչ տեղեկություններ սնկերից β-գլյուկանների ուլտրաձայնային էքստրակցիայի մասին՝ ներառյալ քայլ առ քայլ հրահանգները։
 
Ստորև բերված աղյուսակը պատկերացում է տալիս մեր ուլտրաձայնային սարքերի մոտավոր մշակման հզորության մասին․